SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐA HÌNH ADN (PCR-
RFLP) TRÊN VÙNG INTRON 18 ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁ
THỂ MANG GEN BỆNH MÁU KHÓ ĐÔNG
HEMOPHILIA A
Lê Nhật Minh1, Lê Thị Kim Tuyến1, Võ Thị Thương
Lan2, Đỗ Trung Phấn3
1Phòng sinh học phân tử, Viện Vệ sinh dịch tễ TW.
2Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
3Viện Huyết học và truyền máu TW
Tóm tắt: 9 bà mẹ của 9 bệnh nhân nam mắc bệnh
Hemophilia A (trong đó có trường hợp một mẹ và hai con
trai mang bệnh) được phân tích tính đa hình ADN của vùng
Intron 18 trên gen mã cho yếu tố VIII bằng enzym giới hạn
Bcl I. Kết quả phân tích cho thấy 4/9 bà mẹ (44.44%) mang
cặp alen dị hợp tử XhX về bệnh máu khó đông và truyền
bệnh cho con trai mình tạo thành dạng XhY gây bệnh.
MỞ ĐẦU
Bệnh ưa chẩy máu hay còn gọi là Hemophilia là một bệnh
di truyền gen lặn, liên kết nhiễm sắc thể giới tính X thường
gặp ở nước ta. Bệnh Hemophilia là do thiếu các yếu tố
đông máu tham gia vào quá trình đông máu như yếu tố VIII
- hemophilia A hoặc yếu tố IX - hemophilia B [1,2]. Tỉ lệ
mắc bệnh ở các nước khác nhau, trung bình 1/10.000 dân.
Nước ta, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu
TW có khoảng 5000 bệnh nhân Hemophilia. Trong số bệnh
nhân mắc bệnh máu khó đông thì bệnh Hemophilia A là
phổ biến hơn cả, chiếm khoảng 85%.Trên thế giới các
nghiên cứu sinh học phân tử đã chứng minh Hemophilia A
có liên quan với một số đột biến nhất định trên gen mã hoá
tổng hợp yếu tố VIII. Trong đó, đột biến ở vùng intron 18
liên quan với sự mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn Bcl
I là phổ biến nhất. Đề tài này, nghiên cứu mối liên quan của
bệnh Hemophilia A ở Việt nam với đột biến này. Trên cơ
sở đó có thể xác định được những bà mẹ mang gen dị hợp
tử XhX và chẩn đoán sớm, có thể là ngay từ giai đoạn bắt
đầu mang thai, để có những biện pháp xử lý thích ứng với
mỗi trường hợp.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng: Năm ml máu được lấy từ 9 bà mẹ và 9
bệnh nhân nam (con trai của các bà mẹ đó). Máu được
chống đông bằng EDTA 10mM.
2. Phương pháp:
a. ADN được tách từ máu theo phương pháp sử dụng nồng
độ muối cao. [ ]
b. Phản ứng PCR: một ống 50l gồm có: 5l ADN khuôn;
5l dNTPs 10mM; 1,5mM MgCl2; 0,5 U Taq; 0,8 nM mỗi
loại mồi; 5l đệm PCR. 50l mỗi ống được làm phản ứng
PCR trên máy Amp Gen 9700 với chương trình 94oC- 7’;
30 chu kỳ: 94oC - 1’; 58oC-1’’; 72oC -1’; 72oC 10 phút;
40C-20’. 40nM ADN mồi với trình tự của đôi mồi là:
8.1: 5’ TAAAAGCTTTAAATGGTCTAGGC 3’
8.2: 5’ TTCGAATTCTGAAATTATCTTGTTC 3’
c. Cắt sản phẩm PCR với enzym giới hạn: 1l BclI; 3l
đệm enzym NBE3 (New England Biolab) và 25l sản
phẩm PCR
d. Chạy điện di: sản phẩm PCR trước và sau khi cắt với
BclI được chạy điện di trên gel Polyacryamid 10%, 100V
trong 1h.
e. Phát hiện các băng ADN bằng phương pháp nhuộm bạc.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Kết quả PCR của các mẫu bệnh phẩm.
ADN tách từ các bệnh nhân Hemophilia A và các bà mẹ
được dùng trong phản ứng PCR.
Hình 1: Kết quả PCR của các mẫu bệnh phẩm M1: Thang
ADN x 174HaeIII; M2: ADN pBR322 MspI; 1-7: Sản
phẩm PCR của bệnh nhân Hemophilia A; 8 chứng dương
người bình thường.
Kết quả điện di trên Hình 1 cho thấy những mẫu bệnh
phẩm cho sản phẩm PCR là đoạn ADN trên intron 18 có độ
dài 142 bp.
2. Kết quả phân tích RFLP của intron 18 bằng emzym