ƯƠ

CH

NG 2

ƯƠ

Ị

ƯỢ

CÁC PH

NG PHÁP Đ NH L

NG

Ự

Ẩ

VI SINH TH C PH M

I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP

ử ố ị ấ ơ ậ ơ ạ ể ­ Dùng đ  xác đ nh các lo i vi sinh v t  đ n bào có  ả ướ ớ c l n: n m men, t o đ n bào, bào t kích th m c

ị

ố ­  Quy  trình  cho  phép  xác  đ nh  nhanh  chóng  s   ượ l ậ ng vi sinh v t

ệ ượ ế ố ­Không phân bi t đ c t ế  bào s ng và ch t

ế ậ ạ ệ ượ t đ c các t bào vi sinh v t và h t

ể ­Không phân bi v t thậ

ậ ộ ấ ế ố ớ ạ ­H n ch  đ i v i huy n phù có m t đ  th p ề

Buồng đếm vi sinh vật

ự

ế

ằ

ồ

ế Đ m tr c ti p b ng  ế bu ng đ m Goriep

Pha loãng m u ẫ ế

ồ

ầ c n đ m sao cho trong  ỏ ủ ỗ m i ô nh  c a bu ng  ả ế đ m có kho ng 5 ­ 10  ế  bào  t

Cách đếm tế bào trong buồng đếm

Qui trình xác định số lượng tế bào vsv trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu

Quy trình:

ẫ ế ­ Pha loãng m u (5­10 t ỏ  bào/ô nh )

ế ẫ ạ ồ ­ N p m u vào bu ng đ m

ố ượ ế ế ệ ệ ớ ­ Đ m s  l ng t bào hi n di n trong 5 ô l n

ậ ộ Tính m t đ :

6 t

ậ ộ ế ế M t đ  t bào: N/ml = 0,25a x 10 bào/ml

ố ượ ộ ế a: trung bình c ng s  l ng t bào trong 5 ô

l nớ

II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

ậ ố ể ạ ị

­  Dùng  đ   xác  đ nh  các  lo i  vi  sinh  v t  s ng  trong  m uẫ

ạ ộ ị ượ ậ ở ậ ộ ấ ­ Đ  nh y cao, đ nh l ng vi sinh v t m t đ  th p

ể ị ượ ậ ướ ng các vi sinh v t kích th ỏ c nh , di

­ Có th  đ nh l đ ngộ

ẩ

ẫ

ị

ị

Chu n b  d ch pha loãng m u

ử ụ

ướ

Không s  d ng n

ể c mu i sinh lý đ

ẩ

ố ướ ấ c c t và n ự ẫ pha loãng m u th c ph m

ẫ

ị

Các dung d ch pha loãng m u

Saline peptone water (SPW)

8,5g NaCl 1,0g Peptone Nước cất vừa đủ 1 lít

• Buffered peptone water (BPW)

ướ NaCl Peptone N c c t v a đ 5g 10g ủ 1 lít

ấ ừ

ẩ

ẫ

ị

ỗ Chu n b  các chu i pha loãng m u

ẫ ỏ

ậ

pha loãng m u l ng theo dãy th p phân

ố ớ ỏ ẫ ắ Đ i v i các m u r n hay bán l ng:

ẫ ộ

ẫ ỏ ướ ươ ự ư ế ị 10g m u + 90ml dung d ch pha loãng => đ  pha  loãng 101 Các b c ti p theo t nh  pha loãng m u l ng ng t

Quy trình:

­ Pha loãng m u ẫ

(25­250 khu n ẩ

ạ l c/đĩa )

ạ ộ ổ ­ T o h p đ

ủ ế ­ Nuôi ố , đ m s

ngượ l

ấ

ẫ

ườ

C y m u vào môi tr

ng

ươ ươ ­ Ph ­ Ph ề ặ ấ ng pháp c y b  m t ổ ng pháp đ  đĩa

ươ

ổ

Ph

ng pháp đ  đĩa

ị ng đ

ườ ả ượ ả c b o qu n mát đ

• Chu n b  đĩa petri vô trùng ẩ • Môi tr ử ấ ị c chu n b  ­ h p kh  trùng và  ệ ể ề ượ t oC trong b  đi u nhi ồ ẫ ọ ộ ẩ ở  45 • Hút 1ml m u vào đĩa tr ng (ch n n ng đ  thích  ố

ườ ắ • Đ  vào đĩa đã c y 10 – 15ml môi tr ấ ng, l c

ặ ng (th ch đông đ c)

ườ ệ ộ ạ ợ h p)ợ ổ đ uề • Đ  ngu i môi tr ộ ể • Đem  ủ ở nhi t đ  thích h p

ươ

ổ

Ph

ng pháp đ  đĩa

c th  tích m u l n (1ml)

ưỡ ẫ ớ ể ầ ượ c các VSV c n dinh d ế ng ti p xúc

ượ ậ ộ ả c m t đ  VSV cao, kho ng

ượ

ượ ượ ữ ạ ng đ c nh ng VSV quá nh y

tệ

ượ ị ẩ ạ ạ ấ c hình d ng khu n l c nh t

ầ ộ Ư ể u đi m ượ ấ ­ C y đ ị ­ Xác đ nh đ ề ừ t  nhi u phía ế ­ Cho phép đ m đ ẩ ạ 150­300 khu n l c ể c đi m Nh ị ­ Không đ nh l nhi ­ Không xác đ nh đ đ nhị ­ Khó làm thu n m t dòng VSV

Phương pháp cấy bề mặt

ẩ ướ ườ ị c chu n b  trên đĩa tr c • Môi tr ng ph i đ

ả ượ ặ ể 1­2 ngày đ  khô m t ng pháp • Ph

ườ ng

ặ ằ

ươ ấ ả ề ể ở ệ ộ t đ  phòng 15­20 phút cho khô nhi

Film

­ C y 0.1 – 0,3ml vào đĩa môi tr ­ Tr i đ u trên m t b ng que trang tam giác ­ Đ   m tặ

ươ

Ph

ề ặ ấ ng pháp c y b  m t

Ư ể

ạ

c các VSV nh y nhi ạ ệ t ẩ ạ ng đ ậ ượ ạ ựơ ặ c d ng khu n l c đ c

ụ ủ ầ u đi m ượ ị ­ Đ nh l ể ­ Có th  nh n d ng đ tr ngư ễ ­ D  dàng làm thu n ch ng VSV m c tiêu

ượ Nh

ựơ

ể ế c th  tích m u nh ượ ỏ ố ượ ẩ ạ ẫ c s  l ng khu n l c

ể c đi m ỉ ấ ­ Ch  c y đ ỉ ­ Ch  cho phép đ m đ th pấ

ế ị ỗ ợ ế

ẩ ạ

Các thi

t b  h  tr  đ m khu n l c

ế ẩ ạ Bút đ m khu n l c

ế ị ỗ ợ ế

Các thi

ẩ ạ t b  h  tr  đ m khu n l c

ẩ Máy đ m khu n ế ẩ ạ Máy đ m khu n l c

ế ạ ự ộ l c t đ ng

PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

ả ế Tính k t qu :

C

N

ghayCFU

ml

CFU (

/

/

)

(cid:0) (cid:0)

(

...

)

ivdn

i

vdn 1 1

V i : ớ

ố ế

ẩ ạ

ẩ

ơ

ị

N: s  t

bào (đ n v  hình thành khu n l c) vi khu n trong

1g hay 1ml m uẫ ố

ổ

ẩ ạ

ế

ượ

(cid:0) C: T ng s  khu n l c đ m đ

c trên các đĩa petri đã

ch n ọ

ẫ ạ ộ

ấ

ứ

i đ  pha loãng th  i

ộ

ố ộ ồ ể

ỗ

ni : S  h p petri c y m u t ứ di: n ng đ  pha loãng th  i  ấ ẫ v: Th  tích m u c y vào trong m i đĩa

(cid:0) (cid:0)

Ị ƯỢ Ổ Ế Đ NH L NG T NG VI SINH HI U KHÍ TRONG

Ự Ẫ M U TH C

ẫ

10 g m u + 90 g Salin Pepton Watter

ấ ằ

ồ

Đ ng nh t b ng stomacher / 30 giây

­1

ị Dung d ch 10

Pha lõang 10­2, 10­3, 10­4,..

ấ

ế

ộ ộ

C y 1ml/petri – 3 đ  pha loãng liên  ti p – 2 petri/đ  pha lõang

ắ ề

Cho 15­20 ml PCA/petri. L c đ u

ể

ặ

Đ  đông đ c

ậ

ượ

ủ ấ

L t ng

c đĩa,

m 30

±1oC/

72±6h

ẩ ạ

Khu n l c

ọ

Ch n đĩa có 25 – 250 khu n l c

ẩ ạ 

đ mế

ổ

ế T ng VSV hi u khí/g (TPC)

N

TPC =

n1V1F1 + ….+ niViFi

ỗ ồ

ố

ổ

ộ

N: T ng KL; n: s  đĩa cho m i n ng đ

ộ

ấ

ể

V: Th  tích c y (=1) ; F: đ  pha lõang

III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC

ượ ậ ộ ấ ậ ị ­ Đ nh l ng vi sinh v t có m t đ  th p

ố ượ ặ ẩ ạ ng khu n l c ho c

ượ ươ ị ­ Đ nh l theo ph ng thông qua s  l ng pháp MPN

­ Kích th ướ ỗ ọ c l l c: 0,45 (cid:0) m ho c 0,2  ặ (cid:0) m

ườ ng dùng màng l c k  n

ỵ ướ ủ ả ọ ­ Th c, in các ô  ẩ ạ ự ọ vuông ngăn c n s  m c lan c a khu n l c

ộ ọ

ọ

B  l c và màng l c vô trùng

ươ

ọ

Ph

ng pháp màng l c

ướ ỗ ọ c l l c 0,47µm hay 0,22µm

ụ ự ọ

ườ

• Kích th • Đ ng kính và hình d ng màng l c ph  th c  ườ ạ ễ ọ ng kính ph u l c vào đ ườ ườ • Đ ng kính màng th ng là 45mm

ế ị ọ

ề

ễ

Thi

t b  l c nhi u ph u

ễ ọ

ả ượ

ọ

• Ph u l c, giá đ  màng l c ph i đ ỡ

ỗ c vô trùng sau m i

ầ ọ l n l c ậ ộ

ọ

ợ

ị

• M t đ  VSV trong d ch l c thích h p:

ị

ể ế

ọ ị

ể

ằ

ả

ẩ ạ <150 khu n l c/màng • Th  tích d ch l c trong 1 l n: 50 ­100ml ầ • N u th  tích d ch l c nh  h n thì ph i pha loãng b ng  ỏ ơ ọ ấ ướ dd pha loãng hay n

c c t vô trùng

Phương pháp lọc VSV

ươ Ph ọ ng pháp màng l c

•

ụ ể ậ ộ ộ Ư ể u đi m – Xác đ nh đ ị c m t đ  VSV c  th  trong m t

ượ ẫ ớ th  tích m u l n: 10ml, 100ml …

ể ượ • Nh ể c đi m

ệ ẫ – Không thích h p cho vi c phân tích các m u

ự ắ ợ ẩ th c ph m r n

ẩ ạ

ọ

ọ Khu n l c vsv m c trên màng l c

1A

1B

2A

2B

2C

1D

ườ

2C . Coliforms  trên môi tr

ng ID Coli agar

ườ

1C E. coli trên môi tr

ng ID Coli agar

QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VSV BẰNG PP MÀNG LỌC

Quy trình:

ử

ụ

ụ ọ ­ Kh  trùng d ng c  l c

ọ

­ L c chân không

ấ

ọ

ườ

ưỡ

­ Nuôi c y màng l c trên môi tr

ng dinh d

ng

ố ượ

ế

ẩ ạ

­ Đ m s  l

ng khu n l c trên đĩa petri

ậ ộ Tính m t đ :

A (cfu/ml)= N*d/V

ử

ể

ẫ

ẫ

ể Trong đó: V: th  tích m u th  tích m u th  (50 or 100ml)

ẩ ạ

ổ

ố

ọ

N: t ng s  khu n l c trên màng l c

ẫ

ộ                 d: đ  pha loãng m u

ọ ể  Vi khu n phát tri n trên màng l c ẩ

IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM

ỹ ậ ể ế

ổ ấ ẩ ấ ố ­ K  thu t dùng ki m tra t ng vi khu n hi u khí,  coliform, coliform phân, n m m c, n m men

ỹ ậ ễ ­ K  thu t d  thao tác

ủ ả ờ ạ ả t ki m không gian ử , b o qu n, th i h n s

ệ ế ­ Ti ụ d ng lâu

ử ấ ầ ườ ­ Không c n h p kh  trùng môi tr ng

V. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)

ố ượ

ố ượ

ộ ơ

ệ

ậ ậ ng vi sinh v t  ng vi sinh v t theo s  l ­ Đánh giá s  l ị ể ệ ấ ấ ớ có xác su t l n nh t hi n di n trong m t đ n v  th  tích  m uẫ

ị

ng pháp đ nh l ạ

ệ

ả ị ế ng d a trên k t qu  đ nh tính  ượ ặ ạ ở ộ ố ộ  m t s  đ  pha  i

ự c l p l

ượ ươ ­ Là ph ộ ủ c a m t lo t thí nghi m đ loãng khác nhau

ụ

ủ

ổ

ế ườ

ươ

­ K t qu  đ nh tính: sinh h i, đ i màu, hoá đ c c a môi  tr

ả ị ấ (cid:0) ng nuôi c y

ơ ng tính

d

ố ố

ụ

ệ

ặ ạ ở

i

ộ ỗ ộ

ộ ặ

ầ

­ Đ  chính xác ph  thu c vào s   ng nghi m l p l m i đ  pha loãng (3 ho c 5 l n)

ươ

ượ

ị

ng pháp dùng đ nh l ườ

ả ể

ọ ọ

ế

ế

­ Ph nuôi trên môi tr

ậ ọ ng m i nhóm vi sinh v t  ng ch n l c, cho k t qu  bi u ki n.

Nguyên tắc

ắ

ộ ự ươ ố

ủ

ỗ ấ ậ ề ạ c  nuôi  c y  l p  l i  nhi u

ượ ộ ố ầ ọ ự ươ ộ c ch n l a sao cho trong  ng tính và có m t i có m t s  l n d

ươ ng tính đ

ố ượ ớ c ghi nh n và so sánh v i  ị ướ ng  VSV ậ c  đoán  s   l ượ   giá  tr

  Ph ự ng  pháp  MPN  d a  trên  nguyên  t c  xác  ố ấ su t  th ng  kê  s   phân  b   VSV  trong  các  đ   pha  ẫ loãng khác nhau c a m u. M i  đ   pha  loãng  đ ượ ộ ầ ầ l n (3 – 10 l n) Các đ  pha loãng đ ộ ầ ặ ạ các l n l p l ố ầ s  l n âm tính. S  l n d ố ầ ố ả b ng  th ng  kê  trong m u.ẫ

ố • Hai h  th ng MPN ệ ố ố ­ H  th ng 9  ng ­ H  th ng 15  ng

ệ ố ệ ố ể ặ

ể ệ ặ

ư ườ ấ

ơ

S. aureus ượ ậ ộ ấ c m t đ  VSV th p

ư S  t o h i: Coliforms … S  đ i màu:  ượ ng đ ẫ ớ • Đ c đi m ữ ả ụ ậ ­ Vi sinh v t m c tiêu ph i có nh ng bi u hi n đ c  tr ng trên môi tr ng nuôi c y nh ự ạ ự ổ ị ­ Cho phép đ nh l ể trong th  tích m u l n

ệ ố

ố

H  th ng 15  ng

Hệ thống 9

ống

ỗ ườ

10ml m i tr

ng

Ị

ƯỢ

Đ NH L

Ằ NG VSV B NG PP MPN

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

ị

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

ườ

ủ

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

ẩ 1  ­  Chu n  b   các  ố ệ ng  nghi m  có  ứ ng  ch a  môi  tr ự ợ thích  h p  cho  s   ưở ng  c a  tr tăng  ượ ố ng  VSV  t đ i  ượ ị ầ c n đ nh l ng

1ml

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

10­1

1ml

ộ

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

10­2

1ml

ể

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

10­3

ấ 2 ­ C y m t  th  tích chính  ị xác dung d ch  ồ ở m u ẫ  3 n ng  ộ đ  pha loãng  ậ b c 10 liên  ti pế

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

ng ố ề   đi u

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

ệ 3  –  Đem  ủ ở ệ nghi m    ợ ki n thích h p

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

ể ứ

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

ự

ể ể ầ

4  –  Quan  sát  các  ệ bi u  hi n  ch ng  minh  s   phát  tri n  ủ c a  vsv  c n  ki m  đ nhị

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

Sự đ i ổ màu  c a ủ môi  ngườ tr

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

+

+

+

+

+

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

5

+

+

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

2 ố ậ 5  –  Ghi  nh n  s   ố ượ l ng  các  ng  ươ nghi m ệ d   ng tính ộ ừ ở t ng  đ   pha    loãng

+

1

ể ả

ậ ộ 5  –  Tra  b ng  Mac  Crady  đ   suy  ra  m t  đ   VSV

K t ế quả

5

ố

S  vsv: 70 MPN/g

Tra  b ngả

2

1

1ml

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN

5

10­1

1ml

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

Tra Bảng

10­2

2

1ml

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

10­3

1

Số vsv: 70 MPN/ml

IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)

Ph

ng

ươ pháp  MPN  (lo t 5 ạ ng)ố

Số lượng ống dương tính

Số MPN/100 ml

Số ml mẫu sử dụng 10

0,1

1

- 3 6 9

0 0 0 0 … 3 3 3 3

0 0 0 0 … 3 3 3 3

0 1 2 3 … 0 1 2 3

240 460 1100 -

ạ ố ả B ng tra MPN  (lo t 3  ng)

ạ ả ố B ng tra MPN (lo t 5  ng)

Quy trình:

ế

ẫ

ậ

ồ

ọ

ộ

­ Pha loãng m u b c 10,ch n 3 n ng đ  liên ti p

ặ

ố

ạ ố ộ ượ

ệ ẫ

ừ

ọ

ồ

ị

ườ

ấ ọ ọ ng ch n l c m t l

­ C y vào lo t  ng nghi m (9 ho c 15  ng) ch a môi  ng m u xác đ nh t

ứ ộ  3 n ng đ  đã ch n

tr

ủ

ố ố

ị

ươ

ở

­ Nuôi

, xác đ nh s   ng d

ng tính

3 nhóm

ả

ị ố

­ Tra b ng Mac Crady

tr  s  MPN (a)

ậ ộ Tính m t đ :

ố

S  MPN/100ml (MPN/1g) = a x         x d

V V

2 1

ị ố

ớ

ừ ả

V i:  a: tr  s  tra t

b ng Mac Crady

ử ụ

ể

ẫ

ườ

V1: th  tích m u s  d ng (th

ng là 1)

ể

ẫ

ả

ở ạ ố

ầ

lo t  ng đ u tiên

V2: th  tích m u theo b ng Mac Crady  (10ml)

ở ạ ố

ầ

lo t  ng đ u tiên

ộ          d: đ  pha loãng

(cid:0)

ƯƠ

Ộ Ụ

VI. PH

NG PHÁP ĐO Đ  Đ C

ƯƠ

Ộ Ụ

PH

NG PHÁP ĐO Đ  Đ C

ề

ậ

ế

ng t

ộ ụ ậ

ớ ố ượ ỷ ệ  thu n v i s  l  l ờ ộ ng. Trong m t th i gian nh t đ nh,  ng vi sinh v t trong n

bào vi  ấ ị ướ ỷ ệ    l c t

ố ế

ườ

­ Đ  đ c c a huy n phù t ủ ườ sinh v t có trong môi tr ố ượ ệ ữ m i quan h  gi a s  l ủ ớ ộ ụ tuy n tính v i đ  đ c c a môi tr

ậ ng.

ượ

ằ

ộ ng b ng máy đo đ

ụ

­ Đ nh l ậ ị ng vi sinh v t trong môi tr ở ướ  b đ c hay máy so màu

ườ c sóng 550­ 610nm.

ươ

ể

ầ

ng pháp này c n xây d ng bi u đ  t

ng

ồ ươ ậ

ự ố ượ ế

ng vi sinh v t trong  ự

ẩ ạ

ươ

ườ

ế

­ Trong ph ế ữ quan tuy n tính gi a đ  đ c và s  l ằ ng b ng ph môi tr

ộ ụ ng pháp đ m khu n l c tr c ti p

Ộ Ụ

PH

NG PHÁP ĐO Đ  Đ C

ươ

ƯƠ ế : ng pháp ti n hành

ậ ầ

ứ

ể

ề

ệ

• Ph ­ Pha loãng huy n phù ch a vi sinh v t c n ki m nghi m sao

ị

ượ

cho các dung d ch thu đ

c khi đo trên máy so màu

ở ướ  b

c

ượ

ị ố

ầ

sóng 610nm đ

c các tr  s  OD g n 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.

ươ

ố ượ

ự

ế

ế

ị

ế

­ Dùng ph

ng pháp đ m tr c ti p xác đ nh s  l

ng t

bào vi

ệ

ậ

sinh v t có trong 1ml kí hi u N/ml

ừ

ồ

ộ

ị

­ Tính giá tr  log(N/ml) cho t ng n ng đ  pha loãng, V  đ  th   ẽ ồ ị

ể

ễ

ả

ị

ị

bi u di n log(N/ml) theo các giá tr  OD. Xác đ nh kho ng

ữ

ế

ớ

tuy n tính gi a log(N/ml) v i OD.

ượ

ồ ị ươ

ế

ố

ữ

• Tính m t đậ ộ ­ T  tr  s  OD đo đ ừ ị ố

c đ i chi u trên đ  th  t

ng quan gi a

ậ ộ ế

ố ượ

ị

ế

ể  bào và OD đ  xác đ nh s  l

ng t

bào có trong

m t đ  t m u.ẫ

ớ

N/ml = 10a    v i a=log (N/ml).

ƯƠ

VII. PH

NG PHÁP ELISA

(Enzym linked immunosorbent  asay)

ươ ễ ấ ị ụ ng pháp h p th  mi n d ch dùng

ế ợ ả ứ ắ ­ ELISA (Ph ự enzyme) d a trên nguyên t c ph n  ng k t h p

ể ặ ộ ữ ế ớ  bào (kháng nguyên) v i m t kháng th  đ c

gi a t hi u.ệ

ệ ượ ế ễ ị ậ c nh n bi t qua

ư ủ ­ Tín hi u ph n  ng mi n d ch đ ả ứ ể ế ự s  ng ng t a, k t dính kháng nguyên kháng th

ữ ể ằ ặ ượ ấ ho c b ng nh ng kháng th  đã đ c đánh d u

ạ ồ ỳ ị (phát hu nh quang đ ng v  phóng x  hay enzyme)

ế Đĩa gi ng ELISA

HỆ THỐNG ELISA

Máy r aử Máy đ cọ

Ị

QUI TRÌNH Đ NH L

NG CÁC CH  TIÊU  Ẩ

Ự

Ỉ ƯỢ VI SINH TRONG TH C PH M

Ự

Ẩ

Ỉ

CÁC CH  TIÊU VI SINH TRONG TH C PH M

ế ổ 1. T ng vi sinh hi u khí

ấ ấ ổ ố 2.  T ng n m men, n m m c

ổ ố 3.  Coliform t ng s

4.  E.coli

5.  Sallmonella

6.  Staphylococcus aureus

….

7.  Bacillus aureus