Báo cáo nghiên cứu khoa học: " NGHIÊN CỨU THU NHẬN GIAO TỬ VÀ PHÔI CÁ CHẠCH (Misgurnus anguillicaudatus) MỘT TẾ BÀO"

Chia sẻ: Nguyễn Phương Hà Linh Linh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

74
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cá chạch là loài cá nước ngọt. Không như các loài cá khác, chúng đẻ trứng suốt từ mùa xuân cho đến mùa thu. Vì vậy, cá chạch được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu chuyển gen trong các phòng thí nghiệm. Để làm chủ thời gian chuyển gen vào phôi cá đang phát triển thì thụ tinh nhân tạo là một bước bắt buộc trong kỹ thuật vi tiêm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo nghiên cứu khoa học: " NGHIÊN CỨU THU NHẬN GIAO TỬ VÀ PHÔI CÁ CHẠCH (Misgurnus anguillicaudatus) MỘT TẾ BÀO"

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 52, 2009 NGHIÊN CỨU THU NHẬN GIAO TỬ VÀ PHÔI CÁ CHẠCH (Misgurnus anguillicaudatus) MỘT TẾ BÀO Trần Quốc Dung Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế TÓM TẮT Cá chạch là loài cá nước ngọt. Không như các loài cá khác, chúng đẻ trứng suốt từ mùa xuân cho đến mùa thu. Vì vậy, cá chạch được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu chuyển gen trong các phòng thí nghiệm. Để làm chủ thời gian chuyển gen vào phôi cá đang phát triển thì thụ tinh nhân tạo là một bước bắt buộc trong kỹ thuật vi tiêm. Cá chạch đực và cái được phân biệt bằng cách dựa vào sự khác biệt hình thái của vây ngực. Sau khi gây kích thích bằng hormone qua đêm, trứng thành thục và tinh dịch được thu nhận từ cá bố mẹ. Thụ tinh nhân tạo được tiến hành trong đĩa Petri với tỉ lệ 100 µl tinh dịch/100 trứng. Kết quả nghiên cứu cho thấy kích thích sinh sản nhân tạo bằng cách tiêm não thùy thể cá chép hai lần vào xoang thân và thụ tinh nhân tạo bằng phương pháp thứ ba (vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch) cho hiệu quả tốt hơn. Từ khoá: Misgurnus anguillicaudatus, não thùy thể cá chép, thụ tinh nhân tạo, vi tiêm. I. Mở đầu Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) thuộc lớp Cá chạch, là cá nước ngọt. Ở nước ta, cá chạch là loài cá rất thường gặp ở các ao, hồ, kênh mương, đồng ruộng... Khác với các loài cá khác, cá chạch đẻ trứng suốt từ mùa xuân đến mùa thu. Do vậy, chúng được sử dụng trong các phòng thí nghiệm để nghiên cứu chuyển gen [7, 9]. Với mục đích làm chủ thời gian chuyển gen vào phôi cá đang phát triển thì thụ tinh nhân tạo là một bước bắt buộc trong kỹ thuật vi tiêm [10]. Để góp phần vào việc hoàn thiện phương pháp nghiên cứu chuyển gen vào cá chúng tôi tiến hành nghiên cứu thu nhận giao tử và phôi một tế bào chuNn bị cho kỹ thuật vi tiêm DNA vào cá chạch. II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) (Hình 1) sử dụng trong các thí nghiệm nghiên cứu được thu thập ở Nghĩa Ðô, Cầu Giấy, Hà Nội. - Não thùy thể cá chép do Công ty Dịch vụ và Nuôi trồng thuỷ sản trung ương (Ngọc Khánh, Ba Đình, Hà Nội) cung cấp. - Phương pháp thu nhận giao tử và thụ tinh nhân tạo được tiến hành theo Chung Lân và cs (1969): 29
+ Phân biệt đực, cái: Dựa vào vây ngực (Hình 2). + Chọn cá bố mẹ: chọn cá khỏe mạnh đang ở độ tuổi thành thục sinh dục. + Liều lượng tuyến yên cá chép dùng để tiêm cho cá chạch là 0,5 cái cho mỗi con cái, lượng tiêm cho cá đực bằng nửa cá cái. + Phương pháp tiêm: tiêm vào xoang thân và tiêm bắp thịt + Số lần tiêm: tiêm một lần và tiêm hai lần. Với cách tiêm hai lần thì lần đầu được tiêm vào buổi trưa, lần thứ hai vào hai giờ sáng để điều khiển cá đẻ lúc rạng đông. Hình 1: Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) + Thụ tinh nhân tạo: thụ tinh khô với 4 phương pháp khác nhau. Phương pháp 1: sau khi lấy trứng, cho tinh dịch đã lấy sẵn vào cốc nhỏ có nước muối sinh lý (lượng nước muối sinh lý gấp 10 lần tinh dịch) lắc đều, rồi tưới đều lên trứng. Phương pháp 2: đổ tinh dịch đã hòa với nước muối sinh lý vào khay thụ tinh sau đó cho trứng vào, lắc nhẹ khay thụ tinh làm cho trứng và tinh trùng sớm tiếp xúc với nhau. Phương pháp 3: vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch. Trong khi lấy trứng thì đồng thời có một số người khác lấy tinh dịch và tưới nhanh vào trứng. Phương pháp 4: lấy trứng trước, lấy tinh dịch sau. Sau khi lấy trứng, trực tiếp vuốt ngay tinh dịch của cá đực vào trứng. Bất kỳ áp dụng phương pháp nào, sau khi đã trộn lẫn tinh dịch với trứng cũng cần dùng lông gà khuấy nhẹ để thúc đNy quá trình thụ tinh. Vây ngực cá đực Vây ngực cá cái Hình 2: Vây ngực cá chạch đực và cá chạch cái 30
III. Kết quả và thảo luận 3.1. Số lần tiêm não thùy thể cá chép Ðể chủ động thu nhận trứng, tinh dịch và thụ tinh nhân tạo, cá chạch được kích thích sinh sản bằng cách tiêm não thùy thể cá chép (bảo quản trong dịch thể). Hiện nay, trong phương pháp kích thích sinh sản cá nuôi người ta có thể tiêm một lần hoặc hai lần. Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm so sánh hiệu quả kích thích sinh sản bằng cách tiêm một lần và tiêm hai lần để chọn ra phương pháp cho kết quả tốt, phù hợp với các điều kiện nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Bảng 1: Hiệu quả kích thích sinh sản cá chạch bằng số lần tiêm não thùy thể cá chép Tiêm 1 lần Tiêm 2 lần Số cá T ỉ lệ T ỉ lệ Số cá Số cá T ỉ lệ Số cá Tỉ lệ cá Đợt thí trứng trứng kích cho cá cho kích cho cho nghiệm nở nở thích trứng trứng thích trứng trứng (con) (con) (%) (con) (%) (%) (%) (con) 1 13 5 38,46 67,00 13 7 53,84 69,00 2 8 5 62,50 65,00 8 6 75,00 72,00 3 9 6 66,66 68,00 9 9 100,00 78,00 4 16 10 62,50 72,00 16 14 87,50 85,00 5 14 7 50,00 76,00 14 10 71,42 89,00 6 12 6 50,00 80,00 12 10 83,33 91,00 Trung 72 39 55,02 71,33 72 56 78,52 80,67 bình Kết quả ở bảng 1 cho thấy, tỉ lệ đẻ trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm một lần trung bình đạt 55,02% (từ 38,46 - 66,66%) và 71,33% (từ 65,00 - 80,00%); tiêm hai lần là 78,52% (từ 53,84 - 100%) và 80,67% (từ 69,00 - 91,00%). Như vậy, tỉ lệ cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm hai lần đạt 142,71% và 113,09% so với tỉ lệ cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch tiêm một lần. Kết quả này cho thấy hiệu quả kích thích sinh sản cá chạch bằng cách tiêm não thùy thể cá chép hai lần cao hơn cách tiêm một lần. Như chúng ta đã biết, quá trình thành thục của trứng từ cuối giai đoạn IV chuyển sang giai đoạn V cần có một thời kỳ quá độ. Do đó, trong trường hợp sử dụng cách tiêm một lần toàn bộ lượng thuốc, nhìn chung, nhất định sẽ có ảnh hưởng không tốt, tạo nên những phản ứng sinh lý vội gấp, cơ năng sinh dục không được điều hòa, như có hiện tượng bụng cá phình lên quá nhanh, quá to làm giảm tỉ lệ cho trứng và tỉ lệ nở. Hơn nữa, dùng cách tiêm hai lần còn có thể coi lần tiêm thứ nhất là lần sát hạch cuối cùng để lựa chọn cá bố mẹ thành thục. 31
3.2. Vị trí tiêm não thùy thể cá chép Về phương pháp tiêm cá thì hiện nay có hai cách tiêm: tiêm vào xoang thân và tiêm vào bắp thịt. Kết quả kích thích sinh sản nhân tạo cá chạch bằng hai phương pháp tiêm khác nhau được trình bày ở bảng 2. Bảng 2: Hiệu quả kích thích sinh sản cá chạch bằng các phương pháp tiêm khác nhau Tiêm vào xoang thân Tiêm vào bắp thịt Số cá Số cá T ỉ lệ T ỉ lệ Số cá Số cá T ỉ lệ T ỉ lệ Đợt thí được cho cá cho trứng được cho cá cho trứng nghiệm tiêm trứng trứng nở tiêm trứng trứng nở (con) (con) (%) (%) (con) (con) (%) (%) 1 10 7 70,00 79,00 10 6 60,00 80,00 2 6 4 66,66 85,00 6 4 66,66 82,00 3 12 8 66,66 72,00 12 5 41,66 68,00 4 8 7 87,50 70,00 8 7 87,50 65,00 5 10 8 80,00 89.00 10 7 70,00 85,00 6 8 6 75,00 84,00 8 5 62,50 80,00 Trung 54 40 74,30 79,83 54 34 64,72 76,67 bình Bảng 2 cho thấy tỉ lệ cá cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm não thùy thể cá chép bằng phương pháp tiêm vào xoang thân là 74,30% (từ 66,66 - 87,50%) và 79,83% (từ 70,00 - 89,00%); của cá chạch được tiêm não thùy thể cá chép bằng phương pháp tiêm bắp thịt tương ứng là 64,72% (từ 41,66 - 87,50%) và 76,67% (từ 65,00 - 85,00%). Như vậy, tỉ lệ cá cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm não thủy thể cá chép vào xoang thân đạt 117,64% và 104,13% so với cá chạch được tiêm não thùy thể cá chép vào bắp thịt. Kết quả này cho thấy kích thích sinh sản cá chạch bằng phương pháp tiêm vào xoang thân cho hiệu quả tương đối chắc chắn hơn phương pháp tiêm vào bắp thịt. 3.3. Phương pháp thụ tinh nhân tạo Bảng 3: Kết quả thụ tinh nhân tạo cá chạch theo các phương pháp thụ tinh khác nhau Phương pháp Đợt Số trứng thụ Số trứng nở T ỉ lệ n ở thụ tinh thí nghiệm tinh (cái) (cái) (%) 1 100 76 76,00 2 100 68 68,00 Phương pháp 1 3 100 71 71,00 4 100 65 65,00 5 100 82 82,00 ∑ = 500 ∑ = 362 x = 72,40 32
1 100 69 69,00 2 100 72 72,00 Phương pháp 2 3 100 78 78,00 4 100 64 64,00 5 100 75 75,00 ∑ = 500 ∑ = 358 x = 71,60 1 100 86 86,00 2 100 92 92,00 Phương pháp 3 3 100 72 72,00 4 100 80 80,00 5 100 78 78,00 ∑ = 500 ∑ = 408 x = 81,60 1 100 83 83,00 2 100 69 69,00 Phương pháp 4 3 100 74 74,00 4 100 78 78,00 5 100 75 75,00 ∑ = 500 ∑ = 379 x = 75,80 Trứng và tinh dịch được thu nhận vào đầu chu kỳ sáng để tiến hành thụ tinh nhân tạo với tỉ lệ 100 µl tinh dịch/100 trứng. Kết quả thụ tinh nhân tạo cá chạch theo các phương pháp khác nhau được trình bày ở bảng 3. Nhìn vào bảng 3 ta thấy các phương pháp thụ tinh nhân tạo 1, 2, 3 và 4 cho tỉ lệ nở lần lượt là 72,40%; 71,60%; 81,60% và 75,80%. Như vậy, phương pháp thụ tinh thứ 3 cho tỉ lệ nở cao nhất. Trong hai phương pháp thụ tinh 1 và 2 đều lấy tinh trùng trước, thời gian tiến hành thụ tinh dài. Ở phương pháp thụ tinh 4 lấy trứng trước và vuốt ngay tinh dịch của cá đực vào trứng nên có thể giảm bớt thời gian lấy tinh dịch. Trong khi đó, đối với phương pháp thụ tinh 3, vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch, do đó, thời gian thụ tinh là ngắn nhất. Mặt khác, các thí nghiệm này được tiến hành vào mùa nóng (tháng 5, 6, 7) nên trứng sau khi ra khỏi cơ thể mẹ mất khả năng thụ tinh rất nhanh. Thời gian thụ tinh càng dài tỉ lệ trứng mất khả năng thụ tinh càng lớn do đó tỉ lệ nở càng giảm. Tóm lại, trong 4 phương pháp thụ tinh nhân tạo nói trên, phương pháp thứ 3 cho hiệu suất cao nhất. IV. Kết kuận - Kích thích sinh sản nhân tạo cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) bằng phương pháp tiêm não thùy thể cá chép hai lần cho hiệu quả cao hơn tiêm một lần và phương pháp tiêm vào xoang thân cho hiệu quả cao hơn tiêm vào bắp thịt. - Trong các phương pháp thụ tinh nhân tạo, phương pháp 3 (vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch) cho hiệu quả thu nhận phôi cá chạch một tế bào cao nhất. 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Văn Cường, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Quyền Đình Thi, Trần Quốc Dung, Tạo cá chuyển gen hormone sinh trưởng người, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 9-10/12/1999. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, (1999), 1429-1437. 2. Trần Quốc Dung, Nghiên cứu chuyển gen hormone sinh trưởng người vào cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) bằng vi tiêm, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, 2001. 3. Trần Quốc Dung, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Văn Cường, Đặng Hữu Lanh, Tinh sạch và đánh giá sơ bộ gen hormone sinh trưởng người để chuyển vào cá vàng và cá chạch, Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng, Số 2, (1999), 39-44. 4. Trần Quốc Dung, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Văn Cường, Đặng Hữu Lanh, Tạo cá chạch mang gen hormone sinh trưởng người, Tạp chí Sinh học, 21(3) (1999), 24-28. 5. Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Trần Quốc Dung, Kết quả nghiên cứu khử màng chorion của phôi giai đoạn một tế bào chu n bị cho kỹ thuật vi tiêm vào cá chạch Misgurnus anguillicaudatus, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm KHTN và CNQG, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, (1997), 267-272. 6. Nguyen Kim Do, Nguyen Van Cuong, Nguyen Thi Dieu Thuy, Tran Quoc Dung, Some results on generation of transgenic animal: Fish by methallothionein human growth hormone (MThGH) gene microinjection, Proceedings, third Asian Symposium of Korean Society of Animal Reproduction, Korea 11-14/12/1997, (1997), 108-114. 7. Chung Lân, Lý Hữu Quảng, Trương Tùng Đào, Lưu Gia Chiếu, Trần Phấn Xương (Người dịch: Dương Tuấn, Nguyễn Kim Độ, Trần Nguyệt Thu, Trần Nhất Anh), Sinh vật học và sinh sản nhân tạo các loài cá nuôi, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 1969. 8. Patrick J. Babin, Joan Cerda, Esther Lubzens, The Fish Oocyte: From Basic Studies to Biotechnological Applications, Published by Singer, The Netherlandsm, 2007. 9. Nguyễn Khoa Diệu Thu, Văn Thị Hạnh, Nguyễn Hằng, Xây dựng phương pháp thu nhận giao tử và phôi một tế bào chu n bị cho kỹ thuật vi tiêm DNA vào cá vàng Carassius auratus, Tạp chí Khoa học và Công nghệ XXXII, 2 (1994), 6-11. 10. Zhu Z., Generation of fast growing transgenic fish: Method and mechanism, Transgenic fish, World Scientific, (1993), 93-119. 34
THE COLLETION OF GAMETES AND MONOCELLULAR EMBRYOS OF LOACH (Misgurnus anguillicaudatus) Tran Quoc Dung College of Pedagogy, Hue University SUMMARY Loach is a fresh water fish species. Unlike other fish species, loach spawns from spring to fall. It has been used in the laboratory for the study of transgenesis. In order to control the time course of gene introduction into developing fish embryo, artificial fertilzation is required. Females and males are identified by the morphology of the pectoral fin. After an overnight hormonal induction, the mature eggs and milt were striped from parent fish. About one hundred eggs were collected in Pestri dish and mixed with 100 µl milt. The outcomes show that fish injected intraperitoneally two times by carp pituitary with the third artificial fertilization way (collect eggs and milt at the same time) are better. Keywords: Misgurnus anguillicaudatus, carp pituitary, artificial fertilization, microinjection. 35