Bài giảng thực hành nuôi cấy mô thực vật

Chia sẻ: Tran Lam Minh Tri | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:39

Thêm vào BST

Báo xấu

708
lượt xem 245
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại môi trường nuôi cấy vi sinh là có thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hoá chất với hàm lượng rất nhỏ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng thực hành nuôi cấy mô thực vật

MỤC LỤC Bài 1. Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật..........................................2 Bài 2. Phương pháp khử trùng mô thực vật............................................................................8 Bài 3. Khử trùng nuôi cấy chồi ngủ cúc và hạt cam............................................................12 Bài 4. Vi nhân giống dứa bằng nuôi cấy chồi ngủ..............................................................15 Bài 5. Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo ở thực vật..........................................................20 Bài 6. Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống nhân tạo....................................................................25 Bài 7. Phương pháp tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.......................................................30 Bài 8. Phương pháp vi ghép ở thực vật................................................................................34 Bài 9. Phương pháp thuần hoá cây ra vườn ươm................................................................38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................................................................... 42 THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 1
BÀI I PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC 1.1 - Nguyên tắc pha chế môi trường Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại môi trường nuôi cấy vi sinh là có thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hoá chất với hàm lượng rất nhỏ. Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc), người ta không cân hoá chất mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng nhiều loại dung dịch với độ đậm đặc từ X10 – X100, chỉ cần pha với nước cất hai lần hay nước vô khoáng khi sử dụng. Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock). Dung dịch mẹ được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Thông thường pha các dung dịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock chất sinh trưởng, và các stock cần thiết khác. 1.2 - Phân loại môi trường nuôi cấy mô thực vật Tùy theo thành phần các chất có trong môi trường, có thể phân thành 3 loại môi trường: - Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: như môi trường White, Knop. Môi trường này thích hợp vào các giai đoạn cuối của quy trình nuôi cấy mô thực vật khi chuẩn bị chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm. Môi trường nghèo chất dinh dưỡng cũng có thể sử dụng trong các sinh trắc nghiệm để kiểm tra đặc tính biến dưỡng của mô thực vật. - Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: môi trường B5, Gamborg. Loại môi trường này được sử dụng đối với một số loại cây có nhu cầu các chất dinh dưỡng trong môi trường vừa phải hoặc cũng có thể sử dụng khi nuôi cấy mô thực v ật dài ngày. - Môi trường giàu chất dinh dường: môi trường MS (Murashige – Skoog). Đây là môi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy mô đối với mọi đối tượng nuôi cấy. Môi trường MS là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây, do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng. 2 - NGUYÊN LIỆU - HOÁ CHẤT - DỤNG CỤ 2.1 - Hoá chất - Saccharose (sucrose) - Agar - NH4NO3 - KNO3 - MgSO4.7H2O - KH2PO4 THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 2
- CaCl2.5H2O - KI - Na2MoO4.2H2O - CoCl2.6H2O - H3PO3 - MnSO4.4H2O - ZnSO4.7H2O - CuSO4.5H2O - Thiamine HCl - Myo-inositol - Glycine - NAA - BA (6-Benzyl aminopurin) - Na2-Ethylen diamin tetraacetat (Na2 EDTA -Fe2(SO4)3 2.2 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số Tên dụng cụ, thiết bị STT Ghi chú lượng tính - Bình định mức: 100 ml 1 cái 10 - Bình định mức: 500 ml 2 cái 3 - Ống đong: 100 ml 3 cái 12 - Ống đong 500 ml 4 cái 3 - Đũa khuấy 5 cái 15 6 - Bình màu 200 ml cái 5 - Quả bóp cao su 7 cái 15 - Bể ổn nhiệt Dùng để pha Fe-EDTA 8 cái 1 - Cốc 100 ml 9 cái 30 - Cốc 200 ml 10 cái 15 11 - Pipett: 1 ml cái 15 12 - Pipett: 5 ml cái 15 13 - Pipett: 10 ml cái 15 - Bình định mức 250 ml 14 cái 15 - Ống nghiệm Þ 25 ống 15 100 - Bông mỡ 16 g 200 THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 3
Bảo quản các stock 17 - Bình màu: 1000 ml cái 2 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH Học sinh chia nhóm thực hành pha chế các dung dịch mẹ (stock) của môi tr ường MS (Murashige – Skoog) như sau: dung dịch mẹ khoáng đa lượng (Skoog I), dung dịch mẹ Fe – EDTA (Skoog II), dung dịch mẹ khoáng vi lượng (Skoog III), dung dịch mẹ chất điều hoà sinh trưởng 4 - THỰC HÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ (Stock) MÔI TRƯỜNG MS (Murashige – Skoog) 4.1. Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20) Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khoáng đa lượng. Dùng ống đong, đong khoảng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml. Cho lần lượt các muối đa lượng vào theo trình tự nhất định sau: Nồng độ môi trường Nồng độ dung dịch Tên hoá chất nuôi cấy (mg/lít) stock (x20) (mg/lít) - MgSO4.7H2O 370 7.400 - KH2PO4 170 3.400 - KNO3 1.900 38.000 - NH4NO3 1.650 33.000 - CaCl2.2H2O 440 8.800 Mỗi lần cho một loại khoáng vào phải khuấy tan hoàn toàn và bổ sung thêm 100 ml nước cất hai lần trước khi bổ sung các khoáng khác vào (phương pháp pha thể tích tăng dần). Do CaCl2.2H2O có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO4.7H2O nên hai chất này phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự ở trên, cho CaCl2.2H2O vào sau cùng. Cho tất cả vào bình định, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng 1000 ml. Như vậy ta có 1000 ml dung dịch mẹ khoáng đa lượng đậm đặc 20 l ần. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10 oC, dùng 50 ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy. 4.2. Pha stock khoáng vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần (x1000) Do hàm lượng một số loại khoáng vi lượng trong stock khoáng vi lượng rất nhỏ, khó có thể cân đong chính xác như một số các khoáng vi lượng khác. Vì vậy ở đây, ta phải tiến hành pha riêng dung dịch các khoáng này (CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O) có nồng độ đậm đặc hơn 100 lần so với dung dịch mẹ và gọi là dung dịch “bà ngoại”. Sau khi pha song các dung dịch “bà ngoại”, tiến hành pha 100 ml stock khoáng vi lượng X1000 tương tự như ở phần trên. Thành phần các khoáng như sau: Nồng độ môi Nồng độ dung Nồng độ dung dịch Tên hoá chất trường nuôi cấy dịch stock (x1000) “bà ngoại “(x100) (mg/lít) (mg/lít) (mg/lít) H3PO3 6,2 6200 MnSO4.4H2O 22,3 22300 THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 4
ZnSO4.4H2O 8,6 8600 Na2MoO4.2H2O 0,25 250 KI 0,83 830 CuSO4.5H2O 0,025 25 2500 CoCl2.6H2O 0,025 25 2500 4.3. Pha dung dịch mẹ Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 200 lần (x200) Sắt là yếu tố rất cần thiết cho thực vật. Tuy nhiên, nhu cầu của thực vật đối với sắt rất nhỏ và lượng liên tục. Vì vậy, để cung cấp đủ lượng sắt cho thực vật ta thường dùng sắt dưới dạng hợp chất Fe-DETA. Hợp chất Fe-EDTA được hình thành do sự ngậm Fe của EDTA dưới tác dụng của nhiệt độ. Ở dưới dạng hợp chất này, sắt sẽ được phóng thích ra môi trường tuỳ theo nhu cầu của thực vật. Phương pháp pha như sau: Nồng độ môi trường Nồng độ dung dịch stock Tên hoá chất nuôi cấy (mg/lít) (x200) (mg/lít) FeSO4.7H2O 27,8 5560 Na2 EDTA 37,3 7460 Chuẩn bị hai becher 500 và 1000 ml. Cho vào mỗi becher 400 ml nước cất hai lần. Đun nóng hai becher trong bể ổn nhiệt khoảng 80 oC. Cân chính xác 5,56 g FeSO4.7H2O cho vào becher 500 ml có 400 ml nước trên, khuấy tan hoàn toàn. Cân chính xác 7,46 g Na2 EDTA cho vào becher 1000 ml trên, khuấy tan hoàn toàn. Cho từ từ dung dịch FeSO4.7H2O vào dung dịch Na2 EDTA, vừa đổ vừa khuấy đều. Cuối cùng bổ sung nước cho đủ 1000 ml. Như vậy, ta có 1000 ml dung dịch stock Fe-EDTA đậm đặc 200 lần có màu vàng nhạt, trong suốt. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10oC, dùng 5ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy. 4.4. Pha stock hormon Các hormon khác nhau sẽ tan trong các dung môi khác nhau. IAA, NAA, BA pha trong NaOH 1N (thêm 2-3 ml NaOH 1N và lắc cho đến khi tan hết, sau đó thêm nước đến thể tích cần). GA3, 2,4-D pha trong cồn 50o cho đủ thể tích. Để pha các chất sinh trưởng, có hai cách khác nhau: + Cách 1: pha theo hệ mol Ví dụ: Pha 100 ml dung dịch stock IAA (M=176,19) có nồng độ 1 mmol (milimol) từ IAA tinh khiết. 176,19 g IAA pha trong 1000 ml nước →1000 ml dung dịch có nồng độ 1 mol/lít. Để pha dung dịch có nồng độ 1 mmol/lít cần 0,17619 g IAA. Như vậy, muốn có 100 ml dung dịch IAA nồng độ 1 mmol/lít cần 0,017619 g IAA. (MNAA: 186,2; M 2,4-D: 221,04; MBA: 225,2) + Cách 2: pha theo hệ mg/lít: làm tương tự như cách pha khoáng. Các dung dịch stock hormon sau khi pha song được bảo quản trong các chai màu ở nhiệt độ lạnh 4-10oC. 4.5. Pha stock vitamin môi trường MS nồng độ đậm đặc 500 lần (x500) THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 5
Dùng ống đong, đong 50 ml nước cất hai lần vào một becher 100 ml. Bổ sung các vitamin vào theo trình tự sau: Nồng độ môi trường Nồng độ dung dịch stock Tên hoá chất nuôi cấy (mg/lít) (x500) (mg/lít) Acid nicotinic 0,5 250 Thiamin HCl 0,1 50 Pyridoxin HCl 0,5 250 Myo-inositol 100 50.000 Glycine 2 1.000 Cho tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất bổ sung cho đ ủ 100 ml. Như vậy, ta có 100 ml stock vitamin MS x500. Dung dịch này được bảo quả đ ể dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ dưới 0oC, dùng 2ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy. 4.6. Pha môi trường làm việc (môi trường nuôi cấy) Pha 1 lít môi trường MS cơ bản: - Dùng ống đong, đong 500 ml nước cất hai lần vào becher. - Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hoàn toàn - Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều. - Bổ sung 1 ml dung dịch stock vi lượng x1000, khuấy đều. - Bổ sung 5 ml dung dịch stock Fe-EDTA x200, khuấy đều. - Bổ sung 2 ml dung dịch stock vitamin x500. - Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục đích nuôi cấy. - Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ 1000 ml - Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về pH=5,8. - Bổ sung 6-8 g agar. - Đun sôi cho tan agar, quấy đều. Chia hỗn hợp môi trường vào các bình nuôi cấy, cần chia xong trước khi dung dịch môi trường MS nguội xuống 50 oC. Hấp khử trùng (đối với các thành phần bị biến tính ở nhiệt độ cao sẽ được lọc vô trùng và bổ sung vào môi trường sau khi hấp). Môi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25oC. 5 - BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Trình bày cách pha Skoog I, Skoog II và Skoog III. 2. Quan sát hiện tượng phản ứng khi pha stock Fe-EDTA. Giải thích. 3. Từ BA tinh khiết, trình bày cách pha 100 ml stock BA có nồng độ 100 mol/lít. Biết MBA =225,2. 4. Cần bao nhiêu ml dung dịch stock IAA có nồng độ 150 µmol/lít để pha môi trường làm việc có nồng độ IAA là 0,1 µmol/lít. THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 6
BÀI 2 PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MÔ THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC Một thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật khác với một thí nghiệm nuôi cấy vi sinh thường tiến hành trong một thời gian rất lâu dài. Với một thí nghiệm trường diễn như thế, chỉ cần một tế bào vi khuẩn, một bào tử nấm mốc rơi vào môi trường nuôi cấy, sau một thời gian ngắn sẽ sinh sôi làm hỏng môi trường, làm hỏng thí nghiệm và phải tiến hành làm lại từ đầu. Do đó việc vô trùng tức loại bỏ hết nấm khuẩn trong nuôi cấy mô thực vật vô cùng quan trọng. Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ… tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Để chuyển mô thực vật t ừ môi trường tự nhiên vào môi trường nuôi cấy in vitro, mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để loại bỏ hết các mầm vi sinh vật. Tuy nhiên quá trình này phải đảm bảo là mô thực vật còn sống, có khả năng tăng trưởng, phát triển tốt. Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy. Đ ể tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta lắc mô cấy với cồn 70%, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Bảng 1. Một số tác nhân khử trùng dùng cho thực vật Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Tác nhân vô trùng Rất tốt Canxi hypoclorid 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Natri hypoclorid 2 5 – 30 Tốt Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Nước Brom Rất tốt 1–2 2 – 10 HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh Khá tốt 4 – 50 30 – 60 Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý song, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trứơc khi đặt mô cấy lên mô trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường. THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 7
Như vậy, để có thể đạt được mục đích khử trùng (loại bỏ hết mầm vi sinh vật, mô thực vật có thể tăng trưởng, phát triển), thì việc khử trùng là phải tìm ra được ba yếu tố liên quan chặt chẽ với nhau và liên quan tới mô thực vật đem khử trùng đó là: - Chất khử trùng - Nồng độ chất khử trùng - Thời gian khử trùng. Vô trùng mẫu là một thao tác khó, ít khi thành công ngay l ần đ ầu tiên. Tuy v ậy, nếu kiên trì tìm nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả. 2 - VẬT LIỆU - HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu - Cây Trầu bà - Hạt thuốc lá 2.2 - Hoá chất - Xà phòng bột - Cồn 70o, 90o - Javel - Ca(OCl)2 (Caxi hypoclorid) 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số Tên dụng cụ, thiết bị STT Ghi chú lượng tính - Dao mổ 1 cái 15 - Lưỡi dao mổ Dùng lưỡi dao mổ nhọn 2 cái 15 - Ống đong: 100 ml 3 cái 12 - Ống đong 500 ml 4 cái 3 - Đũa khuấy 5 cái 15 - Cốc 500 ml 6 cái 15 - Quả bóp cao su 7 cái 15 - Cốc 1000 ml 8 cái 5 - Cốc 100 ml 9 cái 30 - Cốc 200 ml 10 cái 15 11 - Pipett: 1 ml cái 5 12 - Pipett: 5 ml cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 8
Đơn vị Số Tên dụng cụ, thiết bị STT Ghi chú lượng tính - Kẹp dài 25 cm 15 Cái 15 - Bông mỡ 16 g 200 - Ống nghiệm Þ25 17 cái 15 Tủ cấy có quạt thổi vô - Tủ cấy vô trùng 18 cái 1 trùng 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH Học sinh thực hành khử trùng đốt thân cây Trầu bà, hạt thuốc lá. Sau khi vô trùng tiến hành gieo hạt thuốc lá, cấy đốt thân cây Trầu bà lên môi trường MS. 4 - THỰC HÀNH 4.1 - Khử trùng cây Trầu bà a. Thực hiện trong phòng thí nghiệm - Cây Trầu bà được cắt thành những đoạn nhỏ 30cm. Rửa các đoạn này dưới vòi nước máy cho sạch bụi đất. - Cắt thành những đoạn Trầu bà này thành những đốt khoảng 3cm, mỗi đốt mang một chồi ngủ. Cắt bỏ lá, rễ. - Rửa các đốt với nước có pha một ít xà phòng trong các erlen. - Rửa lại bằng nước máy nhiều lần cho sạch xà phòng. b. Thực hiện trong tủ cấy - Lắc các đốt thân với cồn 70o trong 1 phút - Chiết bỏ cồn. Ngâm các mẫu trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 10 phút (hay dung dịch javel được pha loãng với tỷ lệ 1:9 trong 5 phút). - Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần - Gạn bỏ nước. 4.2 - Khử trùng hạt thuốc lá - Thực hiện trong phòng thí nghiệm, rửa hạt thuốc lá dưới vòi nước máy. - Lắc hạt với nước có pha một ít xà phòng. - Rửa lại nhiều lần bằng nước máy cho sạch xà phòng - Thực hiện trong tủ cấy, lắc hạt với cồn 70o trong 1 phút. - Chiết bỏ cồn, ngâm hạt trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 5 phút. - Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần. - Gạn bỏ nước. 4.3 - Cách cấy mẫu a. Mẫu cây Trầu bà THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 9
- Trong tủ cấy vô trùng, những đốt cây Trầu bà đã khử trùng, được đặt trên giấy cấy vô trùng. Dùng dao mổ và kẹp tách các lá. - Ở mỗi nách lá có mang một mầm ngủ. Dùng dao mổ cắt một đoạn mẫu có kích thước khoảng 1x1 cm cấy vào môi trường MS đã hấp khử trùng trong các ống nghiệm. - Khi cấy mẫu cần chú ý cấy đúng chiều của thân. Các ống nghiệm đ ược đ ặt trong phòng lạnh nhiệt độ 25oC, cường độ ánh sáng 2500-3000 lux. b. Mẫu hạt thuốc lá - Hạt thuốc lá sau khi khử trùng, dùng kẹp đặt đều trên bề mặt môi tr ường MS trong các erlen. Khoảng cách giữa các hạt là 1cm. - Các erlen được đặt ở nơi tối hoàn toàn. 5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Trình bày phương pháp khử trùng đốt thân Trầu bà, hạt thuốc lá. 2. Vai trò và tác dụng của tác nhân khử trùng cồn, canxi hypoclorid. 3. Ghi nhận kết quả nuôi cấy. THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 10
BÀI 3 KHỬ TRÙNG, NUÔI CẤY CHỒI NGỦ CÚC HẠT CAM 1 - NGUYÊN TẮC Trong các phương pháp nhân giống vô tính in vitro cây trồng, bên cạnh những phương pháp đòi hỏi người làm việc phải có kỹ thuật cao như tách và nuôi cấy đ ỉnh sinh trưởng, vi ghép…, phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy chồi ngủ (chồi nách) là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và mang lại hiệu quả cao nhất. Ở đa số các loài thực vật, mỗi nách lá đều mang một chồi ngủ. Các chồi ngủ này có đặc tính hoàn toàn giống với các đỉnh sinh trưởng (là một đỉnh sinh trưởng ở trạng thái tiềm sinh), có khả năng tăng trưởng phát triển thành một cơ thể thực vật toàn vẹn. Các chồi ngủ này đa số bị ức chế sự phát triển bởi các chồi đỉnh (tính ưu thế ngọn). Nếu tách riêng một đoạn thân có mang chồi nách này ra khỏi cơ thể thực vật, d ưới tác động bởi những yếu tố kích thích sinh trưởng ngoại sinh như cytokinin, auxin thì từ một chồi nách này có thể cho ra một cụm chồi với rất nhiều chồi mới (từ hàng chục tới hàng trăm chồi). Với những chồi mới tạo thành, tiếp tục cấy chuyền sang những môi trường tạo chồi mới thì hệ số nhân giống rất đáng kể. Với những loài thực vật có đỉnh sinh trưởng nhỏ (đỉnh sinh trưởng dấu hoa thị) thì việc tách lấy đỉnh sinh trưởng rất khó thực hiện. Vì vậy, với những loại thực vật này, phương pháp nhân giống vô tính hiệu quả nhất là nuôi cấy chồi nách. Chồi nách đem nuôi cấy thường gắn liền với một đoạn thân, do đó sức sống của chồi nách thường tốt hơn rất nhiều lần so với đỉnh sinh trưởng tách rời, hiệu quả tạo cụm chồi cũng thường tốt hơn so với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Việc tách chồi nách thường thực hiện với những đoạn nhánh có mang chồi của thực vật. Những đoạn nhánh này được khử trùng trước khi cắt nhỏ thành những đoạn có mang chồi nách. Bên cạnh đó, việc tách chồi nách cũng có thể thực hiện từ những cây vô trùng trong ống nghiệm được tạo ra do việc nuôi cấy hạt giống. Trong bài thực hành này, sẽ đề cập tới phương pháp nhân giống vô tính thực vật qua nuôi cấy chồi nách và tạo nguồn cây cho phương pháp nuôi cấy chồi nách từ hạt giống. 2- VẬT LIỆU –HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu - Cây hoa cúc - Hạt cam 2.2 - Hoá chất - Cồn 70o, 90o - Môi trường MS bổ sung 2,4 – D - Xà phòng bột - Cồn 70o, 90o THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 11
- Javel - NAA - BA 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số Tên dụng cụ, thiết bị STT Ghi chú lượng tính - Dao mổ 1 cái 15 - Lưỡi dao mổ Dùng lưỡi dao mổ nhọn 2 cái 15 - Ống đong: 100 ml 3 cái 12 - Ống đong 500 ml 4 cái 3 - Đũa khuấy 5 cái 15 - Cốc 500 ml 6 cái 15 - Quả bóp cao su 7 cái 15 - Cốc 1000 ml 8 cái 5 - Cốc 100 ml 9 cái 30 - Cốc 200 ml 10 cái 15 11 - Pipett: 1 ml cái 5 12 - Pipett: 5 ml cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 - Kẹp dài 25 cm 15 Cái 15 - Bông mỡ 16 g 200 - Ống nghiệm Þ25 17 cái 15 - Giá ống nghiệm lỗ lớn 18 cái 15 - Đèn cồn 19 cái 15 Tủ cấy có quạt thổi khí - Tủ cấy vô trùng 20 cái 1 vô trùng 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH - Sinh viên tiến hành cắt đốt thân cúc, thực hiện xác định công thức khử trùng. Nuôi cấy thân cúc trên môi trường MS bổ sung. - Sinh viên tiến hành khử trùng, tách vỏ và nuôi cấy hạt cam trên môi trường MS. 4 - THỰC HÀNH 4.1 - Khử trùng và nuôi cấy thân cúc cắt đốt a. Khử trùng THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 12
- Lựa cây cúc còn tươi, non, lá ít bị dập. Dùng dao cắt bỏ hoa và gốc. Cắt lấy một đoạn cách gốc 10÷ 15 cm. - Rửa sạch đoạn thân cúc dưới vòi nước máy. - Cắt thành những đoạn nhỏ. Cắt ở giữa hai chồi ngủ. Mỗi đoạn có một chồi ngủ. - Lắc các đoạn trong nước xà phòng từ 10÷ 15 phút. - Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước máy. - Lắc với cồn 70o trong 1 phút. - Lắc với dung dịch javel/nước ở các tỷ lệ 1/9, 2/8, 3/7, 4/6, 1/1. - Rửa sạch javel bằng nước cất vô trùng 5÷ 6 lần. b. Nuôi cấy - Thân cúc sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA và NAA với tỷ lệ NAA/BA
3. Nếu để bình nuôi cấy hạt cam trong điều kiện không có ánh sáng, phôi có nảy mầm phát triển được không? Giải thích? THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 14
BÀI 4 VI NHÂN GIỐNG DỨA BẰNG NUÔI CẤY CHỒI NGỦ 1 - NGUYÊN TẮC Đối với một số cây như tre, mía, dứa, phương pháp nhân giống vẫn thường đ ược sử dụng hiện nay trong nông nghiệp là nhân giống truyền thống bằng chồi nách, chồi ngầm, thân ngầm, giâm hom… Tuy nhiên đặc điểm chung của các phương pháp này là hệ số nhân giống thấp, không đáp ứng được nhu cầu về cây giống để mở rộng sản xuất. Trước nhu cầu của việc mở rộng sản xuất, trong một số năm gần nay đ ể nhân giống dứa thường tiến hành bằng nuôi cấy chồi ngủ (phương pháp nhân cụm chồi). Ưu điểm của phương pháp này là tốc độ nhân giống cao, hệ số nhân giống lớn. Đặc điểm của phương pháp này là chồi ngủ được tách từ cụm chồi ngủ ở ngọn dứa, sau đó được nuôi cấy tạo cụm chồi trên môi trường in vitro. Các chồi có hình dạng giống như vảy cá hoặc hạt gạo nằm ép sát vào thân (lõi), có màu trắng. Mỗi chồi được tách riêng để nuôi cấy để tạo thành cụm chồi. 2 - VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu Chồi ngủ được tách từ ngọn dứa dùng làm vật liệu nuôi cấy. 2.2 - Hoá chất - Cồn 70o, 90o - Môi trường MS bổ sung NAA, BA - Javel - Xà phòng bột 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số Tên dụng cụ, thiết bị STT Ghi chú lượng tính - Dao mổ 1 cái 15 - Lưỡi dao mổ Dùng lưỡi dao mổ nhọn 2 cái 15 - Ống đong: 100 ml 3 cái 12 - Ống đong 500 ml 4 cái 3 - Đũa khuấy 5 cái 15 - Cốc 500 ml 6 cái 15 - Quả bóp cao su 7 cái 15 - Cốc 1000 ml 8 cái 5 - Cốc 100 ml 9 cái 30 THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 15
Đơn vị Số Tên dụng cụ, thiết bị STT Ghi chú lượng tính - Cốc 200 ml 10 cái 15 11 - Pipett: 1 ml cái 5 12 - Pipett: 5 ml cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 - Kẹp dài 25 cm 15 Cái 15 - Bông mỡ 16 g 200 - Ống nghiệm Þ25 17 cái 15 - Giá ống nghiệm lỗ lớn 18 cái 15 - Đèn cồn 19 cái 15 Tủ cấy có quạt thổi khí - Tủ cấy vô trùng 20 cái 1 vô trùng 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH - Học sinh tiến hành tách bỏ lá ở các ngọn dứa để thu chồi ngủ. - Các chồi ngủ được tách rời, nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA và BA. 4 - THỰC HÀNH 4.1 - Phương pháp khử trùng chồi ngủ dứa - Tách bỏ toàn bộ các lá ở phần ngọn dứa. Tách lần lượt các lá từ dưới lên trên, từ ngoài vào trong để trách làm tổn thương các chồi ngủ. - Tách rời phần cùi (lõi) có mang chồi ngủ. - Rửa nhẹ nhàng cùi dứa dưới vòi nước máy, tránh làm tổ thương các chồi ngủ. - Dùng dao cắt lấy bốn mặt của cùi dứa có mang chồi ngủ. - Lắc nhẹ nhàng các mảnh có mang chồi ngủ này trong nước xà phòng trong 10 phút. - Rửa sạch nước xà phòng dưới vòi nước máy. - Lắc các mảnh mô dứa trong cồn 700 trong 2 phút. - Khử trùng với nước javel (tỷ lệ 3:7) trong 7 phút. - Rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 5÷6 lần. THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 16
Hình 1. Cắt các mặt có mang chồi ngủ từ cùi dứa 4.2 - Phương pháp nuôi cấy - Dùng dao mổ cắt những đường dọc, ngang tách rời từng chồi ngủ muốn lấy. - Cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mô dứa có mang chồi ngủ tạo thành hình tháp. - Cắm phần đầu hình tháp ngập vào môi trường nuôi cấy. - Đặt các bình nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng 3000 lux, ở nhiệt độ 25oC. 4.3 - Phương pháp tạo cụm chồi Sau thời gian nuôi cấy từ 20-30 ngày các chồi được cấy chuyền sang môi trường nuôi cấy để tạo cụm chồi. Môi trường nuôi cấy có nồng độ chất điều hoà sinh tr ưởng NAA 1mg/lít, BA 0,1mg/lít. Sau 30-40 ngày, các chồi nhỏ xuất hiện ở phía gốc chồi. Số lượng các chồi nhỏ tăng dần lên, sắp xếp chồng chất lên nhau thành một cụm chồi (thường là sau 3-4 tháng nuôi cấy). Các chồi nhỏ được tách và chuyển sang môi trường tái sinh cây hoàn chỉnh. Điều kiện nuôi cấy để tạo cụm chồi dứa: cường độ ánh sáng 4000 lux, thời gian chiếu sáng 10-14 giờ/ngày, nhiệt độ 25-270C. Hình 2. Cách cắt rời chồi ngủ dứa 5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH 1. Trình bày những điểm cần lưu ý khi tách chồi ngủ dứa 2. Trình bày quy trình nhân giống dứa bằng chồi ngủ. 3. Tại sao phải cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mô dứa có mang chồi ngủ? THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 17
THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 18
BÀI 5 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC Trong đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt vật lý (những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do côn trùng tấn công) thực vật có khả năng hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn thương đó. Những t ế bào mới được hình thành đó là tế bào mô sẹo. Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện trong các giai đoạn hoá lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng tượng t ầng (vùng phân sinh) như tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành. Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo. Nuôi cấy tạo mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Những mô của thực vật có thể dùng nuôi cấy tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp nhục, lá, trụ bì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cho cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. A B Hình 3. Sự tái sinh chồi từ mô sẹo. A: Mô sẹo, B: Chồi tái sinh. Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ. Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây tr ưởng thành dễ t ạo mô sẹo. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo. Sự tạo mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi trường nuôi cấy được bổ sung một l ượng auxin (2,4-D) thích hợp. Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình: - Sự phản phân hoá của tế bào nhu mô: xảy ra ở các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi. THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 19
- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào bào tượng tầng của phần lớn cây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin. - Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ). 2 - VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu Hạt thuốc lá (Nicotiana tabacum) được gieo trên môi trường MS. Sử dụng các cây con làm vật liệu thí nghiệm. 2.2 - Hoá chất - Cồn 70o, 90o - Môi trường MS bổ sung 2,4 - D 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số Tên dụng cụ, thiết bị STT Ghi chú lượng tính - Dao mổ 1 cái 15 - Lưỡi dao mổ Dùng lưỡi dao mổ nhọn 2 cái 15 - Ống đong: 100 ml 3 cái 12 - Ống đong 500 ml 4 cái 3 - Đũa khuấy 5 cái 15 - Cốc 500 ml 6 cái 15 - Quả bóp cao su 7 cái 15 - Cốc 1000 ml 8 cái 5 - Cốc 100 ml 9 cái 30 - Cốc 200 ml 10 cái 15 11 - Pipett: 1 ml cái 5 12 - Pipett: 5 ml cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 - Kẹp dài 25 cm 15 Cái 15 - Bông mỡ 16 g 200 - Ống nghiệm Þ25 17 cái 15 - Giá ống nghiệm lỗ lớn 18 cái 15 - Đèn cồn 19 cái 15 Tủ cấy có quạt thổi khí - Tủ cấy vô trùng 20 cái 1 vô trùng THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 20