BÁO CÁO KHOA HỌC: "NHÂN GEN MÃ HOÁ RARN 5,8S Ở LOÀI TRÀ HOA VÀNG CAMELLIA PETELOTII VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

119
lượt xem 26
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chi Trà - Camellia thuộc họ Chè - Theaceae là một thực vật quý của Việt Nam. Các loài Camellia không những có vai trò quan trọng tham gia vào cấu trúc hệ thực vật nhiệt đới vùng núi mà còn có ý nghĩa về mặt kinh tế. Nhiều loài Trà được dùng làm đồ uống, dầu ăn, làm thuốc... và đặc biệt phải kể đến đó là giá trị về mặt cây cảnh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: "NHÂN GEN MÃ HOÁ RARN 5,8S Ở LOÀI TRÀ HOA VÀNG CAMELLIA PETELOTII VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO"

NHÂN GEN MÃ HOÁ RARN 5,8S Ở LOÀI TRÀ HOA VÀNG CAMELLIA PETELOTII VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Văn Mùi, Trương Quốc Phong Khoa Sinh học, ĐHKHTN Hà Nội 1. MỞ ĐẦU Chi Trà - Camellia thuộc họ Chè - Theaceae là một thực vật quý của Việt Nam. Các loài Camellia không những có vai trò quan trọng tham gia vào cấu trúc hệ thực vật nhiệt đới vùng núi mà còn có ý nghĩa về mặt kinh tế. Nhiều loài Trà được dùng làm đồ uống, dầu ăn, làm thuốc... và đặc biệt phải kể đến đó là giá trị về mặt cây cảnh. Các loài trong chi Camellia đều có hoa to và đẹp, nhiều màu sắc khác nhau, mùa nở hoa của chúng lại đúng vào dịp Tết (từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau). Chính vì vậy tiềm năng kinh tế về mặt làm cây cảnh của các loài trong
chi Camellia là rất lớn, trong số đó các loài Trà hoa vàng hiện nay đang được đặc biệt quan tâm. Theo những thống kê chưa đầy đủ thì số lượng loài trong chi Camellia khá lớn (khoảng 300 loài), trong đó nhiều loài có dạng đồng hình. [1] Chính vì vậy việc phân loại chi Camellia dựa trên các phương pháp phân loại cổ điển như: phương pháp hình thái so sánh, phương pháp giải phẫu so sánh,.. đôi khi gặp phải những khó khăn nhất định, cần phải có sự hỗ trợ của các phương pháp phân loại hiện đại. Thực tế hiện nay với sự phát triển của sinh học phân tử, phương pháp phân loại phân tử đã và đang được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả trong phân loại học nói chung và phân loại thực vật nói riêng. Các nhà khoa học đã chứng minh rằng đối với đối tượng thực vật việc giải trình tự gen mã hoá rARN 5,8S cũng như một số vùng gen khác như ITS1, ITS2, microsatellite... là một trong những công cụ hữu hiệu của phân loại phân tử.[3] Việc phân loại loài Trà hoa vàng Camellia petelotii ở Vườn
Quốc gia Tam Đảo cho đến này vẫn tồn tại hai ý kiến trái ngược nhau: 1 ý kiến cho rằng loài Trà này và loài Trà Camellia chrysantha ở Trung Quốc chỉ là một, ý kiến khác lại cho rằng 2 loài này là khác nhau và loài Trà Camellia petelotii là loài đặc hữu của Việt Nam, chỉ có ở Vườn Quốc gia Tam Đảo. Đến nay 2 ý kiến này vẫn chưa đi đến thống nhất, vì vậy việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử đối với trường hợp này là cần thiết và sẽ góp phần đưa đến thống nhất việc phân loại loài Trà Camellia petelotii. Trong bài này chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu về nhân gen mã hoá rARN 5,8S ở loài Trà Camellia petelotii nhằm mục đích phục vụ cho các nghiên cứu phân loại phân tử tiếp theo. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu Mẫu lá của loài Camellia petelotii ở Vườn Quốc gia Tam
Đảo do TS. Trần Ninh, bộ môn Thực vật, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp. Các hoá chất và dụng cụ thí nghiệm do các hãng Sigma, Bio - Rad,... cung cấp đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ thực vật của Samuel S. M. Sun và cộng sự (1994) [6] có 1 vài thay đổi cho phù hợp với đối tượng. - Phương pháp phát hiện và kiểm tra độ sạch của ADN bằng điện di trên gel agarose. [5] - Phương pháp nhân gen mã hoá rARN 5,8S bằng kĩ thuật PCR. [5] 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết ADN tổng số từ lá Camellia petelotii
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADN theo qui trình sau: Nghiền 0,75g lá trong Nitơ lỏng, bổ sung 5ml đệm chiết ở 600C (CTAB 2%, NaCl 1,4M,  - mercaptoetanol 0,2%, EDTA 20mM, Tris - HCl 100mM). Ủ mẫu ở 600C trong 30 phút, bổ sung hỗn hợp Chloroform : Isoamylalcohol (24: 1), trộn đều. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu pha trên, tủa trong cồn tuyệt đối, rửa tủa bằng cồn 800. Hoà tan tủa bằng đệm TE. Kết quả kiểm tra sự có mặt của AND tổng số được thẻ hiẹn trên hình 1.
Hình 1: ADN tổng số chưa loại ARN của loài Camellia petelotii Qua hình 1 ta thấy xuất hiện 1 băng ADN đậm có kích thước khoảng 23.1 kb. Kích thước này phù hợp với kích thước ADN tổng số ở thực vật chứng tỏ trong dịch chiết có chứa ADN tổng số. Tuy nhiên băng ADN còn chưa gọn và phía dưới còn có vệt sáng ARN, vì vậy chúng tôi đã tiến hành loại ARN bằng RNase. Kết quả thể hiện trên hình 2.
Hình 2: ADN tổng số đã loại ARN của loài Camellia petelotii M: Marker - ADN ở cắt bằng Hind III Giếng 1, 2: ADN tổng số đã loại ARN Qua hình 2 ta thấy băng ADN tổng số sau khi loại ARN đậm và gọn hơn, đồng thời vệt sáng ARN phía dưới đã hoàn toàn biến mất. Điều đó chứng tỏ ARN trong dịch chiết đã được loại bỏ hoàn toàn. 3.2. Nhân gen mã hoá rARN 5,8S bằng kĩ thuật PCR
Để nhân được đoạn gen mã hoá rARN 5,8S của loài Camellia petelotii cần phải có cặp mồi đặc hiệu gen mã hoá rARN 5,8S của chi Camellia. Cặp mồi này được thiết kế dựa trên việc so sánh trình tự gen ADNr 5,8S cuả 2 loài trong chi Camellia đã được công bố trên mạng Internet: Camellia fascicularis và Camellia nitidissima. Cf: Camellia fascicularis Cn: Camellia nitidissima Hình 3: So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen mã hoá rARN 5,8S ở 2 loài Trà Camellia fascicularis và Camellia nitidissima
Các trình tự này được xử lý nhờ phần mềm PC - GEN và qua đó có được cặp mồi có kí hiệu và trình tự như sau: HP1 (mồi xuôi) : 5' GCC CGC CGG GAG CGC GCC CG 3' HP2 (mồi ngược) : 5' GGC CTC CCG AGA CGG CGC GG 3' Sử dụng cặp mồi này chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với các thành phần và chu trình nhiệt như sau: * Thành phần của phản ứng PCR: * Chu trình nhiệt:
Hình 4: Phổ điện di sản phẩm PCR L: Ladder - Thang ADN chuẩn 100 bp Giếng 1: Sản phẩm PCR Kết quả của phản ứng PCR được thể hiện trên hình 4. Qua hình 4 ta thấy chỉ xuất hiện 1 băng ADN duy nhất, đậm, gọn có kích thước gần 500bp, phù hợp với kích thước
mà chúng tôi dự kiến trong quá trình thiết kế mồi. Như vậy có thể nói với cặp mồi này chúng tôi đã nhân thành công đoạn gen mã hoá rARN 5,8S ở loài Trà Camellia petelotii. 4. KẾT LUẬN 1. Đã tách chiết được ADN tổng số của loài Trà Camellia petelotii. Sản phẩm ADN thu được đủ hàm lượng và độ sạch cho các nghiên cứu tiếp theo. 2. Đã nhân được đoạn gen mã hoá rARN 5,8S ở loài Trà Camellia petelotii với cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho chi Camellia. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Ninh (2001), Kết quả nghiên cứu phân loại các loài Trà hoa vàng của Việt Nam, Báo cáo tại Hội thảo các loài Trà hoa vàng ở Việt Nam. 2. Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. Cox (1993), Principles of biochemistry, Worth publishers.
3. David V. Jobes, Lconard B. Thien (1997), "A Conserved Motif in the 5,8S ribosomal RNA gene is a useful diagnostic marker for plant internal transcribed spacer (ITS) sequences", Plant moleculer biology reporter, (15), pp. 326 - 331. 4. Pauline Nicholson (1997), "extraction of DNA from plant system", Life science news, (23), pp 12 - 14. 5. Sambrook J. , Fritsch E. F., Maniatis T. (1989), Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 6. Samuel S. M. Sun (1994), Methods in plant moleculer biology and agricultural biotechnology, Asian Vegetable Research and Developement Center, Taiwan. SUMMARY The 5.8S rDNA amplification of the yellow tea species - Camellia petelotii - in Tam Dao national park. Nguyen Thi Nga, Nguyen Van Mui, Truong Quoc Phong
Faculty of Biology HaNoi University of Science Up to now, biologists in the world haven't been agreed be of classifying the yellow tea species - Camellia petelotii yet. Some scientists think that Camellia petelotii and Camellia chrysantha belong to only one species, others think they are two different species and Camellia petelotii is endemic to Viet Nam. Traditional identification methods can't give out the final opion to stop this argument. Therefore, it's neccessary to classify by the modern molecular biology techniques. Sequencing 5.8S rDNA is one of those techniques. In this article, we expound our results in the 5.8S rDNA amplification of the yellow tea species - Camellia petelotii - in Tam Dao national park in order to serve molecular classification techniques. We have extracted total genomic DNA from the leaves of Camellia petelotii by the method of Samuel S. M. Sun (1994) with some small modifications. The total genomic DNA product we have obtained is enough quantity and
purification to research in molecular biology. Then we used this total genomic DNA as the template to amplify 5.8S rDNA by PCR technique. The 5.8S rDNA specific pair of primers in this reaction have designed based on known 5.8S rDNA sequence of two species in Camellia genus which have been published on the Internet. Using this pair of primers, we have amplified 5.8S rDNA of Camellia petelotii with the length approximately 500bp. Người thẩm định nội dung khoa học: PGS. Trịnh Đình Đạt. SO SÁNH KIỂU NHÂN CỦA LOÀI ANOPHELES DIRUS Ở ĐẢO HẢI NAM VÀ ANOPHELES DIRUS PEYTON HARRISON 1979 Ở VIỆT NAM Ngô Giang LiênĐại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Anopheles dirus là một trong những vectơ truyền sốt rét chính ở Việt Nam và Đông Nam Á. Phần lớn các loài muỗi truyền sốt rét là một phức hợp loài (chứa ít nhất từ hai đến nhiều loài đồng hình). Các loài đồng hình này rất giống nhau về hình thái nhưng thực chất chúng cách ly sinh sản
và thường có đặc điểm sinh học, sinh thái học, tập tính khác nhau do đó vai trò truyền sốt rét không như nhau vì vậy sự đáp ứng với các biện pháp phòng chống cũng khác nhau [2,8]. Xác định được chính xác các thành viên của phức hợp loài có một ý nghĩa cho các nghiên cứu về di truyền học, sinh thái học, tập tính, vai trò dịch tễ cũng như trong việc lựa chọn các biện pháp phòng chống thích hợp. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.2. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu Anopheles dirus trong nghiên cứu này được PCG.TS Nguyễn Văn Kim khoa nghiên cứu sốt rét chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh đem từ đảo Hải Nam Trung Quốc về sau
đó TS Trần Đức Hinh bộ môn côn trùng viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng đem trứng về nuôi tại phòng nuôi của viện cho các nghiên cứu. Các muỗi cái sau khi hút máu được ép đẻ và nuôi theo từng gia đình. Một số bọ gậy tuổi 4 dùng để nghiên cứu kiểu nhân, số khác dùng để chạy điện di. Sử dụng phương pháp nhiễm sắc thể nguyên phân của Baimai [2,3], tiêu bản nhiễm sắc thể sau khi để tủ ấm (370) trong 24 giờ đã được nhuộm bằng Giêm sa và được bảo quản trong hộp đựng tiêu bản [1,2]. Các ảnh nhiễm sắc thể được chụp trên máy ảnh Olympus BH2, dùng film Technical Pal Film có độ nhạy phù hợp [4]. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. 3.1 Kết quả nghiên cứu Theo sơ đồ nghiên cứu loài đồng hình (sơ đồ 1) các cá thể Anopheles dirus được thu thập từ Hải Nam Trung Quốc được xử lý và phân phối cho những nghiên cứu về hình thái, di truyền tế bào, sinh hoá và tập tính.
Sơ đồ về nghiên cứu loài đồng hình Sử dụng phương pháp làm tiêu bản nhiễm sắc thể nguyên phân cho thấy Anopheles dirus cũng như các loài muỗi khác có kiểu nhân (2n = 6) bao gồm 3 cặp nhiễm sắc thể [2,5]. Hai cặp thuộc về nhiễm sắc thể thường, một cặp thuộc về nhiễm sắc thể giới tính. Cặp nhiễm sắc thể thường lớn nhất là cặp có tâm lệch (submetacentric) cặp thứ hai ngắn hơn có đặc trưng tâm giữa (metacentric). Cặp giới tính (X và Y đều là tâm nút) chúng đồng hình ở con cái (XX) à dị hình ở con đực (XY) [4].
Phân tích gần 1500 phiếu trung kì từ hơn 200 mẫu nuôi theo gia đình chúng tôi nhận thấy Anopheles dirus ở Hải Nam Trung Quốc cũng có sự đa hình về nhiễm sắc thể giới tính. Có năm biến dị: ba biến dị thuộc về nhiễm sắc thể X và hai biến dị thuộc về nhiễm sắc thể Y đã được tìm thấy sau hơn 20 đợt phân tích (xem bảng tổng kết số mẫu đã được xử lý). Bảng tổng kết số mẫu đã được xử lí Các biến dị này đều là tâm mút khác nhau chủ yếu về số lượng cũng như sự phân bố và đặc điểm của những băng dị
nhiễm sắc [3]. Trong ba nhiễm sắc thể X được phân tích, nhiễm sắc thể X1 chỉ có 2 băng trong khi đó X2 và X3 lại có 3 băng. Ngoài ra độ dài của nhiễm sắc thể cũng là một đặc điểm được xem là một chỉ tiêu để phân biệt [3,5] (hình 1) Hình 1: Sơ đồ hoá bộ nhiễm sắc thể của Anopheles dirus Các nhiễm sắc thể Y trên tiêu bản nhuộm màu được dễ dàng phân biệt với nhiễm sắc thể X bởi đặc điểm hầu như là dị nhiễm sắc. Tính đa hình của nhiễm sắc thể Y thể hiện
ở độ dài của nhiễm sắc thể (nhiễm sắc thể) : Y1 nhỏ như một dấu chấm trên tiêu bản còn Y2 có độ dài gấp 4 lần nhiễm sắc thể Y1 và có thể đo được dễ dàng bằng trắc vi vật kính (hình 2) Hình 1 - 4: Nhiễm sắc thể kỳ giữa nguyên phân tế bào não bọ gậy tuổi 4 Anopheles dirus Hải Nam Trung Quoc). 1 - 2: X1X2 (con cái; 3: X3Y2 (con đực) 4: X2Y1 (con đực)