Báo cáo tổng kết đề tài: Đánh giá lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trọng trong thịt gia súc, gia cầm

Chia sẻ: Minh Nguyet | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:94

Thêm vào BST

Báo xấu

155
lượt xem 34
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài xây dựng quy trình phân tích thuốc kích thích tăng trưởng dạng kháng sinh và hocmon có độ tin cậy và chính xác cao, áp dụng được tại các phòng phân tích thực phẩm tại Trung ương, Thành phố và tuyến Tỉnh; nêu lên tình trạng sử dụng thuốc, các dạng và thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm có bán trên thị trường Hà nội và có tỉ lệ tồn dư thuốc kháng sinh, hocmon trong thịt gia súc gia cầm tạo các chợ trọng điểm và mộ số cơ sở chăn nuôi ở Hà Nội,… Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo tổng kết đề tài: Đánh giá lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trọng trong thịt gia súc, gia cầm

Bé y tÕ ViÖn Dinh D−ìng ________________________________________________________ B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi ®¸nh gi¸ l−îng tån d− thuèc kÝch thÝch t¨ng träng trong thÞt gia sóc, gia cÇm Chñ nhiÖm ®Ò tµi: trÇn quang thñy 6488 27/8/2007 Hµ Néi - 2007
PHẦN A: TÓM TẮT KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI 1. KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI (a)- Đóng góp mới của đề tài - Xây dựng quy trình phân tích thuốc kích thước tăng trưởng dạng kháng sinh và hocmon có độ tin cậy và chính xác cao, áp dụng được tại các phòng phân tích thực phẩm tại Trung ương, Thành phố và tuyến Tỉnh. - Nêu được thực trạng tình sử dụng thuốc; các d¹ng vµ lo¹i thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm có bán trên thị trường Hà nội; và tỉ lệ tồn dư thuốc kháng sinh, hocmon trong thịt gia súc gia cầm tại các chợ trọng điểm và một số cơ sở chăn nuôi của Hà Nội. - Tõ thùc tr¹ng trªn ®ã các nhà quản lý trong ngành Y tế, thú y đưa ra các chính sách quản lý vĩ mô, vi mô trong việc sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng; nghiên cứu đưa ra các tiêu chuẩn giới hạn tồn dư cho phép các loại thuốc kích thích tăng trưởng gia súc gia cầm chưa được ban hành trong ngành Nông nghiệp và Y tế; đồng thời thúc đẩy giám sát chặt chẽ hơn nữa các cơ sở chăn nuôi trong nước, sản xuất thịt và sản phẩm gia súc gia cầm đạt tiêu chuẩn chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm (CLVSATTP). (b)- Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể) - Quy trình phân tích thuốc kích thích tăng trưởng trong thịt gia súc, gia cầm - Số lượng và chủng loại thuốc kích thích thích tăng trưởng (dạng kháng sinh và hocmon) và thức ăn gia súc sử dụng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm - Giúp các nhà quản lý trong ngành Nông nghiệp và Y tế thấy được tình hình sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng trong thịt gia súc gia cầm tại địa bàn Hà Nội để đưa ra chính sách quản lý, giám sát, kiểm tra hữu hiệu từ khâu nguyên liệu, chăn nuôi, phân phối thịt gia súc trên địa bàn Hà nội nói riêng và trong cả nước nói chung và nhanh chóng ban hành tiêu chuẩn lượng cho phép lớn nhất đối với lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng trong thịt gia súc gia cầm và các sản phẩm của chúng - Đưa ra các tiêu chuẩn hiện hành của JECFA, WHO/FAO, JAPAN về lượng tồn dư cho phép lớn nhất thuốc kích thích tăng trưởng trong thịt gia súc gia cầm để các ban ngành nước ta tham khảo - Đưa ra tài liệu về thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm và vấn đề sử dụng thức ăn chăn nuôi an toàn cho người tiêu dùng. (c)- Hiệu quả về đào tạo - Đào tạo cho các phòng thử nghiệm thực phẩm tuyến Tỉnh kỹ thuật phân tích kháng sinh và hocmon trong thực phẩm gia súc gia cầm, phù hợp với các điều kiện trang thiết bị phân tích hiện có của phòng thử nghiệm 1
- Hướng dẫn cho các nhà quản lý, sản xuất đưa ra thị trường các loại thức ăn chăn nuôi đúng công thức phối trộn nguyên liệu và thành phần thuốc, đúng quy cách và quy định. - Hướng dẫn người chăn nuôi sử dụng thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm an toàn, nhằm đưa ra thị trường sản phẩm thịt sạch, đảm bảo Vệ sinh an toàn thực phẩm. - Bổ sung kiến thức cho người tiêu dùng biết được về tồn dư thuốc kích trưởng trong sản phẩm thịt gia súc, gia cầm có bán trên thị trường và tác hại của thuốc. (d)- Hiệu quả về kinh tế - Hướng dẫn nhà sản suất sản xuất các loại thức ăn chăn nuôi có sử dụng các loại thuốc kích thích tăng trưởng có hiệu quả theo từng giai đoạn chăn nuôi; nhằm tăng sản lượng thịt gia súc gia cầm s¹ch, từng bước đáp ứng được nhu cần tiêu thụ của người dân. - Chi phí kiểm nghiệm cho chỉ tiêu thuốc kích thích tăng trưởng (kháng sinh và hocmon) tại các phòng thí nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm ít tốn kém, vẫn đạt độ chính xác và tin cậy cao. (e)- Hiệu qủa về xã hội - Nâng cao nhận thức của các nhà quản lý, sản xuất và người tiêu dùng về vai trò, tác dụng, tác hại của thuốc kích thích tăng trưởng trong trong chăn nuôi và tồn dư thuốc trong thịt và sản phẩm của gia súc gia cầm trong sản xuất và đời sống xã hội - Người tiêu dùng thông thái hơn, biết chọn sản phẩm thịt gia súc gia cầm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, ngăn ngừa được các bệnh có liên quan đến thuốc kích thích tăng trưởng có thể dẫn đến các bệnh tiềm ẩn và hiểm nghèo gánh nặng cho xã hội như béo phì giả tạo, biến đổi giới tính....do sử dụng thịt gia cầm gia súc có dư lượng kháng sinh và hocmon cao vượt quá mức quy định cho phép. (f)- Các hiệu quả khác 2. ¸p dông vµo thùc tiÔn s¶n xuÊt vµ ®êi sèng x∙ héi - Ap dông Quy tr×nh ph©n tÝch ®Ò tµi x©y dùng ®Ó ph©n tÝch d− l−îng thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng trong thùc phÈm t¹i c¸c Phßng Thö nghiÖm ph©n tÝch Trung −¬ng, TØnh, Thµnh phè - §Ò tµi nªu ra c¸c lo¹i thuèc kh¸ng sinh, hocmon vµ c¸c d¹ng c«ng thøc thøc ¨n ch¨n nu«i ®Ó c¸c nhµ qu¶n lý thuèc vµ s¶n xuÊt thøc ¨n ch¨n nu«i, ng−êi ch¨n nu«i gia sóc gia cÇm tham kh¶o ¸p dông trong thùc tiÔn. - Gióp cho ng−êi tiªu dïng thùc phÈm cã th«ng tin vÒ c¸c lo¹i thuèc kÝch thÝch tr−ëng trong gia sóc gia cÇm, thËn trong khi mua thùc phÈm. 2
3. ®¸nh gi¸ thùc tiÔn ®Ò tµi ®èi chiÕu víi ®Ò c−¬ng nghiªn cøu ®∙ ®−îc phª duyÖt (a) TiÕn ®é - Do ¶nh h−ëng cña dÞch cóm gia cÇm, hiÖn t−îng në måm long mãng ë gia sóc gia cÇm nªn viÖc mua mÉu gÆp nhiÒu khã kh¨n, bÞ trÔ vÒ thêi gi¸n tiÕn ®é ®Ò tµi nghiªn cøu. (b)- Thùc hiÖn môc tiªu nghiªn cøu - §¶m b¶o thùc hiÖn ®Çy ®ñ c¸c môc tiªu nghiªn cøu ®Ò ra cña ®Ò tµi (c) C¸c s¶n phÈm t¹o ra so víi dù kiÕn cña b¶n ®Ò c−¬ng - S¶n phÈm t¹o ra cña ®Ò tµi ®¸p øng ®ñ c¸c dù kiÕn cña ®Ò c−¬ng (d) §¸nh gi¸ viÖc sö dông kinh phÝ - Khèi l−îng ®Ò tµi lín, tËp trung vµo x©y dùng quy tr×nh ph©n tÝch, vµ kinh phÝ cho kiÓm nghiÖm chØ tiªu kh¸ng sinh vµ hocmon kh¸ cao; nh−ng vÉn ®¶m b¶o c¸c môc tiªu nghiªn cøu ®Ò ra. Do vËy ®¹t hiÖu qu¶ cao trong viÖc sö dông kinh phÝ ®−îc cÊp. 4. C¸c ý kiÕn ®Ò xuÊt - CÇn cã sù phèi hîp liªn ngµnh trong qu¶n lý thuèc vµ c¸c c¬ së s¶n xuÊt thøc ¨n ch¨n nu«i cã sö dông thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng, thÞt vµ s¶n phÈm gia sóc gia cÇm b¸n trªn thÞ tr−êng tiªu thô nh− siªu thÞ vµ b¸n lÎ - X©y dùng vµ ban hµnh tiªu chuÈn c¸c vÒ thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng trong thøc ¨n ch¨n nu«i vµ thÞt gia sóc gia cÇm - X©y dùng c¸c Phßng thö nghiÖm träng ®iÓm t¹i tØnh thµnh cã n¨ng lùc cao trong kiÓm so¸t ®−îc chÊt l−îng vµ VSATTP. Tõng b−íc ®a d¹ng hãa kh¶ n¨ng ph©n tÝch c¸c chØ tiªu chÊt l−îng vµ VSATTP cña c¸c PTN thuéc ngµnh Y tÕ, tØnh thµnh ®Æc biÖt ®èi víi hµng hãa thùc phÈm xuÊt nhËp khÈu trong vµ ngoµi n−íc. 3
PhÇn B: Néi dung b¸o c¸o chi tiÕt kÕt qu¶ nghiªn cøu ®Ò tµi cÊp Bé 1. §Æt vÊn ®Ò 1.1. Tãm l−îc nh÷ng nghiªn cøu trong vµ ngoµi n−íc liªn quan ®Õn ®Ò tµi. TÝnh cÊp thiÕt cÇn nghiªn cøu cña ®Ò tµi Nhê nh÷ng tiÕn bé v−ît bËc cña khoa häc kü thuËt mµ ngµnh c«ng nghiÖp s¶n xuÊt c¸c s¶n phÈm thùc phÈm, thøc ¨n ch¨n nu«i ®· ngµy mét phong phó vµ kh«ng ngõng ph¸t triÓn. C¸c chñng lo¹i thøc ¨n ch¨n nu«i gia sóc, gia cÇm chÕ biÕn s½n trªn thÞ tr−êng hiÖn nay rÊt ®a d¹ng. Ngoµi c¸c thµnh phÇn c¬ b¶n cung cÊp n¨ng l−îng nh− protein, lipid, glucid, ng−êi ta cßn bæ sung chÊt kho¸ng, vitamin, kh¸ng sinh vµ chÊt t¨ng träng gióp cho con vËt võa lín nhanh võa cã kh¶ n¨ng chèng ®ì bÖnh tËt. Nh÷ng lîi Ých cña thøc ¨n ®ãng gãi s½n rÊt dÔ nhËn thÊy, ng−êi ch¨n nu«i võa kh«ng mÊt nhiÒu thêi gian t×m nguån nguyªn liÖu, chÕ biÕn phï hîp víi tõng thêi kú sinh tr−ëng cña con vËt mµ l¹i cho n¨ng suÊt rÊt cao nh−ng nÕu bu«ng láng qu¶n lý chÊt l−îng c¸c lo¹i thøc ¨n ch¨n nu«i vµ ch¹y theo lîi nhuËn sÏ cã thÓ dÉn tíi nh÷ng sai sãt khã l−êng trong s¶n xuÊt, sö dông thøc ¨n ch¨n nu«i chÕ biÕn s½n, g©y hËu qu¶ nghiªm träng ®Õn chÊt l−îng vÖ sinh an toµn thùc phÈm, ¶nh h−ëng lín tíi søc kháe ng−êi tiªu dïng. Mét sè nghiªn cøu ®· ®Ò cËp ®Õn nh÷ng t¸c dông ngoµi ý muèn cña kh¸ng sinh, chÊt kÝch thÝch t¨ng tr−ëng trong thøc ¨n ch¨n nu«i chÕ biÕn s½n ®Õn chÊt l−îng vÖ sinh an toµn thùc phÈm. Ng−êi tiªu dïng ngµy nay ®· c¶nh gi¸c víi nh÷ng thùc phÈm cã liªn quan ®Õn c«ng nghÖ sinh häc, c¸c lo¹i phô gia thùc phÈm vµ viÖc l¹m dông kh¸ng sinh trong ®iÒu trÞ bÖnh tËt cho ng−êi vµ gia cÇm, gia sóc. ViÖc l¹m dông c¸c chÊt kh¸ng sinh vµ hocmon bæ sung vµo thøc ¨n ch¨n nu«i gÇn ®©y ®· ®−îc c¶nh b¸o, tuy nhiªn l−îng tån d− trong thÞt gia cÇm, gia sóc vÉn ch−a ®−îc x¸c ®Þnh cô thÓ. Do vËy, ®Ó cung cÊp sè liÖu cã tÝnh khoa häc, Khoa Hãa Thùc phÈm vµ VÖ sinh an toµn thùc phÈm-ViÖn Dinh d−ìng ®· tiÕn hµnh ®Ò tµi nghiªn cøu “§¸nh gi¸ l−îng tån d− thuèc kÝch thÝch t¨ng träng trong thÞt gia sóc, gia cÇm”. Hy väng kÕt qu¶ cña ®Ò tµi sÏ gãp phÇn ®Ò xuÊt biÖn ph¸p t¨ng c−êng c«ng t¸c qu¶n lý viÖc s¶n xuÊt vµ sö dông mét c¸ch cã hiÖu qu¶ thøc ¨n chÕ biÕn s½n nh»m thóc ®Èy sù ph¸t triÓn ngµnh ch¨n nu«i, cung cÊp ®ñ nguån thùc phÈm s¹ch, vÖ sinh an toµn, b¶o vÖ søc kháe ng−êi tiªu dïng. 1.2. Gi¶ thiÕt nghiªn cøu cña ®Ò tµi - Tham kh¶o c¸c tµi liÖu ph©n tÝch thuèc kÝch thÝch t¨ng träng gia sóc gia cÇm trong vµ ngoµi n−íc. Kh¶o nghiÖm, lùa chän quy tr×nh ph©n tÝch tèi −u phï hîp víi ®iÒu kiÖn trang thiÕt hiÖn 4
cã cña phßng thö nghiÖm; tiÕn hµnh thÈm ®Þnh kü thuËt ®¹t; tiªu chuÈn ¸p dông thö nghiÖm t¹i Phßng thö nghiÖm. - ¸p dông quy tr×nh ph©n tÝch ®· x©y dùng x¸c ®Þnh l−îng tån d− thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng trong thÞt vµ phñ t¹ng gia sóc gia cÇm t¹i c¸c chî träng ®iÓm vµ 2 c¬ së ch¨n nu«i cña Hµ Néi. - Kh¶o s¸t, t×m hiÓu, ghi chÐp c¸c lo¹i thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng d¹ng kh¸ng sinh vµ hocmon vµ c¸c lo¹i thøc ¨n gia sóc gia cÇm cã b¸n trªn thÞ tr−êng Hµ Néi. - Tham kh¶o vµ nghiªn cøu trong vµ ngoµi n−íc ®−a ra tµi liÖu vÒ thøc ¨n gia sóc cña ; vÊn ®Ò an toµn trong sö dông. - Xö lý thèng kª kÕt qu¶ ph©n tÝch. 1.3. Môc tiªu nghiªn cøu - Ph©n tÝch lưîng tån d− thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng trong mÉu thÞt lîn vµ thÞt gµ trªn thÞ tr−êng Hµ Néi. - Thu thËp c¸c lo¹i thuèc kÝch thÝch t¨ng träng dïng cho gia sóc gia cÇm trªn ®Þa bµn Hµ Néi, danh môc ®−îc phÐp theo khuyªn c¸o cña FAO/WHO vµ bÞ cÊm. - Kh¶o s¸t thÞ tr−êng b¸n thøc ¨n gia sóc cã sö dông thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng. Tµi liÖu vÒ thøc ¨n t¨ng träng vµ an toµn trong sö dông b¶o vÖ søc kháe céng ®ång. §Þa ®iÓm, thêi gian ph©n tÝch mÉu - Khoa Hãa-VÖ Sinh An Toµn Thùc PhÈm vµ Phßng Hãa §éc Thùc phÈm/Trung T©m KiÓm NghiÖm VSATTP, ViÖn Dinh D−ìng. - Thêi gian tiÕn hµnh 2004 - 2006 5
2. Tæng quan cña ®Ò tµi: 2.1 T×nh h×nh nghiªn cøu ngoµi n−íc liªn quan tíi ®Ò tµi T×nh h×nh nghiªn cøu ngoµi n−íc ®èi víi thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng d¹ng kh¸ng sinh vµ hocmon ®èi víi thùc phÈm ph¸t triÓn m¹nh mÏ t¹i nhiÒu n−íc Ch©u ¢u, Mü, NhËt B¶n tõ ®Çu nh÷ng n¨m 1960 vÒ ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch trªn c¸c thiÕt bÞ nh− S¾c ký láng, S¾c ký khÝ, Elysa vµ ®Õn ®Çu 1970 c¸c kü thuËt khèi phæ ra ®êi cã thÓ ph©n tÝch tån d− thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng d−íi d¹ng vÕt siªu nhá. Cã nhiÒu kh¶o s¸t t¹i t¹i c¸c n−íc ph¸t triÓn còng nh− c¸c n−íc kÐm ph¸t triÓn t¹i Ch©u Phi vµ gÇn ®©y t¹i Trung Quèc, cho thÊy d− l−îng thuèc kh¸ng sinh vµ hocmon trong thùc phÈm vµ ®Æc biÖt trong thÞt gia sóc gia cÇm kh¸ cao ®¸ng b¸o ®éng víi tØ lÖ cao. Do vËy viÖc nghiªn cøu t×nh h×nh sö dông thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng trong s¶n xu©t, ch¨n nu«i vµ ®Õn s¶n phÈm thùc phÈm, thñy s¶n xuÊt nhËp khÈu ®−îc ®Æc biÖt chó trªn thÕ giíi trong thêi gian qua. C¸c ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch d− l−îng kh¸ng sinh vµ hocmon trong thùc phÈm HiÖn nay, trªn thÕ giíi ®· cã nhiÒu nghiªn cøu ph©n tÝch tån d− kh¸ng sinh vµ hocmon trong thÞt còng nh− phñ t¹ng ®éng vËt, phÇn lín c¸c ph−¬ng ph¸p ®Òu sö dông thiÕt bÞ s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao [7; 8; 9; 10; 11; 12 ; vµ 18; 19; 20; 21; 22; vµ 24; 25; 26; 27; 28; 29]. * Ph©n tÝch kh¸ng sinh nhãm tetracyclin C¸c kh¸ng sinh nhãm tetracyclin lµ nh÷ng kh¸ng sinh phæ réng, cã t¸c dông trªn c¶ c¸c vi khuÈn gram ©m vµ gram d−¬ng, ®Æc biÖt cã t¸c dông trªn c¸c vi khuÈn nh− Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus, Gonococus, Cholera, Dysentery bacillis, Pertussis, Rickettsia, Chlamydia vµ Mycoplasma. ViÖc sö dông réng r·i c¸c kh¸ng sinh nhãm nµy cã thÓ lµm t¨ng nguy c¬ ®Ò kh¸ng kh¸ng sinh, v× vËy cÇn thiÕt ph¶i cã nh÷ng ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ chÝnh x¸c vÒ møc ®é tån d− nh»m b¶o vÖ søc kháe ng−êi tiªu dïng. Ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch b»ng vi sinh vËt lµ mét ph−¬ng ph¸p phæ biÕn ®Ó x¸c ®Þnh d− l−îng kh¸ng sinh. Tuy nhiªn ph−¬ng ph¸p nµy tèn nhiÒu thêi gian, kh«ng thÓ x¸c ®Þnh cô thÓ tõng lo¹i kh¸ng sinh trong nhãm vµ ®é chÝnh x¸c lµ kh«ng æn ®Þnh. V× vËy hiÖn nay c¸c ph−¬ng ph¸p s¾c ký ®−îc lùa chän lµ ph−¬ng ph¸p chÝnh ®Ó ph©n tÝch d− l−îng c¸c kh¸ng sinh nhãm tetracyclin. Ph−¬ng ph¸p s¾c ký cæ ®iÓn lµ ph−¬ng ph¸p s¾c ký líp máng ®−îc ¸p dông tõ nh÷ng n¨m 1960, sö dông c¸c vËt liÖu líp máng nh− kieselguhr, silica gel vµ celluloza. C¸c mÉu ®−îc ¸p dông chñ yÕu lµ d−îc phÈm vµ mét sè lo¹i thùc phÈm nh− s÷a, mËt ong vµ thÞt, c¸. Ph−¬ng ph¸p ®iÖn di mao qu¶n còng ®−îc ¸p dông vµ cã mét sè −u ®iÓm so víi s¾c ký láng nh− sö dông rÊt Ýt dung m«i, thêi gian ph©n tÝch ng¾n, hiÖu lùc t¸ch cao. Tuy nhiªn ph−¬ng ph¸p nµy Ýt ®−îc ¸p dông trong thùc tÕ ®Ó ph©n tÝch d− l−îng kh¸ng sinh v× l−îng mÉu b¬m nhá vµ do ®ã ®é nh¹y thÊp. Ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao lµ ph−¬ng ph¸p chÝnh ®−îc ¸p dông hiÖn nay ®Ó x¸c ®Þnh d− l−îng rÊt nhá c¸c kh¸ng sinh trong thùc phÈm. NhiÒu nghiªn cøu ®· thùc hiÖn vµ c«ng bè trªn c¸c t¹p chÝ ph©n tÝch chuyªn ngµnh. C¸c 6
tetracyclin ®−îc chiÕt vµ lµm s¹ch b»ng chiÕt pha r¾n, sau ®ã ®Þnh l−îng trªn s¾c ký láng sö dông c¸c detector UV hoÆc PDA. §èi víi c¸c mÉu cã d− l−îng rÊt nhá, ng−êi ta sö dông s¾c ký láng khèi phæ ®Ó ®Þnh l−îng [19]. Ph©n tÝch olaquindox vµ cacbadox Olaquindox vµ carbadox lµ hai chÊt thuéc nhãm quinoxaline 1,4-dioxide, ®−îc dïng ë mét sè n−íc ®Ó kÝch thÝch t¨ng tr−ëng vµ ®iÒu trÞ Øa ch¶y trªn gia sóc. Do nh÷ng nguy c¬ vÒ kh¶ n¨ng g©y ®ét biÕn gen vµ g©y ung th− cña c¸c chÊt nµy vµ mét sè chÊt chuyÓn hãa cña chóng, EU ®· cÊm sö dông hai lo¹i hãa chÊt nµy tõ n¨m 1998. §Ó gi¸m s¸t viÖc sö dông c¸c chÊt olaquindox vµ carbadox trong ch¨n nu«i, c¸c ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch còng ®· ®−îc ph¸t triÓn vµ ¸p dông ®Ó ph©n tÝch trong thøc ¨n ch¨n nu«i vµ s¶n phÈm tõ gia sóc, gia cÇm. C¸c ph−¬ng ph¸p ®−îc ¸p dông ®Ó x¸c ®Þnh tån d− olaquindox, carbadox vµ c¸c chÊt chuyÓn hãa chÝnh lµ s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao víi detect¬ UV hoÆc DAD [9, 10]. Ph©n tÝch c¸c hocmon steroid C¸c hocmon steroid cã thÓ cã mÆt trong thÞt c¸c lo¹i gia sóc, gia cÇm víi hµm l−îng rÊt thÊp vµi µg/kg (ppb). B¶n th©n ®éng vËt còng tù tæng hîp c¸c lo¹i hocmon nµy trong qu¸ tr×nh chuyÓn hãa tù nhiªn c¸c protein vµ chÊt bÐo. V× vËy c¸c hocmon nµy ®−îc biÕt lµ cã thÓ ¶nh h−ëng ®Õn sù ph¸t triÓn vµ ph©n bè cña c¸c m« mì vµ c¬. Møc ®é vµ tû lÖ c¸c lo¹i hocmon, c¸c chÊt tiÒn th©n vµ c¸c chÊt chuyÓn hãa phô thuéc vµo c¸c ®iÒu kiÖn sinh lý, ®Æc tÝnh di truyÒn vµ ¶nh h−ëng cña m«i tr−êng, trong ®ã cã ®iÒu kiÖn vµ thøc ¨n ch¨n nu«i. V× vËy, viÖc gi¸m s¸t hµm l−îng c¸c hocmon steroid lµ rÊt quan träng ®Ó ®¸nh gi¸ chÊt l−îng thÞt gia sóc, gia cÇm. Tuy nhiªn thùc tÕ rÊt khã cã thÓ ph©n biÖt ®−îc ®©u lµ hocmon néi sinh vµ ®©u lµ l−îng hocmon ®−îc ®−a vµo qua qu¸ t×nh ch¨n nu«i. V× vËy th«ng th−êng ng−êi ta ph¶i x¸c ®Þnh tû lÖ gi÷a c¸c lo¹i hocmon, tû lÖ c¸c chÊt tiÒn th©n vµ c¸c chÊt chuyÓn hãa. NhiÒu ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch ®· ®−îc ph¸t triÓn ®Ó x¸c ®Þnh hµm l−îng hocmon trong thÞt nh− ph−¬ng ph¸p s¾c ký líp máng, s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao, ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch, ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ khèi phæ vµ ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng khèi phæ [22, 28]. §Ó ®¹t ®é chÝnh x¸c cao h¬n, ng−êi ta cã thÓ kÕt hîp nhiÒu ph−¬ng ph¸p víi nhau, ch¼ng h¹n kÕt hîp ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch vµ ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ khèi phæ. Ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch miÔn dÞch ®Æc biÖt phï hîp ®Ó ph©n tÝch sµng läc nhiÒu mÉu víi ®é nh¹y rÊt cao. 2.2 T×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc liªn quan tíi ®Ò tµi ¥ ViÖt Nam kh¸ng sinh ®−îc dïng réng r·i ®Ó ch÷a bÖnh cho ng−êi vµ gia sóc, ng−êi ta ®· ph¸t hiÖn ra r»ng nÕu ®−a mét l−îng nhá kh¸ng sinh vµo thøc ¨n gia sóc gia cÇm th× kh«ng nh÷ng h¹n chÕ nhiÒu bÖnh truyÒn nhiÔm mµ cßn lµm con vËt lín nhanh, cho nhiÒu thÞt vµ nhiÒu trøng. Sau ®ã, kh¸ng sinh ngµy cµng ®−îc dïng phæ biÕn trong ch¨n nu«i. Ng−êi ta ®· trén kh¸ng sinh vµo thøc ¨n gia sóc víi liÒu l−îng thÝch hîp nh»m kÝch thÝch sinh tr−ëng ®èi víi gia sóc cßn non vµ mang l¹i hiÖu qu¶ trong tr−êng hîp thøc ¨n kÐm chÊt l−îng, chuång tr¹i Èm −ít mÊt vÖ sinh vµ nh÷ng vïng cã dÞch bÖnh th−êng xuyªn xÈy ra. ë nh÷ng 7
con vËt míi vµo giai ®o¹n ph¸t triÓn th× kh¸ng sinh cã hiÖu qu¶ m¹nh h¬n con vËt tr−ëng thµnh. §èi víi gia sóc tiÕt s÷a nh− bß s÷a, lîn n¸i ®ang tiÕt s÷a, kh¸ng sinh cã t¸c dông kh«ng râ rµng, cã thÓ kh¸ng sinh tiÕt qua s÷a g©y ¶nh h−ëng ®Õn chÊt l−îng s÷a, kh«ng nªn bæ sung kh¸ng sinh vµo thøc ¨n nÕu kh«ng v× môc ®Ých ch÷a bÖnh cho con vËt [1, 2]. Bªn c¹nh nh÷ng lîi Ých dÔ nhËn thÊy cña thøc ¨n ch¨n nu«i cã bæ sung kh¸ng sinh, nh÷ng t¸c dông kh«ng mong muèn cña kh¸ng sinh ngµy cµng thÓ hiÖn râ rÖt. Dïng kh¸ng sinh víi liÒu l−îng thÊp vµ liªn tôc ®· lµm xuÊt hiÖn vi khuÈn kh¸ng l¹i kh¸ng sinh. Kh¸ng sinh kh«ng nh÷ng lo¹i bá nh÷ng vi khuÈn cã h¹i mµ cßn tiªu diÖt c¸c vi khuÈn cã Ých nh− vi khuÈn t¹o vitamin nhãm B trong ®−êng tiªu ho¸. Do vËy, ®· cã nh÷ng khuyÕn c¸o h¹n chÕ hoÆc kh«ng dïng kh¸ng sinh trong thøc ¨n ch¨n nu«i, chØ sö dông tËp trung vµo nh÷ng giai ®o¹n gia sóc dÔ bÞ khñng ho¶ng nh− cai s÷a sím vµ tr¸nh c¸c lo¹i kh¸ng sinh th−êng dïng ®Ó ch÷a bÖnh cho con ng−êi. Mét sè kh¸ng sinh khi sö dông víi hµm l−îng cao g©y ra t×nh tr¹ng kh¸ng kh¸ng sinh, g©y khã kh¨n cho c«ng t¸c phßng chèng bÖnh tËt cho gia cÇm, gia sóc. L−îng tån d− v−ît møc cho phÐp kh¸ng sinh trong thùc phÈm võa ¶nh h−ëng tíi gi¸ trÞ c¶m quan cña mãn ¨n l¹i võa cã h¹i tíi søc khoÎ ng−êi tiªu dïng. T¹i phiªn häp cña Héi ®ång chuyªn gia JECFA cña FAO/WHO ®−îc tæ chøc n¨m 1999 t¹i Rome, Italia nh»m ®¸nh gÝa tån d− mét sè thuèc thó y trong thùc phÈm ®· ®−a ra giíi h¹n l−îng ¨n vµo hµng ngµy cã thÓ chÊp nhËn vµ giíi h¹n tèi ®a cho phÐp cña mét sè kh¸ng sinh. Víi Dihydrostreptomycin/streptomicin l−îng ¨n vµo hµng ngµy cã thÓ chÊp nhËn lµ 0-50 ppb theo träng l−îng vµ giíi h¹n tån d− tèi ®a cho phÐp trong thÞt lîn, thÞt gµ, thÞt bß (thÞt b¾p) kÓ c¶ gan lµ 600 ppb, cßn trong thËn lµ 1000 ppb. L−îng ¨n vµo hµng ngµy cã thÓ chÊp nhËn ®èi víi Neomycin lµ 0-60 ppb theo träng l−îng vµ giíi h¹n tån d− tèi ®a cho phÐp trong thÞt bß, lîn, gµ lµ 500 ppb, l−îng tån d− cho phÐp trong gan, thËn cao h¬n 3-4 lÇn so víi thÞt b¾p [3, 14, 16]. GÇn ®©y ë ViÖt Nam, mét sè nghiªn cøu ®· ®Ò cËp ®Õn vÊn ®Ò d− l−îng kh¸ng sinh nhãm tetracycline trong thÞt vµ phñ t¹ng [15]. KÕt qu¶ kh¶o s¸t cho thÊy r»ng, khi sö dông thøc ¨n nu«i lîn chøa chlortetracyclin víi hµm l−îng 110 ppm hoÆc 330 ppm trong kho¶ng thêi gian liªn tôc 31 vµ 98 ngµy t−¬ng øng th× d− l−îng chlortetracyclin trong gan vµ thËn cao gÊp 10 lÇn d− l−îng trong phÇn thÞt mì. Nghiªn cøu t−¬ng tù ë gµ còng cho thÊy khi cho gµ ¨n thøc ¨n chøa 220 ppm chlortetracyclin, l−îng tån d−, sau khi ngõng cho ¨n, ë gan vµ thËn lµ 0,66 vµ 0,42 (ppm) t−¬ng øng, trong khi tån d− ë phÇn da cã dÝnh mì chØ lµ 0,02 ppm. Nh÷ng nghiªn cøu nµy còng cho thÊy sau mét ngµy ngõng cho ¨n thøc ¨n cã chøa chlortetracyclin, kh«ng cßn ph¸t hiÖn thÊy tån d− kh¸ng sinh nµy trong thÞt. Do vËy, nÕu trong thøc ¨n ch¨n nu«i cã chøa chlortetracyclin th× viÖc c¸ch ly gia cÇm víi thøc ¨n ®ã 1-2 ngµy lµ cÇn thiÕt. Carbadox vµ olaquindox lµ 2 lo¹i kh¸ng sinh nhanh chãng ph©n hñy trong c¬ thÓ ®éng vËt ®Ó t¹o thµnh desoxycarbadox ë gan vµ thËn nh−ng bÒn ë trøng vµ phÇn thÞt [2, 5]. Quinoxaline-2-carboxylic acid (QCA) lµ chÊt chuyÓn hãa chÝnh cña carbadox. §èi víi olaquindox, c¸c chÊt chuyÓn hãa t×m thÊy lµ kh¸c nhau ë c¸c m« kh¸c nhau vµ còng kh¸c 8
nhau ë c¸c lo¹i vËt nu«i. ChÊt nµy ®−îc hÊp thu nhanh chãng ë ®−êng ruét vµ th¶i trõ qua ®−êng n−íc tiÓu. ë lîn, khi bæ sung olaquindox vµo thøc ¨n víi hµm l−îng 60 ppm, sau 28 ngµy tån d− olaquindox cßn d−íi 0,005 ppm ë phÇn thÞt vµ d−íi 0,01 ppm trong thËn. Trong nhiÒu n¨m qua, mét sè lo¹i hocmon vµ c¸c dÉn suÊt cña nã ®· ®−îc bæ sung vµo thøc ¨n ch¨n nu«i nh»m kÝch thÝch t¨ng tr−ëng cho gia cÇm, gia sóc [8,9,10]. Khi trén thyroxin vµo thøc ¨n víi l−îng nhá 40-60 (ppm) cã t¸c dông t¨ng tr−ëng râ rÖt ®èi víi gia cÇm, gia sóc ®ang ë trong t×nh tr¹ng thiÕu hôt iod hoÆc khÈu phÇn ¨n hµng ngµy kh«ng c©n ®èi c¸c chÊt dinh d−ìng. NÕu kÐo dµi thêi gian sö dông thøc ¨n ch¨n nu«i cã bæ sung thyroxin vµ kh«ng ®ñ thêi gian c¸ch ly tr−íc khi giÕt mæ 10 ngµy th× l−îng tån d− thyroxin cã thÓ v−ît møc cho phÐp, vi ph¹m c¸c quy ®Þnh vÒ chÊt l−îng vÖ sinh an toµn thùc phÈm [23]. Mét sè lo¹i néi tiÕt tè sinh dôc progesteron, testosteron, 17β-estradiol còng ®· ®−îc dïng ®Ó bæ sung vµo thøc ¨n ch¨n nu«i víi môc ®Ých t¨ng träng vµ n©ng cao hiÖu qu¶ cña thøc ¨n. Tuy nhiªn, trong nh÷ng n¨m 50-60 cña thËp kû tr−íc do thiÕu thËn träng khi ®−a hocmon vµo thøc ¨n ch¨n nu«i nªn hµng chôc n¨m sau t¹i mét sè n−íc ph¸t triÓn nh− Thuþ ®iÓn, Anh, Ph¸p, Scotland...ng−êi ta ®· nhËn thÊy hËu qu¶ râ rÖt cña nã ®Õn t×nh tr¹ng vÖ sinh an toµn thùc phÈm cã liªn quan ®Õn søc khoÎ céng ®ång. HiÖn t−îng ®ång tÝnh luyÕn ¸i t¨ng, gi¶m mËt ®é tinh trïng, tinh hoµn lÖch, Èn ë trÎ em trai vµ tuæi dËy th× ë trÎ em g¸i sím h¬n. §Õn n¨m 1989, c¸c n−íc nµy chØ cho phÐp sö dông testosteron, estradiol trong ®iÒu trÞ bÖnh. §Õn n¨m 1999, ng−êi ta ®· th«ng b¸o nguy c¬ g©y ung th− cña 17β- estradiol nªn còng kh«ng dïng bæ sung vµo thøc ¨n ch¨n nu«i víi môc ®Ých t¨ng träng [1,2]. Ph−¬ng ph¸p S¾c Ký Láng HiÖu N¨ng Cao hiÖn nay ®· ®−îc ¸p dông t¹i mét sè phßng ph©n tÝch thùc phÈm, ®Ó x¸c ®Þnh nhiÒu lo¹i chÊt kÝch thÝch t¨ng tr−ëng, trong ®ã cã c¸c hocmon steroid [22, 28]. §Ó ph©n tÝch b»ng s¾c ký, mÉu sau khi chiÕt xuÊt, ®−îc lµm s¹ch vµ lµm giµu tr−íc khi t¹o dÉn xuÊt dÔ bay h¬i, th«ng th−êng lµ silyl hãa. Qu¸ tr×nh lµm s¹ch th−êng rÊt phøc t¹p, tèn thêi gian vµ dung m«i, v× vËy nhiÒu t¸c gi¶ ®· nghiªn cøu ®Ó c¶i tiÕn quy tr×nh lµm s¹ch nh− ¸p dông c¸c vËt liÖu chiÕt pha r¾n ®Ó gi¶m thêi gian ph©n tÝch vµ l−îng hãa chÊt sö dông. ViÖc ph©n tÝch c¸c hocmon trong thÞt ®éng vËt cßn phøc t¹p h¬n nhiÒu, v× vËy th−êng ph¶i kÕt hîp ph−¬ng ph¸p chiÕt xuÊt láng láng vµ chiÕt xuÊt pha r¾n, mét sè t¸c gi¶ cßn kÕt hîp chiÕt pha r¾n víi lµm s¹ch qua s¾c ký láng tr−íc khi dÉn xuÊt vµ ph©n tÝch. Qua kh¶o s¸t c¸c lo¹i thøc ¨n trªn thÞ tr−êng vµ c¸c ®iÒu kiÖn ch¨m sãc, ®Ò phßng dÞch bÖnh cho gia cÇm, gia sóc ë n−íc ta hiÖn nay [1,2,5], ®Ò tµi ®· tËp trung ph©n tÝch tån d− c¸c kh¸ng sinh nhãm tetracyclin, olaquindox, carbadox; c¸c hocmon steroid vµ tæng hîp bao gåm testosteron, progesteron, oestradiol, trenbolon, dexamethason. 9
3. §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 3.1. ThiÕt kÕ nghiªn cøu - Tham kh¶o c¸c tµi liÖu ph©n tÝch Quèc tÕ vÒ thuèc thÝch thÝch t¨ng tr−ëng (kh¸ng sinh vµ hocmon) trong thùc phÈm; ¸p dông x©y dùng Quy tr×nh kü thuËt kiÓm nghiÖm tèi −u phï hîp dùa vµo ®iÒu kiÖn, trang thiÕt bÞ hiÖn cã cña Phßng Thö nghiÖm ViÖn Dinh d−ìng; vµ sau khi tiÕn hµnh thÈm ®Þnh ph−¬ng ph¸p nÕu ®¹t ®é tin cËy vµ chÝnh x¸c; ¸p dông ph©n tÝch 150 mÉu thÞt gia sóc gia cÇm t¹i c¸c chî trong ®iÓm vµ c¬ së ch¨n nu«i t¹i Hµ Néi. - Kh¶o s¸t c¸c lo¹i thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng vµ thøc ¨n gia sóc gia cÇm cã b¸n trªn thÞ tr−êng Hµ néi thuéc thuéc Nhµ n−íc, doanh nghiÖp, thÞ tr−êng tù do vµ tham kh¶o tham chiÕu tiªu chuÈn vÒ hµm l−îng cho phÐp l¬n nhÊt tån d− thuèc trong thÞt vµ s¶n phÈm thÞt cña gia sóc gia cÇm theo tiªu chuÈn Quèc tÕ, tiÕn tíi tõng b−íc x©y dùng tiªu chuÈn cña ViÖt nam. - Dùa vµo c¸c tµi liÖu tr−íc ®©y vµ hiÖn cã trong vµ ngoµi n−íc, ®−a ra tµi liÖu vÒ thøc ¨n ch¨n nu«i vµ an toµn cho ng−êi sö dông thÞt gia sóc gia cÇm vÒ VÖ sinh an toµn thùc phÈm. - T− vÊn vÒ qu¶n lý, kiÓm so¸t chÊt l−îng vµ VSATP ®èi víi thøc ¨n ch¨n nu«i vµ thÞt gia sóc gia cÇm. 3.2. Chän mÉu, cì mÉu vµ ®èi t−îng nghiªn cøu *§èi t−îng nghiªn cøu Mua mÉu thÞt vµ phñ t¹ng gia sóc gia cÇm t−¬i sèng ngay sau giÕt mæ t¹i c¸c chî träng ®iÓm ph©n phèi thùc phÈm lín (Chî Hµng BÌ, chî H«m, chî M¬, chî Tr−¬ng §Þnh, chî Thanh Xu©n) vµ t¹i c¸c c¬ së ch¨n nu«i (Sãc S¬n, Tõ Liªm). *Cì mÉu - 20 mÉu gia sóc, gia cÇm x 05 chî = 100 mÉu - 25 mÉu gia sóc, gia cÇm x 02 c¬ së ch¨n nu«i = 50 mÉu Cì mÉu ®−îc tÝnh theo c«ng thøc sau: Z2 x p x (1- p) n = ----------------- e2 Trong ®ã : n: tæng sè mÉu cÇn thu thËp Z: 1,96 víi kho¶ng tin cËy 95% e: sai sè cho phÐp, th−êng lµ 5% p: tû lÖ mÉu nhiÔm, −íc tÝnh theo c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu trªn thÕ giíi lµ 10%. 10
Thay c¸c sè ®· biÕt vµo c«ng thøc trªn ta tÝnh ®−îc cì mÉu lµ: 1,96)2 x 0,1 x (1- 0,1) n = ------------------------- = 138 (0,05)2 §Ò phßng s¬ suÊt lµm háng mÉu 8-10% lµ 12 mÉu, vËy cì mÉu ph¶i thu thËp lµ: n = 138 mÉu + 12 mÉu = 150 mÉu * Chọn mẫu và kü thuËt lÊy mÉu theo (TCVN 4833-1:2002) MÉu thÞt, gan cña gµ vµ lîn ®−îc thu thËp ®¹i diÖn ë c¸c chî néi thµnh gian tõ 8-10 giê s¸ng vµ 2 c¬ së ch¨n nu«i t¹i Sãc s¬n vµ Tõ liªm, Hµ Néi trong ngµy. Mçi mÉu thÞt gµ (thÞt ®ïi vµ thÞt l−ên), mÉu thÞt lîn (thÞt vai vµ thÞt l¹c) ®−îc lÊy tèi thiÓu lµ 500g, mÉu gan tèi thiÓu lµ 300g, ®ùng vµo tói polyetylen s¹ch, b¶o qu¶n l¹nh trong hép xèp, ®−a ngay vÒ phßng thÝ nghiÖm trong thêi gian kh«ng qu¸ 3 giê. T¹i phßng thÝ nghiÖm, mÉu ®−îc tiÕn hµnh xö lý s¬ bé vµ c©n lÊy l−îng mÉu ph©n tÝch ngay trong ngµy, mÉu cßn l¹i ®−îc l−u gi÷ trong hép nhùa kÝn cã l¾p vµ ®−îc b¶o qu¶n ë nhiÖt ®é -200C tñ l¹nh ®«ng [3]. 3.3. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 3.3.1. ChØ tiªu nghiªn cøu - X©y dùng quy tr×nh ph©n tÝch chØ tiªu hµm l−îng thuèc kh¸ng sinh, hocmon - §¸nh gi¸ thùc tr¹ng tån d− thuèc trong thÞt gia sóc gia cÇm trªn ®Þa bµn Hµ Néi. - X¸c ®Þnh danh môc thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng vµ c¸c lo¹i thøc ¨n gia sóc gia cÇm (nguyªn liÖu, thuèc phèi trén, phô gia). - Qu¶n lý sö dông thuèc trong ch¨n nu«i vµ an toµn cho ng−êi tiªu dïng 3.3.2. Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh c¸c chØ tiªu nghiªn cøu Tham chiÕu c¸c tµi liÖu ph©n tÝch trong vµ ngoµi n−íc, ®Ó x©y dùng quy tr×nh ph©n tÝch thuèc kÝch thÝch t¨ng tr−ëng víi ®iÒu kiÖn hiÖn t¹i cña Phßng kiÓm nghiÖm thùc phÈm- ViÖn Dinh d−ìng cã ®¸nh gi¸ c¸c th«ng sè thÈm ®Þnh cña ph−¬ng ph¸p. Sau ®ã ¸p dông Quy tr×nh ph©n tÝch l−îng tån d− thuèc kh¸ng sinh vµ hocmon trong thÞt gia sóc, gia cÇm 3.3.2.1. Ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch tetracyclin, oxytetracyclin vµ chlortetracyclin a) Nguyªn lý MÉu ®−îc chiÕt víi ®Öm McIlvaine vµ TCA vµ lµm s¹ch b»ng chiÕt pha r¾n RP-C18- Supelco. X¸c ®Þnh tetracyclin trong gia sóc gia cÇm b»ng HÖ thèng s¾c ký láng víi detect¬ PDA ë b−íc sãng 365nm. Pha ®éng 0,01M axÝt oxalic-axetonitri-metanol (80:13:7,v:v:v), cét s¾c ký láng pha ng−îc RP-C18 (250 x 4,6mm x 5µm). 11
b) Ph¹m vi ¸p dông Quy tr×nh nµy ¸p dông cho c¸c lo¹i thùc phÈm t−¬i cã nguån gèc ®éng vËt. c) Tµi liÖu tham chiÕu A.L. Cinquina, F. Longo, G. Anastasi, L. Giannetti, R. Cozzani (2003). Validation of a high- performance liquid chromatography method for the determination of oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline and doxycycline in bovine milk and meat. Journal of Chromatography A, 987: 227-233[11]. d) Dông cô, thiÕt bÞ HÖ thèng s¾c ký láng Breeze/Water víi c¸c detecto UV 2487 vµ b¬m 1525 HÖ thèng s¾c ký láng Empower b¬m mÉu tù ®éng, víi detecto PDA 2996 vµ detecto huúnh quang 2487. Cét Symmetry C18 (Waters -Mü), 5µm x 4,6mm x 150mm, kÌm b¶o vÖ cét Symmetry Guard C18. d). Hãa chÊt, dung m«i, dung dÞch ®Öm C¸c hãa chÊt vµ dung m«i thuéc lo¹i tinh khiÕt ph©n tÝch: Etanol (Prolabo - Ph¸p) Metanol, axetonitril (J.T. Baker - Mü) n-hexan vµ axÝt clohydric (Merck - §øc). ChÊt chuÈn tetracyclin C22H24N208/444,43; oxytetracyclin C22H24N209/460,44; vµ chlortetracyclin C22H23ClN208/470,84 (Sigma-Mü). Dung dÞch ®Öm : §Öm McIlvaine pH 4±0.05: C©n 28,4 g Na2HPO4 cho vµo b×nh ®Þnh møc 1l vµ hoµ tan b»ng n−íc cÊt råi ®Þnh møc tíi v¹ch, l¾c ®Òu hçn hîp. C©n 21,0 g axÝt xitric monohydrat vµo b×nh ®Þnh møc 1l kh¸c, hoµ tan b»ng n−íc cÊt vµ ®Þnh møc tíi v¹ch, l¾c kü. LÊy 1l axÝt xitric ë trªn trén víi 625 ml Na2HPO4 trong b×nh 2l. §iÒu chØnh pH tíi 4±0,05 b»ng c¸ch thªm tõng giät HCl 0,1M (8,3ml HCl ®Æc/l) hoÆc NaOH 0,1M (4g/l). Dung dÞch nµy sö dông ®−îc trong 1 tuÇn. Dung dÞch ®Öm McIlvaine–EDTA: thªm 6,05 g Na2EDTA.2H2O vµo 1,625 L ®Öm McIlvaine vµ trén hçn hîp tíi khi tan hÕt. Dung dÞch nµy sö dông ®−îc trong 1 tuÇn. AxÝt oxalic trong metanol: hoµ tan 1,26 g axÝt oxalic ( lo¹i s¾c ký) trong b×nh ®Þnh møc 1l, pha lo·ng dung dÞch tíi v¹ch møc b»ng metanol vµ trén ®Òu hçn hîp. Dung dÞch ®−îc sö dông trong 1 ngµy. e) Pha dung dÞch chuÈn - Dung dÞch chuÈn kh¸ng sinh nhãm tetracyclin: pha dung dÞch chuÈn ë ®iÒu kiÖn 12
tr¸nh ¸nh s¸ng trùc tiÕp vµ b¶o qu¶n trong b×nh mµu n©u. Dung dÞch chuÈn gèc 1000 ppm: c©n 100 ± 0,1mg c¸c chÊt chuÈn tetracyclin, oxytetracyclin vµ chlortetracyclin vµo tõng cèc 50ml, hoµ tan vµ chuyÓn vµo b×nh ®Þnh møc 100ml, ®Þnh møc b»ng MeOH ë nhiÖt ®é phßng, l¾c kü. C¸c dung dÞch chuÈn gèc b¶o qu¶n ë 40C cã thÓ sö dông ®−îc trong 3 th¸ng. Hçn hîp dung dÞch chuÈn gèc 100 ppm: lÊy 10ml mçi dung dÞch chuÈn gèc 1000 ppm ë trªn cho vµo 1 b×nh ®Þnh møc 100ml, pha lo·ng tíi v¹ch møc b»ng metanol ë nhiÖt ®é phßng vµ l¾c kü hçn hîp. B¶o qu¶n ë 40C. Dung dÞch chuÈn lµm viÖc c¸c kh¸ng sinh nhãm tetracyclin 25 ppm: lÊy 2,5ml dung dÞch chuÈn hçn hîp gèc hµm l−îng 100 ppm vµo trong b×nh ®Þnh møc 10ml, ®Þnh møc tíi v¹ch b»ng MeOH ë nhiÖt ®é phßng, l¾c ®Òu hçn hîp. B¶o qu¶n ë 40C, pha míi dung dÞch nµy hµng tuÇn. Dung dÞch chuÈn c¸c kh¸ng sinh nhãm tetracyclin ch¹y s¾c ký 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 vµ 1,0 (ppm): lÊy 20; 40; 100; 200 vµ 400 (µl) chuÈn hçn hîp tetracycline lµm viÖc cho vµo c¸c b×nh ®Þnh møc 10ml. Thªm 6ml axÝt oxalic trong metanol vµo mçi b×nh. §Þnh møc tíi v¹ch b»ng n−íc cÊt ë nhiÖt ®é phßng vµ l¾c kü hçn hîp. B¶o qu¶n ë 40C, pha míi hµng ngµy. f) X©y dùng ®−êng chuÈn §−êng chuÈn c¸c kh¸ng sinh tetracyclin, oxytetracyclin vµ chlortetracyclin ®−îc x©y dùng b»ng c¸ch ph©n tÝch d·y chuÈn kh¸ng sinh cã nång ®é tõ 0,05 ®Õn 1 (ppm). §−êng chuÈn vµ ph−¬ng tr×nh håi quy tuyÕn tÝnh ®èi víi tõng lo¹i kh¸ng sinh ®−îc x¸c ®Þnh ë c¸c h×nh d−íi ®©y. §−êng chuÈn oxytetracycline §−êng chuÈn tetracycline DiÖn tÝch DiÖn tÝch 90000 y = 83716x + 121.76 90000 y = 83881x + 755.19 80000 R2 = 0.9998 80000 R2 = 0.9997 70000 70000 60000 60000 50000 50000 40000 40000 30000 30000 20000 20000 10000 ppm 10000 ppm 0 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 §−êng chuÈn chlortetracycline DiÖn tÝch 35000 y = 31515x + 29.08 30000 R2 = 0.9981 25000 20000 15000 10000 5000 ppm 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 g) C¸c b−íc tiÕn hµnh 13
ChiÕt vµ lµm s¹ch mÉu: C©n 5,00 ± 0,05g mÉu vµo b×nh nãn cã nót mµi 50ml, thªm 20ml dung dÞch ®Öm McIlvaine EDTAvµ siªu ©m l¹nh trong 30 phót (hoÆc l¾c m¹nh b»ng m¸y l¾c ngang trong 30 phót). G¹n lÊy dÞch trong vµo b×nh nãn kh¸c, b· ®−îc chiÕt 2 lÇn nh− trªn mçi lÇn b»ng 5ml dung dÞch ®Öm McIlvaine-EDTA, gép dÞch trong vµo b×nh nãn, thªm 3ml axÝt tricloaxetic 0,5g/ml võa cho võa l¾c nhÑ trong kho¶ng 1 phót. §Ó b×nh nãn vµo n−íc ®¸ 15 phót, läc thu lÊy dÞch trong vµo b×nh nãn 30ml. DÞch läc sau ®ã ®−îc cho qua cét SPE-C18 (ho¹t ho¸ b»ng 6ml MeOH, 6ml n−íc cÊt: 2 lÇn). Röa cét SPE b»ng 10ml n−íc cÊt, hót ch©n kh«ng ®Õn kh«. Röa gi¶i b»ng 2ml MeOH. DÞch röa gi¶i ®−îc b¬m vµo cét t¸ch s¾c ký láng ®Ó x¸c ®Þnh tetracyclin, oxytetracyclin vµ chlortetracyclin. Quy tr×nh ph©n tÝch ®−îc tãm t¾t nh− sau: Cho 5 g mÉu vµo b×nh nãn 20ml ®Öm McIlvaine Siªu ©m trong 30 phót (hoÆc l¾c m¹nh b»ng m¸y l¾c ngang) Röa b· 5ml ®Öm McIlvaine x 2 lÇn vµ LÆp l¹i chiÕt nh− trªn Gép dÞch läc qua phÔu läc vµo b×nh nãn hoÆc ly t©m l¹nh 4000v/p, 4oC trong 15p 3ml axÝt tricloaxetic 0,5g/ml vµ l¾c nhÑ trong 1 phót; ®Ó l¹nh 15 phót vµ läc Läc dÞch mÉu qua phÔu läc vµo b×nh nãn 30ml hoÆc ly t©m l¹nh 4000v/p, 4oC trong 15p ho¹t ho¸ 3ml dÞch läc mÉu 6ml MeOH Lµm s¹ch qua cét SPE-C18 6ml n−íc cÊt Röa t¹p: 3ml H2O cÊt x 3 lÇn, sau ®ã hót ch©n kh«ng ®Õn kh« Röa gi¶i b»ng 2 ml axÝt oxalic trong etanol, cho vµo lä/vial 2 ml B¬m 50µl dÞch cuèi vµo HPLC 14
§iÒu kiÖn s¾c ký: - Dung m«i pha ®éng: 0,01M axÝt oxalic/ACN/ MeOH ( 80/13/7, v/v/v) - NhiÖt ®é cét 300C - Detecto UV 350nm - ThÓ tÝch b¬m 50µl. - Tèc ®é dßng 1ml/phót h) TÝnh kÕt qu¶ D− l−îng c¸c kh¸ng sinh trong mÉu thùc ®−îc tÝnh to¸n dùa vµo ®−êng håi quy tuyÕn tÝnh ®−îc x¸c ®Þnh ë trªn hoÆc theo c«ng thøc sau ®©y: Am Vd Cx = Cc × × Ac m Trong ®ã: Cx: Hµm l−îng mÉu ph©n tÝch (ppm) Cc: nång ®é mÉu chuÈn (ppm) Am: DiÖn tÝch pic mÉu Ac: DiÖn tÝch pic chuÈn Vd: ThÓ tÝch dÞch cuèi (ml) m: khèi l−îng mÉu ph©n tÝch (kg) * Quy tr×nh ph©n tÝch nhãm tetracyclin cã ®é ®óng vµ ®é chÝnh x¸c: - HÖ sè håi quy tuyÕn tÝnh: 0,9997 - HÖ sè thu håi: ®èi víi oxytetracyclin ë nång ®é 25 ((ppm)) lµ 84%; tetracyclin 87%; chlortetracyclin 92%. - Giíi h¹n phÊt hiÖn (LOD): ®èi víi oxytetracyclin 0,027 ppm; víi tetracyclin 0,036 ppm, chlortetracyclin 0,055ppm. - Giíi h¹n ®Þnh l−îng (LOQ): ®èi víi oxytetracyclin 0,09 ppm; tetracyclin 0,12 ppm; víi trenbolone, chlortetracyclin 0,18 ppm ®−îc minh ho¹ ë phÇn thÈm ®Þnh (phô lôc 1) 15
3.3.2.2. Ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch cacbadox a) Nguyªn lý Cacbadox ®−îc chiÕt tõ mÉu thÞt b»ng etanol, sau ®ã lo¹i t¹p b»ng c¸ch chiÕt láng - láng víi dung dÞch ®Öm vµ n-hexan, lµm s¹ch qua cét oxýt nh«m vµ ph©n tÝch b»ng s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao víi detect¬ UV ë b−íc sãng 350nm. b) Ph¹m vi ¸p dông Quy tr×nh nµy ¸p dông cho c¸c lo¹i thùc phÈm cã nguån gèc ®éng vËt. c) Tµi liÖu tham chiÕu MacIntosh AI, Neville GA. (1984). Liquid chromatographic determination of carbadox, desoxycarbadox, and nitrofurazones in pork tissues. J Assoc Off Anal Chem. Sep- Oct; 67(5):958-62 [23]. d) Dông cô, thiÕt bÞ HÖ thèng s¾c ký láng Breeze víi c¸c detect¬ UV 2487 vµ b¬m 1525 HÖ thèng s¾c ký láng Empower b¬m mÉu tù ®éng, víi detect¬ PDA 2996 vµ detecto huúnh quang 2487. Cét Symmetry/Water - C18, (150mm x 4,6mm x 5µm), cét b¶o vÖ Symmetry Guard. e) Hãa chÊt, dung m«i C¸c hãa chÊt vµ dung m«i thuéc lo¹i tinh khiÕt ph©n tÝch: Etanol, etyl axetat (Prolabo-Ph¸p) Metanol, axetonitri (Merck) n-hexan vµ axÝt clohydric, bét oxýt nh«m-Al203, celit (Merck-§øc). ChuÈn carbadox C11H10N404/263,25 (Sigma-Mü) AxÝt metaphotphoric 3.6%, amoni axetat (Prolabo-Ph¸p) §Öm kali dihydrogen photphat (KH2PO4) 0.2 M, pH = 3.5 f) Pha dung dÞch chuÈn Dung dÞch chuÈn gèc cacbadox: 100 ppm pha trong metanol. B¶o qu¶n tr¸nh ¸nh s¸ng o vµ ë 4 C. Dung dÞch chuÈn lµm viÖc: Pha lo·ng tõ chuÈn gèc thµnh c¸c dung dÞch chuÈn cã nång ®é 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; vµ 1,0 (ppm) b»ng metanol. B¶o qu¶n ë 40C. Pha míi hµng ngµy. g) X©y dùng ®−êng chuÈn 16
§−êng chuÈn cacbadox ®−îc x©y dùng b»ng c¸ch ph©n tÝch d·y chuÈn cã nång ®é tõ 0,05 ®Õn 0,5 (ppm). §−êng chuÈn vµ ph−¬ng tr×nh håi quy tuyÕn tÝnh ®èi carbadox ®−îc thÓ hiÖn ë h×nh d−íi ®©y. §−êng chuÈn carbadox DiÖn tÝch 45000 y = 79984x + 2741.7 40000 35000 R2 = 0.9987 30000 25000 20000 15000 10000 5000 ppm 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 h) C¸c b−íc tiÕn hµnh: Quy tr×nh ph©n tÝch cacbadox: 17
C©n 10 g mÉu ®· ®ång nhÊt bét nh·o: 1g bét nh«m 100 ml etanol ChiÕt b»ng m¸y xay trong 10 phót Läc qua mét líp Celit 545, thu lÊy dÞch läc Thªm vµo dÞch läc 25 ml axÝt metaphotphoric 3,6% L¾c ®Òu, c« quay ch©n kh«ng ®Õn kho¶ng 25 ml Thªm 5 ml hexan, l¾c ®Òu, ly t©m Thªm 10 ml KH2PO4 0,2 M Trén ®Òu, thªm n−íc ®Õn 100ml, chuyÓn sang b×nh g¹n ChiÕt 3 lÇn, mçi lÇn b»ng 50 ml etyl axetat Gép dÞch chiÕt h÷u c¬, lo¹i n−íc b»ng Na2SO4 C« quay ch©n kh«ng ®Õn kh« ë 50oC 20 ml etyl axetat Hßa tan b»ng 3 ml etyl axetat röa gi¶i: 20ml EtOH:MeOH:EtAC (10:10:80) Lµm s¹ch qua cét Al203 C« quay dÞch läc ®Õn kh« ë 45oC vµ hßa tan cÆn b»ng 500 µl pha ®éng §iÒu kiÖn ch¹y s¾c ký: - Pha ®éng: axetonitril : amoni axetat 0,01M : etanol (25:70:5), pH 6,8 - Tèc ®é dßng: 1ml/phót - NhiÖt ®é cét: 30oC 18
- Detect¬ UV: b−íc sãng 350 nm i) TÝnh kÕt qu¶ Am Vd Cx = Cc × × Ac m Trong ®ã: Cx: Hµm l−îng mÉu ph©n tÝch (ppm) Cc: nång ®é mÉu chuÈn (ppm) Am: DiÖn tÝch pic mÉu Ac: DiÖn tÝch pic chuÈn Vd: ThÓ tÝch dÞch cuèi (ml) m: khèi l−îng mÉu ph©n tÝch (kg) * Quy tr×nh ph©n tÝch cacbadox cã ®é ®óng vµ ®é chÝnh x¸c: - HÖ sè håi quy tuyÕn tÝnh: 0,9987 - HÖ sè thu håi: víi mÉu n¹p chuÈn nång ®é 0,1 (ppm) lµ 68%. - HÖ sè biÕn thiªn (C. V): 0,005 - Giíi h¹n phÊt hiÖn (LOD): 0,015 (ppm) - Giíi h¹n ®Þnh l−îng (LOQ): 0,051 (ppm) ®−îc minh ho¹ ë phÇn thÈm ®Þnh (phô lôc 2). 19