Báo cáo y học: "BIỆT HÓA TẾ BÀO GèC MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI THÀNH NGUYÊN BÀO XƯƠNG"

Chia sẻ: Nguyễn Phương | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:31

Thêm vào BST

Báo xấu

124
lượt xem 26
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

T Máu cuống rốn (MCR) người chứa một nguồn tế bào gốc (TBG) có khả năng biệt hóa thành một số kiểu tế bào khác nhau của cơ thể. Chúng tôi nghiên cứu một phương pháp thu nhận, phân lập và biệt hóa những TBG này thành nguyên bào xương để có thể ứng dụng trong lĩnh vực y học tái tạo, đặc biệt là trong công nghệ mô ghép xương. §ã phân lập những tế bào đơn nhân từ MCR bằng dung dịch ly giải hồng cầu và ficoll - hypaque. Tế bào được cảm ứng tạo xương bằng cách...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo y học: "BIỆT HÓA TẾ BÀO GèC MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI THÀNH NGUYÊN BÀO XƯƠNG"

BIỆT HÓA TẾ BÀO GèC MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI THÀNH NGUYÊN BÀO XƯƠNG Trần Công Toại*; Huỳnh Duy Thảo*; Phan Kim Ngọc**; Nguyễn Phương Thảo* TÓM TẮT Máu cuống rốn (MCR) người chứa một nguồn tế bào gốc (TBG) có khả năng biệt hóa thành một số kiểu tế bào khác nhau của cơ thể. Chúng tôi nghiên cứu một phương pháp thu nhận, phân lập và biệt hóa những TBG này thành nguyên bào xương để có thể ứng dụng trong lĩnh vực y học tái tạo, đặc biệt là trong công nghệ mô ghép xương. §ã phân lập những tế bào đơn nhân từ MCR bằng dung dịch ly giải
hồng cầu và ficoll - hypaque. Tế bào được cảm ứng tạo xương bằng cách nuôi trong môi trường IMDM với 15% FCS và bổ sung dexamethasone, ascorbic acid, β - glycerol phosphate, vitamin D2 và FGF - 9. Tế bào có những thay đổi về hình thái giống với tế bào xương. Kết quả nhuộm dương tính với Alizarin red, Von kossa và alkaline phosphatase. Kết quả chạy RT - PCR dương tính với osteopontin và osteocalcin. §ã xây dựng được qui trình thu nhận, phân lập và biệt hóa TBG từ máu cuống rốn người thành nguyên bào xương. * Từ khóa: Máu cuống rốn; Tế bào gốc; Biệt hóa tạo xương; Osteopontin; Osteocalcin. DIFFERENTIATion of HUMAN UMBILICAL CORD BLOOD STEM CELLS INTO OSTEOBLASTIC LINEAGE CELLS
Tran Cong Toai; Huynh Duy Thao; Phan Kim Ngoc; Nguyen Phuong Thao SUMMarY Human umbilical cord blood (UCB) is an incredible source of stem cells which are able to differentiate into many kind of cells of the body. Our team has developed a procedure to collect, isolate, and differentiate UCB stem cells into osteoblast for application in regenerative medicine especial for bone tissue engineering. We have isolated mononuclear cells from umbilical cord blood by erythrolysis solution and ficoll - hypaque solution. Mononuclear cells were induced into osteoblast by using an osteogenic medium IMDM plus 15% FCS, dexamethasone, ascorbic acid, β - glycerol
phosphate, vitamin D2 and FGF - 9. Cells started to change shape, assuming the typical osteocyte like shape. Cells were positive with Alizarin red stain, Von kossa stain, and alkaline phosphatase stain. RT - PCR for osteopontin and osteocalcin gene markers were positive. We confirmed the validity of a protocol regarding the isolation, culture and differentiation of UCB stem cells into osteoblasts. * Key words: Umbilical cord blood; Stem cells; Osteogenic differentiation; Osteopontin; Osteocalcin. * Tr-êng §¹i häc Y khoa Ph¹m Ngäc Th¹ch; ** §¹i häc Khoa học Tự nhiênThành phố Hồ Chi Minh Ph¶n biÖn khoa häc: GS. TS. Lª Gia Vinh ĐẶT VẤN ĐỀ
Máu cuống rốn người thậm chí là cả đối với tế là một nguồn mẫu rất dồi bào thần kinh… MCR dào nh-ng trước đây còn được sử dụng để chưa được quan tâm điều trị một số bệnh về nghiên cứu, bị bỏ đi và máu và hệ thống miễn được xử lý như một loại dịch có liên quan đến rác thải y tế. một số bệnh di truyền, MCR chứa nhiều dòng ung thư và những rối TBG còn rất trẻ có khả loạn chức năng có liên năng phân chia tốt, có thể quan về máu [1]. biệt hóa thành một số Ngoài ra, ưu điểm của loại tế bào khác nhau MCR là dễ thu nhận, số như: nguyên bào xương lượng máu thu được [9, 11], nguyên bào sụn nhiều [7], khi thu nhận [9], tế bào mỡ [9], máu ảnh không gây nguyên bào sợi, nguyên hưởng đến sức khoẻ của bào cơ, tế bào gan và bà mẹ và bé [6]. Khi tiến
hành nghiên cứu và ứng VẬT LIỆU VÀ dụng không gặp nhiều PHƯƠNG PHÁP khó khăn, cản trở về mặt NGHI£N CøU đạo đức sinh học và luật 1. VËt liÖu nghiªn pháp như những nghiên cøu. cứu về TBG phôi người. Mẫu MCR thu nhận từ MCR ngày càng được những sản phụ sinh tại nhiều người quan tâm Bệnh viện Hùng Vương, nghiên cứu và xem như phải đạt các tiêu chuẩn là một nguồn cung cấp [2, 4]: các sản phụ đồng TBG thay thế cho nguồn ý cho MCR để nghiên TBG từ tủy xương và cứu, được theo dõi lâm máu ngoại vi trong tương sàng, làm các xét nghiệm lai. trước sinh. Thai được lấy trong khoảng 36 - 42 tuần tuổi. Thai nhi sinh ra khỏe mạnh, không dị
tật bẩm sinh. Mẫu MCR Sử dụng hai phương âm tính với các xét pháp khác nhau để phân nghiệm HIV, HBsAg, lập tế bào đơn nhân từ MCR. Sử dụng dung anti - HCV, VDRL. 2. Ph-¬ng ph¸p nghiªn dịch ficoll - hypaque (1,077g/ml, GE cøu. Healthcare BioSciences 2.1. Ph©n lËp tÕ bµo AB) và dung dịch ly giải ®¬n nh©n tõ MCR: hồng cầu để thu nhận tế LÊy MCR ngay sau khi bào đơn nhân. cắt cuống rốn qua đường tĩnh mạch rốn bằng b¬m tiªm vô trùng, cho ngay vào thùng vận chuyển và đưa về phòng thí nghiệm. Bảo quản máu tạm thời trong tủ lạnh ở 40C, chờ xử lý.
Dịch tế bào đơn nhân Tế bào đơn nhân sau sau khi phân lập sẽ được khi phân lập sẽ được đánh giá tỉ lệ sống/chết nuôi trong chai nuôi T - bằng cách nhuộm tế bào 25 cm2 ở mật độ 106 - 107 với trypan blue (Sigma, tế bào/ml với môi trường USA) và xác định mật độ Iscove’s modified tế bào/ml. Nhuộm dịch tế dulbecco’s medium bào đơn nhân với dung (Sigma, USA), bổ sung dịch Giemsa (Merck, 15% fetal calf serum Germany) để đánh giá (Sigma, USA), kháng hình thái tế bào. sinh 100 UI/ml penicilin mg/ml và 100 2.2. Nu«i cÊy: streptomycin.
Nuôi tế bào trong tủ ấm dung dịch trypsin - với 5% C02, ở 370C. EDTA (Gibco, Mü). Tế môi trường 3 bào được cấy chuyền đến Thay ngày/1 lần. Sau 2 - 4 lần thứ 3 và tiến hành tuần nuôi cấy, tế bào biệt hóa thành nguyên nuôi đạt mật độ phù hợp bào xương với các thí để tiến hành cấy chuyền nghiệm sau: (khoảng 60 - 80% diện Thí nghiệm 1: mẫu tế tích chai nuôi). bào được cấy chuyền ở 2.3. BiÖt ho¸ thµnh lần thứ 3, nuôi trong môi trường IMDM, bổ sung nguyªn bµo x-¬ng: Tế bào sau thời gian 15% FCS, kháng sinh nuôi cấy sơ cấp đạt mật penicilin và độ phù hợp (khoảng 60% streptomycin. Sử dụng - 80% diện tích chai làm mẫu chứng âm. nuôi) sẽ được cấy chuyền Thí nghiệm 2: mẫu tế sang chai nuôi mới với bào cấy chuyền ở lần thứ
3, đạt mật độ phù hợp với môi trường sau: biệt hóa sẽ thay bằng môi IMDM, 15% FCS, 0,1 trường cảm ứng biệt hóa mM Dex, 10 mM b - Gl, tạo nguyên bào xương 100 µg/ml AA, 10-7 M với môi trường: IMDM, vitamin D2 và kháng mM sinh. 15% FCS, 0,1 dexamethasone (Dex), 10 Thí nghiệm 4: mẫu tế b mM - bào cấy chuyền ở lần thứ glycerolphosphate (b - 3, đạt mật độ phù hợp Gl), 100 µg/ml ascorbic biệt hóa sẽ thay bằng môi acid (AA) và kháng sinh. trường cảm ứng biệt hóa Thí nghiệm 3: mẫu tế tạo nguyên bào xương bào cấy chuyền ở lần thứ với môi trường sau: 3, đạt mật độ phù hợp IMDM, 15% FCS, 0,1 biệt hóa sẽ thay bằng môi mM Dex, 10 mM b - Gl, trường cảm ứng biệt hóa 100 µg/ml AA, 10 ng/ml tạo nguyên bào xương FGF - 9 và kháng sinh.
Thí nghiệm 5: mẫu tế sau khi biệt hóa sẽ được bào cấy chuyền ở lần thứ xác định tạo thành 3, đạt mật độ phù hợp nguyên bào xương in biệt hóa sẽ thay bằng môi vitro ở các ngày 14, 21 trường cảm ứng biệt hóa và 27. tạo nguyên bào xương 2.4. X¸c ®Þnh sù t¹o với môi trường sau: thµnh x-¬ng in vitro: IMDM, 15% FCS, 0,1 Nhuộm tế bào với mM Dex, 10 mM b - Gl, Alizarin red, Von kossa 100 µg/ml AA, 10-7 M và fast red violet LB salt vitamin D2, 10 ng/ml t¹i các thời ®iÓm 14, 21 FGF - 9 và kháng sinh. và 27 ngày. Theo dõi sự thay đổi về Chạy RT - PCR với 2 mặt hình thái tế bào và marker osteopontin và thay môi trường cảm ứng osteocalin. tạo nguyên bào xương Bảng 1: Trình tự mồi mới 3 ngày/lần. Tế bào dùng để chạy RT - PCR.
A: 5’ - CTACTTAG SẢ Ge ACTACTTG me N TRÌNH TỰ ACCAGTGA MỤ pH MỒI - 3’ ẨM C TẠ TIÊ Oste S: 5’ - 405 U O ocal CGCAGCC bp TH cin ACCGAGA ÀN CACCAT - H 3’ (bp) A: 5’ - GGGCAAG Oste S: 5’ - 330 GGCAAGG opon CTAGGCAT bp GGAAGA - tin CACCTGTG 3’ CCATACC - 3’
KẾT QUẢ NGHI£N 58,73 ± 3,30 ml máu. Dựa vào tiêu chuẩn thu CøU nhận thì thể tích MCR 1. Thu nhËn MCR. thu được (trung bình Thu nhận MCR tại 58,725 ± 3,295 ml) hoàn Bệnh viện Hùng Vương ë toàn phù hợp, an toàn với trÎ sinh ra bình thường, người tiến hành thí khỏe mạnh và đạt tiêu nghiệm và đủ tiêu chuẩn chuẩn để thu nhận mẫu phân lập tế bào đơn [2, 5]. nhân, nuôi cấy TBG. mẫu Cã 40 thÝ 2. Ph©n lËp tÕ bµo nghiÖm. Số tuổi mẹ ®¬n nh©n tõ MCR. trung bình: 26,25 ± 0,81 Sau khi phân lập bằng tuổi. Trọng lượng trung bình của em bé: 3117,50 ly tâm dựa vào tỷ trọng ficoll - hypaque: mật độ ± 60,22 g. tế bào trung bình thu Thể tích MCR trung được 14,59 ± 5,90 × 107 bình thu nhận được:
tế bào/ml. Tỉ lệ tế bào bình thu được: 8,58 ± sống/chết > 99,87%. 3,43 × 107 tế bào/ml. Tỉ Sau phân lập bằng lệ tế bào sống/chết dung dịch li giải hồng 94,98%. cầu: mật độ tế bào trung Bảng 2: Kết quả phân lập tế bào bằng ficoll - hypaque và dung dịch ly giải hồng cầu. SỬ DỤNG dung dịch SỬ DỤNG DUNG DỊCH LI GIẢI HỒNG CẦU ficoll - hypaque Thể Thể Mật độ tế Mật độ tế tích tích Số thí Số thí máu bào/ml máu bào/ml nghiệm nghiệm (× 107) (× 107) (ml) (ml) 1 60 17,23 1 18 81,75
2 18 6,75 2 24 2,01 3 24 127,00 3 39 10,90 4 39 48,00 4 14 17,40 5 14 70,50 5 25 0,09 6 25 0,38 6 13 1,50 7 15 0,50 7 30 0,77 8 13 0,41 8 30 6,86 9 30 0,93 9 50 2,60 10 60 4,05 10 72 0,23 11 60 1,70 11 72 6,40 12 72 1,04 12 36 12,90 13 48 1,20 13 48 26,25 14 84 3,00 14 54 5,24
15 30 8,60 15 60 2,18 16 54 6,12 16 36 5,08 (1) (2) (3) (4) (5) (6) 17 48 2,18 17 48 0,12 18 46 1,22 18 108 1,02 19 70 6,36 19 50 4,50 20 60 3,49 20 60 9,55 21 108 8,96 21 52 5,50 22 60 11,18 22 40 2,30 23 84 9,90 23 48 0,32 24 85 9,53 24 84 0,47
3. Nu«i cÊy tÕ bµo nguyên bào sợi và hình sao chiếm ưu thế. Sau 14 MCR in vitro. Tế bào sau khi phân lập ngày nuôi (10X), tế bào bằng cả hai phương pháp dạng giống nguyên bào sẽ được nuôi trong môi sợi chiếm ưu thế cùng trường IMDM có bổ với những tế bào hình sung 15% huyết thanh và sao dạng phẳng mỏng bám sát bề mặt chai nuôi. kháng sinh. Sau 14 ngày, tế bào đạt Sau 5 ngày nuôi cấy được mật độ cấy chuyền (10X) bắt đầu xuất hiện (khoảng 70 - 80% diện những tế bào có hình tích chai nuôi). dạng giống nguyên bào 4. X¸c ®Þnh t¹o thµnh sợi, hình tròn, hình sao và những tế bào phẳng nguyªn bµo x-¬ng in bám sát bề mặt chai nuôi. vitro. Sau 10 ngày nuôi cấy * KÕt qu¶ nhuém: tế bào giống (10X),
Tế bào sau khi biệt hóa ra từng nốt màu đen lớn, thành nguyên bào xương rải rác có những nốt khoảng 21 ngày sẽ xác xương màu đen nhỏ. định tạo thành của chất Chúng tôi đã tiến hành nền và nốt xương. nhuộm mẫu với thuốc Tế bào nhuộm với nhuộm fast red violet LB Alizarin red (10X) vµ salt để xác định sự có nuôi trong môi trường mặt của enzyme alkaline biệt hóa tạo xương, khi phosphatase, kÕt qu¶ nhuộm chất nền xương cho thÊy: tế bào sau tạo ra sẽ phản ứng với nhuém có xu hướng kết thuốc nhuộm tạo ra màu tụ vào nhau thành cụm đỏ đặc trưng của thuốc (cơ sở của sự hình thành nhuộm, tế bào nhuộm nốt xương), ë những nơi với Von kossa (10X): các có tạo cụm, màu hồng nốt xương tạo ra sẽ phản xuất hiện đậm và nhiều ứng với thuốc nhuộm tạo hơn những chç khác
trong chai nuôi, chứng tỏ nguyên bào xương in hoạt vitro, tiến hành chạy RT enzyme alkaline động ở những nơi này rất - PCR với 2 marker mạnh. osteopontin (marker sớm) và osteocalcin * RT - PCR: (marker muộn) với trình Để khẳng định kết quả tự mồi như trên. Kết quả biệt hóa tế bào thành cho thấy: Thang b -Actin Mẫu Mẫu chứng âm b - actin Trình tự b- khuếch đại 330 bp actin Trình tự khuếch đại 450bp bp
Hình 1: RT - PCR cho marker Hình 2: RT - PCR cho marker osteocalcin osteopontin (14 ngày) sau khi biệt (27 ngày) sau khi biệt hóa. Kết quả chỉ có hóa. Chạy RT - PCR xuất hiện mẫu 64 cho kết quả dương tính với sự vạch có kích thước sản phẩm 330 xuất hiện của vạch có kích thước 405 bp bp cho gen osteopontin. cho gen osteocalcin. hypaque cho mật độ tế BÀN LUẬN Nhìn chung, mẫu MCR bào cao gấp 1,7 lần so đạt tiêu chuẩn để phân với sử dụng dung dịch li lập và nuôi cấy TBG. giải hồng cầu. Tỉ lệ tế Thể tích máu sử dụng để bào sống/chết khi phân phân lập 58,73 ± 3,30 ml. lập bằng ficoll - hypaque cũng cao hơn (99,87% so Mật độ tế bào sau khi với 94,98%) phương phân lập từ 2 phương pháp li giải hồng cầu. pháp cho thấy: phương pháp sử dụng ficoll -