Bảo quản tế bào gốc tủy răng chuột

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> by inversion - PCR. Five severe Hemophilia A patients were selected for this study; we use Inversion - PCR to analyse intron 22 inversion in F8 gene. 1/5 patients were found to have intron 22<br /> inversion. In conclusion, intron 22 inversion was successfully identified in Vietnamese severe Hemophilia A patients by I - PCR technique.<br /> Keywords: Hemophilia A, inversion intron 22, inversion - PCR<br /> <br /> BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CHUỘT<br /> Tô Minh Quân1, Lê Thị Ngọc Hương1, Hoàng Đạo Bảo Trâm2<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh<br /> 2<br /> Trường Đại học Y - Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> <br /> Tế bào gốc tủy răng chuột nhắt trắng Mus musculus var albino được bảo quản trong môi trường DMEM/<br /> F12 bổ sung DMSO 10%, FBS 20% theo 2 quy trình giảm nhiệt: (1) để trong điều kiện 4oC/20 phút, -20oC/30<br /> phút, sau đó chuyển sang bảo quản ở -80oC; (2) để trong điều kiện -20oC/30 phút và bảo quản ở -80oC. Tế<br /> bào đông lạnh được giải đông trong môi trường nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung FBS 20% ở 370C. Các tế bào<br /> được tiếp tục nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine<br /> 100µg/ml, ở điều kiện 37oC, CO2 5%. Tỷ lệ tế bào sống sau quá trình bảo quản đông lạnh ở thời điểm 1<br /> ngày, 2 tuần, 4 tuần và 8 tuần được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue. Sự biểu hiện các<br /> marker bề mặt tế bào được kiểm tra bằng phương pháp Flow Cytometry. Thử nghiệm cho thấy tế bào tủy<br /> răng chuột được bảo tốt trong thời gian 4 tuần theo quy trình đông lạnh -20oC/20 phút và bảo quản ở -80oC.<br /> Sau khi giải đông, các tế bào có khả năng bám, tăng trưởng và biểu hiện các marker của tế bào gốc trung<br /> mô CD73, CD90, CD105 và không biểu hiện các marker của tế bào máu CD19, CD34, CD45.<br /> Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, bảo quản tế bào, nuôi cấy tế bào<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa<br /> trong mô sống, có khả năng trở thành các tế<br /> bào chuyên biệt với các chức năng đặc trưng<br /> [1]. Trong điều kiện in vivo hoặc in vitro, mỗi tế<br /> bào gốc có thể tự làm mới với các tính năng<br /> riêng biệt mới. Ngày nay, tế bào gốc được<br /> tách và thu nhận từ rất nhiều nguồn (phôi giai<br /> đoạn tiền làm tổ, thai, cơ thể trưởng thành,..).<br /> Tủy răng là vùng tế bào giúp răng sống và duy<br /> Địa chỉ liên hệ: Hoàng Đạo Bảo Trâm, Đại học Y Dược Tp<br /> Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, Quận 5, TpHCM<br /> email: hoangdaobaotram@gmail.com<br /> Ngày nhận: 13/03/2013<br /> Ngày được chấp thuận: 20/6/2013<br /> <br /> 20<br /> <br /> trì chức năng. Tương tự như tủy xương, tủy<br /> răng chứa các tế bào gốc trung mô. Ngoài ra,<br /> tủy răng còn chứa tế bào tiền nguyên bào<br /> ngà, tế bào tạo máu. Tế bào tủy răng là<br /> nguyên liệu quan trọng cho những nghiên cứu<br /> trong lĩnh vực tái tạo răng. Sau thành công<br /> của Gronthos năm 2000 trong việc phân lập<br /> và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng người [2], trên<br /> thế giới đã có nhiều nghiên cứu tiếp tục phát<br /> triển theo hướng này. Tại Việt Nam, một số<br /> nghiên cứu đã cho kết quả nuôi cấy thành<br /> công tế bào từ mảnh mô tủy răng người [3; 4].<br /> Song song với việc phân lập tế bào gốc, kỹ<br /> thuật bảo quản tế bào gốc động vật cũng phát<br /> triển và mở ra một kỷ nguyên mới trong công<br /> nghệ tế bào động vật. Với mục tiêu xuyên suốt<br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> là lưu giữ tế bào trong trạng thái nguyên vẹn<br /> <br /> Tế bào gốc tủy răng được thu nhận bằng<br /> <br /> theo thời gian và có thể sử dụng sau này cho<br /> các mục đích nghiên cứu hay điều trị, việc bảo<br /> <br /> phương pháp tách với Trypsin/EDTA 0,25%;<br /> 0,02%. Tế bào gốc tủy răng được bảo quản<br /> <br /> quản tế bào gốc động vật bao hàm nhiều ý<br /> nghĩa thực tiễn: giảm thiểu sự biến đổi gen,<br /> <br /> trong môi trường DMEM/F12 bổ sung DMSO<br /> (Dimethyl Sulfoxide) 10%, FBS 20%. Tế bào<br /> <br /> ngăn cản biệt hóa tế bào, giảm nguy cơ nhiễm<br /> khuẩn và chết tế bào, giảm nhiễm chéo các<br /> <br /> được đông lạnh theo 2 quy trình nhiệt:<br /> Quy trình 1: mẫu lần lượt trải qua các giai<br /> <br /> dòng tế bào, giảm nguy cơ biến đổi cấu trúc<br /> <br /> đoạn ở điều kiện 4oC trong 20 phút và -20oC<br /> <br /> và thay đổi hình thái, giảm chi phí nuôi cấy [1].<br /> Về lý thuyết, tế bào gốc có khả năng phân<br /> <br /> trong 30 phút, sau đó chuyển sang bảo quản<br /> ở điều kiện -80oC;<br /> <br /> chia vô hạn, song nhiều nghiên cứu cho thấy<br /> khi các tế bào phân chia nhiều lần trong<br /> <br /> Quy trình 2: mẫu trải giai đoạn ở điều kiện<br /> -20oC trong 20 phút, sau đó chuyển sang bảo<br /> <br /> những khoản thời gian dài, có thể xảy ra các<br /> bất thường về nhiễm sắc thể. Trong khi đó, kỹ<br /> <br /> quản ở điều kiện -80oC.<br /> <br /> thuật phân lập các dòng tế bào gốc rất khó<br /> <br /> tuần, 8 tuần, tế bào được tiến hành giải đông<br /> trong môi trường nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung<br /> <br /> khăn, do vậy việc bảo quản tế bào gốc là rất<br /> cần thiết nhằm phục vụ các mục đích nghiên<br /> cứu và ứng dụng. Một số kỹ thuật bảo quản tế<br /> bào gốc được áp dụng phổ biến là kỹ thuật<br /> đông lạnh và kỹ thuật đông khô [1]. Nghiên<br /> cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu: bảo<br /> quản tế bào gốc của tủy răng chuột áp dụng<br /> <br /> Sau thời gian đông lạnh 1 ngày, 2 tuần, 4<br /> <br /> FBS 20%. Tỷ lệ sống chết tế bào được xác<br /> định bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue,<br /> sự biểu hiện marker CD73, CD90, CD105,<br /> CD19, CD34, CD45 được đánh giá bằng<br /> phương pháp Flow Cytometry.<br /> <br /> quy trình nhiệt.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> Tỷ lệ tế bào sống khi giải đông và nuôi<br /> cấy sau bảo quản<br /> <br /> Tế bào gốc tủy răng chuột nhắt trắng Mus<br /> musculus var. albino được thu nhận bằng<br /> <br /> Tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản đông lạnh<br /> <br /> phương pháp nuôi cấy mảnh mô tủy răng<br /> trong môi trường DMEM/F12 (Sigma) bổ sung<br /> <br /> 1 ngày theo hai quy trình đều cao (> 90%),<br /> không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê<br /> <br /> huyết thanh bào thai bò (FBS) 10% (Sigma),<br /> <br /> (p > 0,05) (bảng 1). Các tế bào đông lạnh sau<br /> <br /> Peniciline 100UI/ml (Sigma), Streptomycine<br /> 100 µg/ml (Sigma) ở điều kiện 37oC, CO2 5%.<br /> <br /> khi giải đông được tiếp tục nuôi cấy trong môi<br /> trường có bổ sung huyết thanh.<br /> <br /> Bảng 1. Tỷ lệ tế bào sống khi giải đông sau bảo quản một ngày<br /> <br /> Tỷ lệ tế bào sống<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> Quy trình 1<br /> 4oC/20’<br /> -20oC/30’<br /> -80oC<br /> <br /> Quy trình 2<br /> <br /> 95%<br /> <br /> 94%<br /> <br /> 97%<br /> <br /> 97%<br /> <br /> 97%<br /> <br /> 98%<br /> <br /> -20oC/30’<br /> -80oC<br /> <br /> 21<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Sau 1 ngày, quan sát được hiện tượng các tế bào bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy, tế bào có<br /> hình dạng tương tự tế bào trước khi đưa vào bảo quản đông lạnh (hình 1). Các tế bào này tiếp<br /> tục tăng sinh trong những ngày nuôi cấy tiếp theo.<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược: tế bào giải đông sau bảo quản<br /> đông lạnh một ngày (a: x40; b: x200)<br /> <br /> Hình 2. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược: tế bào giải đông sau bảo quản<br /> hai tuần (a: x40; b: x200)<br /> Kết quả thu nhận được sau 1 ngày cho<br /> thấy hai quy trình đông lạnh có hiệu quả<br /> tương đương nhau. Tuy nhiên, quy trình 2<br /> đơn giản hơn và tiết kiệm thời gian, do đó<br /> được tiếp tục áp dụng và đánh giá với thời<br /> gian bảo quản dài hơn, ở các thời điểm sau 2<br /> tuần, 4 tuần và 8 tuần.<br /> Tỷ lệ tế bào sống trung bình sau 2 tuần, 4<br /> tuần, 8 tuần bảo quản lần lượt là 95,2%,<br /> 65,6%, 17,3%. Sau 2 tuần bảo quản đông<br /> <br /> lệ tế bào sống giảm còn dưới 20% (bảng 2).<br /> Kết quả cho thấy hiệu quả đông lạnh tế bào<br /> giảm dần theo thời gian.<br /> Sự biểu hiện marker bề mặt tế bào sau<br /> giải đông<br /> Sau khi giải đông và nuôi cấy tế bào đã<br /> được bảo quản đông lạnh trong thời gian 4<br /> tuần, tế bào bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy sau<br /> 1 ngày, các tế bào có hình thái tương tự tế<br /> <br /> lạnh ở -80 C, trung bình tỷ lệ tế bào sống<br /> giảm từ 96,3% còn 95,2%. Sau 4 tuần, tỷ lệ tế<br /> <br /> bào trước bảo quản, với dạng hình thoi, dài<br /> <br /> bào sống trung bình là 65,6%. Sau 8 tuần, tỷ<br /> <br /> tăng trưởng tốt, thời gian đạt được mật độ<br /> <br /> o<br /> <br /> 22<br /> <br /> 100 - 120 µm, rộng 10 - 30 µm. Các tế bào<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> hợp dòng là 7 ngày. Khi tiến hành đánh giá<br /> <br /> biểu hiện dương tính với các marker CD73<br /> <br /> đặc tính của tế bào bằng phương pháp Flow<br /> <br /> (98,08%), CD90 (91,3%), CD105 (98,76%) và<br /> <br /> Cytometry, các tế bào có biểu hiện marker bề<br /> <br /> âm tính với các marker CD19 (0,72%), CD34<br /> <br /> mặt của tế bào gốc trung mô, tiêu chuẩn của<br /> <br /> (0,56%), CD45 (7,65%), tương tự như các tế<br /> <br /> Hiệp hội Quốc tế về tế bào gốc [5]. Tế bào có<br /> <br /> bào nuôi cấy trước bảo quản đông lạnh (hình 3).<br /> <br /> Bảng 2. Mật độ và tỷ lệ tế bào sống khi giải đông sau bảo quản 2, 4 và 8 tuần<br /> Thời gian bảo quản<br /> <br /> 2 tuần<br /> <br /> 4 tuần<br /> <br /> 8 tuần<br /> <br /> Mẫu<br /> <br /> Mật độ tế bào (tb/ống)<br /> <br /> Tỷ lệ tế bào sống<br /> <br /> 1<br /> <br /> 4,88 x 106<br /> <br /> 95,7%<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4,57 x 106<br /> <br /> 93,2%<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4,34 x 106<br /> <br /> 96,6%<br /> <br /> 1<br /> <br /> 4,39 x 106<br /> <br /> 62,9%<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4,06 x 106<br /> <br /> 63,5%<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4,25 x 106<br /> <br /> 70,3%<br /> <br /> 1<br /> <br /> 5,01 x 106<br /> <br /> 15%<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4,16 x 106<br /> <br /> 20%<br /> <br /> 3<br /> <br /> 6<br /> <br /> 17%<br /> <br /> 5,19 x 10<br /> <br /> Hình 3. Kết quả đánh giá marker bề mặt tế bào tủy răng chuột P4 sau bảo quản 4 tuần<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br /> 23<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Trong điều kiện nghiên cứu, chúng tôi<br /> o<br /> <br /> hiện tế bào sinh ung thư. Bảo quản nhằm lưu<br /> <br /> nhận thấy, đối với quy trình bảo quản ở -80 C,<br /> thời gian bảo quản tốt nhất là trong vòng<br /> <br /> giữ tế bào và duy trì các đặc tính của tế bào<br /> giúp chúng ta có thể có được một nguồn tế<br /> <br /> 4 tuần.<br /> <br /> bào gốc có sẵn với số lượng lớn, phục vụ cho<br /> nghiên cứu và các liệu pháp điều trị khi cần.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Tế bào gốc trưởng thành là các tế bào<br /> được thu nhận từ cơ thể trưởng thành. Tế bào<br /> <br /> Bên cạnh đó, quá trình nuôi cấy tế bào đạt<br /> đến giai đoạn tối ưu thường không dễ dàng,<br /> thường bao qua nhiều giai đoạn như nuôi cấy<br /> <br /> gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells MSC) là những tế bào có nguồn gốc trung<br /> <br /> sơ cấp từ mảnh mô, nuôi cấy thứ cấp qua<br /> nhiều thế hệ. Do đó, việc lưu trữ các dòng tế<br /> <br /> mô có khả năng tự phân chia và biệt hóa<br /> <br /> bào giúp tiết kiệm công sức, tiền bạc và thời<br /> gian trong nghiên cứu.<br /> <br /> thành nhiều dòng tế bào như tế bào tạo sụn,<br /> xương, mỡ, cơ và mô liên kết đệm. Do đó,<br /> MSC được xem là nguồn tế bào gốc nhiều<br /> triển vọng cho các phương pháp điều trị bằng<br /> liệu pháp tế bào. MSC được thu từ nhiều<br /> nguồn như tủy xương, máu cuống rốn, mô<br /> mỡ, răng... Trong đó, MSC từ răng là nguồn<br /> tế bào tự thân được thu nhận dễ dàng, ít gây<br /> xâm lấn bệnh nhân và có tiềm năng biệt hóa<br /> thành các loại tế bào răng.<br /> Quần thể tế bào gốc trong tủy răng rất ít;<br /> xấp xỉ 1% tổng số tế bào và quá trình tích tuổi<br /> làm giảm dần khả năng tham gia tạo mô và<br /> làm lành thương của tế bào [6]. Trong các<br /> nghiên cứu in vitro hay các nghiên cứu tiền<br /> lâm sàng hoặc trong các ứng dụng lâm sàng,<br /> lượng tế bào gốc cần sử dụng thường rất lớn.<br /> Việc nuôi cấy cho tế bào gốc tủy răng tăng<br /> sinh có vai trò rất cần thiết trong liệu pháp tế<br /> bào; tuy nhiên, trong quá trình được nuôi cấy<br /> và tăng sinh, các tế bào có nguy cơ mất tính<br /> gốc, cảm ứng tự biệt hóa… Do đó, tế bào gốc<br /> cần được nuôi cấy để đạt được số lượng tế<br /> bào cần thiết trong khoảng thời gian ngắn<br /> nhất với số lần cấy chuyền ít nhất. Đối với<br /> những tế bào đã đạt tới thời điểm tối ưu nhằm<br /> sử dụng trong những nghiên cứu sau hoặc<br /> cho những ứng dụng lâm sàng, việc kéo dài<br /> thời gian nuôi cấy sẽ làm gia tăng khả năng<br /> mất tính gốc tế bào và gia tăng khả năng xuất<br /> <br /> 24<br /> <br /> Trong nghiên cứu của Ding và cộng sự,<br /> các tế bào nhú chóp răng (SCAP) đã được<br /> bảo quản đông lạnh 6 tháng trong nitrogen<br /> lỏng. Các tác giả nhận thấy rằng quy trình<br /> đông lạnh đã thực hiện không ảnh hưởng tới<br /> các đặc điểm hình thái, khả năng tăng sinh và<br /> các đặc tính về kiểu hình của tế bào. Trong 4<br /> loại dung dịch bảo quản bao gồm DMSO 1% +<br /> trehalose 9% + FBS 90%, DMSO 4% + trehalose 6% + FBS 90%, DMSO 8% + trehalose<br /> 2% + FBS 90%, DMSO 10% + FBS 90%,<br /> dung dịch DMSO 4% + trehalose 6% + FBS<br /> 90% là loại dung dịch bảo quản ưu việt nhất,<br /> cho mức độ tế bào sống cao, nâng khả năng<br /> biệt hóa và giảm tác hại của DMSO [7,8].<br /> Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng<br /> nuôi cấy lại tế bào gốc tủy răng sau bảo quản,<br /> các tế bào này duy trì được các đặc tính hình<br /> thái chức năng và khả năng biệt hóa đa dòng<br /> (m ultilineage differentiation) [9; 10; 11].<br /> Nghiên cứu này hướng tới thiết lập quy trình<br /> đông lạnh, giải đông đơn giản, phù hợp với<br /> điều kiện của hầu hết các đơn vị nghiên cứu<br /> và đơn vị lâm sàng. Đối với quá trình bảo<br /> quản, trong môi trường đông lạnh, quy trình<br /> hạ nhiệt, quy trình giải đông đóng vai trò rất<br /> quan trọng trong tính chất tế bào. Môi trường<br /> đông lạnh được sử dụng là môi trường DMSO<br /> 10%. DMSO (Dimethyl Sulfoxide) có những<br /> <br /> TCNCYH 83 (3) - 2013<br /> <br />