Báo cáo: Phân lập và nhận dạng nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư cà phê ở Việt Nam dựa trên đặc điểm hình thái học và phương pháp phân tử

Chia sẻ: Leon Leon | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

363
lượt xem 59
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

ác Colletotrichum chi bao gồm 900 loài và chịu trách nhiệm về bệnh thán thư trên số cây trồng. Để xác định loài Colletotrichum có mặt trong trồng cà phê Việt Nam, một tổng cộng 55 Colletotrichum phân lập được phân lập từ 111 mẫu bệnh thán thư trên lá, cành cây và quả tại vườn cà phê của Ba Vì và Buôn Mê Thuột. Hai mươi tám phân lập từ cà phê bệnh berry đã được lựa chọn để xác định dựa trên đặc điểm hình thái và PCR khuếch đại của một khu vực trong tiểu đơn vị nhỏ của ty lạp thể...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo: Phân lập và nhận dạng nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư cà phê ở Việt Nam dựa trên đặc điểm hình thái học và phương pháp phân tử

PHÂN L P VÀ NH N D NG N M Colletotrichum GÂY B NH THÁN THƯ CÀ PHÊ VI T NAM D A TRÊN Đ C ĐI M HÌNH THÁI H C VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN T Nguy n Thanh Hà, Hoàng Th Ngát, Nguy n Thu Hà, Lê Th Ánh H ng và Ph m Xuân H i Summary Isolation and identification of Colletotrichum caused anthracnose disease on coffee in Vietnam based on morphological and molecular characters The genus Colletotrichum consists of 900 species and is responsible for anthracnose on number of crops. To determine which species of Colletotrichum are present in Vietnamese coffee plantation, a total of 55 Colletotrichum isolates were isolated from 111 anthracnose disease samples on leaves, twigs and berries at coffee plantation of Ba Vi and Buon Me Thuot. Twenty eight isolates from coffee berry diseases were selected for identification based on morphological characters and PCR amplification of a region in the mitochondrial small subunit (mtSSU) using NMS1/NMS2 primers. Basing on morphological and physiological studies, we classified these isolates into three groups named group 1, group 2 and group 3 corresponding to C. gloeosporioides, C. acutatum and possible C. capsici respectively. In combining with molecular analysis, we reconfirmed with group 1 and group 2 but not with group 3. The group 3 with falcate conidia was found on coffee plantation of Ba Vi. However, it was unable to identify by NMS1/NMS2 primers. Since, different techniques supposed to be address to identify these isolates. Keywords: Anthracnose, Colletotrichum, Coffee berry, PCR, Identification. I. TV N nư c. T l b nh t i m t s a i m tr ng Chi Colletotrichum bao g m hơn 900 cà phê Tây Nguyên bi n ng t 7,02% - loài, có ph ký ch r ng, là nguyên nhân 13,57% năm 1996 và tăng lên 10,25% - gây b nh thán thư trên nhi u loài cây tr ng 19,82% năm 1997 [4]. Nguyên nhân gây khác nhau. Tuy nhiên, hi n nay trên th b nh thán thư cà phê Vi t Nam cho n nay gi i ch phân l p ư c 3 loài: ư c xác nh là do các loài n m Colletotrichum kahawae, C. gloeosporioides C. gloeosporioides, C. acutatum và C. capsici và C. acutatum t các m u b nh cà phê. Loài gây ra [1]. Do tính a d ng v c i m hình n m C. kahawae ch ư c phát hi n châu thái gi a các ch ng n m Colletotrichum r t Phi; có m c gây b nh r t m nh các giai cao nên vi c phân lo i n m Colletotrichum o n c a cây t lúc ra hoa n khi qu chín, d a trên c i m sinh lý và hình thái h c v n gây khô cành t ng n xu ng, qu khô và g p nhi u h n ch . Trong nghiên c u này, r ng hàng lo t nên thư ng g i là b nh khô chúng tôi k t h p các c i m hình thái và cành khô qu . Thi t h i v năng su t do n m k thu t sinh h c phân t nh n d ng s có C. kahawae có nơi, có lúc lên n 80% [7]. m t c a các loài n m Colletotrichum trên cà T i Vi t Nam hi n nay b nh thán thư ã có phê Ba Vì và Buôn Mê Thu t, làm cơ s m t t t c các vùng tr ng cà phê trên c cho các nghiên c u a d ng di truy n và
hư ng t i các bi n pháp phòng tr hi u qu + Kích thư c bào t : 25 bào t ư c o n m Colletotrichum gây b nh thán thư trên cà chi u dài và chi u r ng b ng kính hi n vi phê Vi t Nam. i n t Leica v i phóng i 40 x 16 l n. T l chi u dài/chi u r ng ư c tính và II. V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP ư c phân nhóm thu n l i cho m c ích NGHIÊN C U so sánh d a theo tiêu chuN c a Sander [6]. n 1. V t li u nghiên c u 2.3. T c phát tri n c a n m - M u b nh: 111 m u b nh thán thư T các m u n m 7 ngày tu i, c t m u trên thân, lá và qu ư c thu th p t năm c y v i kích thư c ng u nhau ư ng 2006 n năm 2007. Trong s m u thu kính 5 mm, t trên môi trư ng PDA th p, 90 m u b nh thu t 8 ti u vùng nhi t 250C. M i isolate nh c l i 3 l n. tr ng cà phê t i hai xã Sơn à và T n o ư ng kính phát tri n c a khuN l cn Lĩnh thu c Trung tâm Nghiên c u Cà phê hàng ngày trong 5 ngày. chè Ba Vì và 21 m u b nh còn l i thu t i Tr i Cà phê thu c Vi n KHKT Nông Lâm 2.4. Tách chi t AD t ng s Tây Nguyên. Sau khi ch ng n m nuôi c y t 7 ngày - M u i ch ng: Isolate C. gloeosporioides tu i, tách l p màng n m và kh i bào t , PR220 phân l p t Olea Europaea (M ) và nuôi c y l c (220 v/p) trong 100 ml môi isolate C. acutatum 397 phân l p t trư ng l ng theo Sreenivasaprasad [9] Fragaria x Ananssa (M ). nhi t 270C trong 3 ngày. Chúng tôi thu sinh kh i và ti n hành tách chi t ADN 2. Phương pháp nghiên c u c a n m d a trên phương pháp c a J.L. Cenis (1992) [5]. 2.1. Phân l p các m u n m Colletotrichum 2.5. Ph n ng PCR c hi u M u b nh ư c r a dư i vòi nư c S d ng c p m i NMS1 (CAGCAGT ch y cho trôi h t t và ch t bNn. Sau ó GAGGAATATTGGTCAATG)/NMS2 (GC m u ư c kh trùng b ng NaOCl 1% trong GGATCATCGAATTAAATAACAT) nhân 5 phút, tráng b ng c n 70%, r a b ng nư c o n ADN c hi u vùng ti u ti th (mtSSU) c t 3 l n và th m khô b ng gi y th m. C t cho m i loài n m Colletotrichum [2,10]. m u c y v i kích thư c 0,5 - 0,7 mm t i Các ch ng n m Colletotrichum ư c mép vùng b b nh (bao g m c vùng b nh nh n d ng b ng ph n ng PCR v i vi c và vùng không b nh) và t m u c y lên s d ng c p m i NMS1/NMS2 và s i ĩa môi trư ng PDA có ch a kháng sinh khuôn là ADN t ng s c a các ch ng Streptomycin (100 g/ml) (10 m u n m. Ph n ng PCR ư c th c hi n trong c y/ ĩa). nhi t 220C ± 2. Sau khi h n h p ph n ng th tích 25 l ch a 1 l n m m c, tách s i n m chuy n sang môi ADN c a n m (20 - 30 ng), 2,5 l dung trư ng PDA. T o ch ng thu n b ng môi ph n ng 10X, 0,2 mM dNTP, 2 mM phương pháp c y bào t ơn. MgCl2, 1 mM c a m i primer, 1U Taq polymerase (Promeaga). Chương trình 2.2. h n d ng n m ch y ph n ng PCR: ư c b t u 950C + D a trên c i m hình thái h c: Màu trong 3 phút; 35 chu kỳ, m i chu kỳ ư c s c khuN l c, hình thái bào t ư c mô t n thi t l p như sau: 950C trong 1’, 500C sau 7 ngày c y trên môi trư ng PDA. trong 1,15’, 720C trong 2’ và cu i cùng t i
720C trong 10’. S n phN PCR ư c tách m trên b n gen 1% agarose trong dung d ch TBE 1X. Sau khi i n di, gen ư c nhu m v i ethidium bromide và quan sát dư i èn UV. III. K T QU VÀ TH O LU N 1. Phân l p n m Qua i u tra kh o sát, b nh thán thư xu t hi n ch y u trên qu cà phê, tuy cũng có m t các b ph n khác c a cây như lá Hình 1. Tri u ch ng b nh thán thư và cành v i t n s th p hơn. Trên lá v t trên qu và lá cà phê b nh là nh ng m khô cháy, màu nâu ho c nâu tái, v i nh ng qu ng ng tâm. V t K t qu phân l p các ch ng n m gây b nh trên qu và cành là nh ng m r ng b nh thán thư trên cà phê Ba Vì và Buôn có màu nâu, nâu en, lõm và khô (hình 1). Mê Thu t ư c th hi n b ng 1. B ng 1. Các isolate Colletotrichum ư c phân l p t i Ba Vì và Buôn Mê Thu t S lư ng isolate n m phân l p đư c Đ a đi m M u b nh thu th p Qu Cành Lá T ng s Ba Vì 90 35 5 10 50 Buôn Mê Thu t 21 2 0 3 5 Thi t h i do b nh thán thư gây ra ch a d ng. i m d phân bi t nh t là c y u t các m u b nh trên qu . Vì v y chúng i m bào t c a các isolate ư c chia tôi ch n các isolate phân l p t qu ph c thành 3 nhóm v i hình thái khác nhau. v cho các nghiên c u ti p theo. Nhóm 1 bao g m 26 isolate có bào t hình tr th ng, hai u tròn, ho c nh n 2. h n d ng n m m t u; nhóm 2 g m 01 isolate có bào t hình thuôn m nh, nh n hai u 2.1. h n d ng n m d a vào c i m (isolate BMTQ18) và nhóm 3 là isolate hình thái h c v i bào t có hình lư i li m (isolate Các isolate Colletotrichum nghiên BV8.80b) (hình 2). c u có c i m hình thái và sinh lý r t a b c Hình 2. Hình thái bào t n m Colletotrichum: (a) hóm 1; (b) hóm 2; (c) hóm 3 Kích thư c bào t cũng là m t ch tiêu Colletotrichum. Kích thư c bào t r t a d ng quan tr ng phân lo i các ch ng n m dao ng t 12,38 - 25,26 x 3,53 - 7,46 ( m),
nhưng ph n l n các isolate Colletotrichum v i thu c nhóm 2 (BMTQ18) và thu c nhóm 3 hình thái bào t thu c nhóm 1 có kích thư c (BV8.80b) u có t l chi u dài/chi u r ng thu c nhóm 6 (32,14%), các isolate còn l i r i thu c nhóm 10. K t qu kích thư c bào t các rác rơi vào nhóm 2 n nhóm 9. Trong khi các isolate Colletotrichum phân l p ư c t ng k t isolate Colletotrichum có hình thái bào t hình 3. 9 8 7 6 S lư ng bào t 5 4 3 2 1 0 Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nhóm t l chi u dài/chi u r ng Hình 3. Phân nhóm bào t n m c a các isolate Colletotrichum theo nguyên t c c a Sanger D a vào hình thái và kích thư c bào t , d ng s i n m (bông x p, ch c m n...) và chúng tôi phân lo i 26 isolate thu c nhóm 1 mép khuNn l c phát tri n u ho c không là loài C. gloeosporioides và isolate nhóm 2 u (hình 4). (BMTQ18) là loài C. acutatum. Theo Olga nhi t 250C, các isolate [11], C. acutatum có bào t ng n và m nh Colletotrichum phân l p ư c có t c hơn bào t c a loài C. gloeosporioides. phát tri n dao ng t 4,45 mm/ngày n Nh ng k t qu nghiên c u b nh thán thư 7,13 mm/ngày. Trong khi h u h t các trên cà phê Arabica c a Kenny [7] cũng isolate bào t d ng 1 có t c phát tri n cho th y r ng, các loài C. gloeosporioides khuNn l c l n hơn 5,5 mm/ngày thì isolate có bào t hình tr , tròn hai u ho c nh n có bào t thu c d ng 2 và d ng 3 m t u, còn loài C. acutatum có bào t (BV8.80b) có t c phát tri n < 5 hình thoi. mm/ngày, tương ng là 4,45 ± 0,52 Chúng tôi nh n th y các c i m hình mm/ngày và 4,72 ± 0,00 mm/ngày (hình thái khuNn l c không th hi n s liên quan 5). Theo nghiên c u c a Olga [11] và n hình thái bào t . Ví d , các isolate có Kenny [7] thì loài C. acutatum có t c hình thái bào t thu c nhóm 1, khuNn l c phát tri n c a khuNn l c < 5 mm/ngày, r t a d ng t màu s c khuNn l c (tr ng còn C. gloeosporioides có t c phát bông, tr ng bNn, tr ng xám, xám, ...), n tri n khuNn l c > 5 mm/ngày.
Hình 4. M t s d ng hình thái khu n Hình 5. So sánh t c phát tri n c a khu n l c l c c a n m Colletotrichum: t i nhi t 250C (a) BMTQ18; (b) BV6.49; (c) BV6.50; (d) BV4.24 (4); (e) BV1.6; (f) BV3.20 (1) 2.2. h n d ng n m d a vào ph n K t h p k t qu nghiên c u nh n d ng ng PCR n m Colletotrichum qua các ch tiêu hình K t qu ch y PCR cho th y t t c các thái và phương pháp phân t thông qua ph n ng PCR s d ng s i khuôn là các ADN ph n ng PCR s d ng c p m i t ng s isolate Colletotrichum u cho s n N MS1/N MS2 cho phép chúng tôi k t lu n phNm PCR là các băng ADN c hi u có chi u các isolate có bào t thu c nhóm 1 là loài dài trùng v i chi u dài c a C. gloeosporioides C. gloeosporioides và isolate có bào t i ch ng (750 bpp), tr isolate BMTQ18 có thu c nhóm 2 là loài C. acutatum. s n phNm PCR là các băng ADN c hi u có S d ng c p m i N MS1/N MS2 có th chi u dài trùng v i chi u dài c a isolate nh n d ng ư c 2 loài C. gloeosporioides C. acutatum i ch ng (650 bp) (hình 6). và C. acutatum gây h i trên cà phê. 1 2 3 4 5 6 7 8 750bpp 500bpp 750bpp 500bpp 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Hình 6. K t qu nh n d ng n m Colletotrichum gây h i trên cà phê Vi t am thông qua ph n ng PCR s d ng c p m i MS1/ MS2 và AD t ng s c a các ch ng n m Colletotrichum. (1) và (17): Marker; (2) i ch ng C. acutatum; (3) i ch ng C. gloeosporioides; (4 - 12, 15 - 16) isolate t Ba vì; (13 - 14) isolate BMTQ18, BMTQ10
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam Riêng isolate có bào t thu c nhóm 3 (BV8.80b) không nh n d ng ư c b ng c p m i NMS1/NMS2 vì có kích thư c băng DNA trùng v i kích thư c băng c a isolate C. gloeosporioides. Tuy nhiên, nh ng c i m hình thái h c c a isolate BV8.80b tương t v i nh ng c i m hình thái h c c a loài C. capsici [8]. M c dù trên th gi i, loài này chưa ư c công b liên quan n b nh thán thư cà phê, nhưng t i Vi t Nam, TS. Tr n Kim Loang ã phân l p ư c loài này trên cà phê t i Tây Nguyên năm 1998 [3]. Có th gi i thích m t nguyên nhân c a i u này là cà phê ư c tr ng xen c nh nh ng cây ch c a n m C. capsici. ây ang là v n s ư c quan tâm trong các nghiên c u ti p theo c a chúng tôi. IV. K T LU N T 111 m u cà phê b b nh thán thư thu th p ư c t i Ba Vì và Buôn Mê Thu t, chúng tôi ã phân l p ư c 55 isolate Colletotrichum, trong ó chi m ph n l n t qu cà phê (37 isolate). Các isolate phân l p t qu cà phê b nh ư c chúng tôi s d ng cho các nghiên c u nh n d ng n c p loài. B ng s k t h p các c i m hình thái h c, sinh lý h c cùng v i k t qu c a phương pháp PCR chúng tôi ã phân lo i ư c 26 isolate thu c v loài C. gloeosporioides, m t isolate t Buôn Mê Thu t là loài C. acutatum, m t isolate thu c vùng Ba Vì ư c gi thi t là loài C. capsici. Trong tương lai, chúng tôi s ti p t c nghiên c u sâu hơn v isolate này. Thêm n a, chúng tôi còn ph i ti n hành ánh giá c tính c a các isolate n m phân l p ư c qua vi c lây nhi m trên cây con. TÀI LI U THAM KH O 1 guy n Th H ng Phương, Lê Th Ánh H ng, Jamshid Fatehi và Olga Vinnere, 2003. Phân lo i m t s loài thu c chi Colletotrichum thu th p t Vi t Nam và Thái Lan. H i ngh công ngh sinh h c toàn qu c 2003. 358 - 363. 2 Tr n Kim Loang và c ng s , 1998. K t qu nghiên c u b nh khô cành, khô qu trên cà phê chè catimor. T p chí Khoa h c, Công ngh và Qu n lý kinh t s 6, 253 - 255. 3 Gina M. Sander và Korsten. L., 2003). A comparative morphological study of South African avocado and mango isolates of Colletotrichum gloeosporioides. Can. J. Bot. 81, 877 - 885. 4 Kenny, M. K., Galea, V.J., Scott, P.T. và Price, T.V, 2006. A comparison of Colletotrichum species associated with berry diseases of Coffea arabica L. Pest and disease incursions: Risks, threats and management in Papua New Guinea. Canberra, ACIAR Technical Reports No.62, 192 - 199. 5 Sreenivasaprasad, S.; Averil E. Brown và Mills, P.R., 1993. Coffee berry disease pathogen in Africa: Genetic structure and relationship to the group species Colletotrichum gloeosporioides. Myco. Res 97(8): 995 - 1000. 6
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam gư i ph n bi n: guy n Văn Vi t 7