Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp. và hướng ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

TRẦN MINH QUÍ BẢO TỒN CHỦNG KÝ SINH TRÙNG

SỐT RÉT Plasmodium spp.

và HƯỚNG ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 60420201

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

TRẦN MINH QUÍ

BẢO TỒN CHỦNG KÝ SINH TRÙNG

SỐT RÉT Plasmodium spp.

và HƯỚNG ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số ngành: 60420201

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM

ngày 1 tháng … năm …

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

TT 1 2 3 4 5 Họ và tên Chức danh Hội đồng Chủ tịch Phản biện 1 Phản biện 2 Ủy viên Ủy viên, Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa

chữa (nếu có).

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

TP. HCM, ngày..… tháng….. năm 20..…

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TRẦN MINH QUÍ Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 10/02/1991 Nơi sinh: Tp. Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học MSHV: 1541880009

I- Tên đề tài:

Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp. và hướng ứng dụng.

II- Nhiệm vụ và nội dung:

 Thu thập và bảo tồn nguồn chủng KST SR bằng cách nuôi cấy chủng KST SR

và bảo quản chủng KST SR trong Nitơ lỏng.

 Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được.

III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2017

IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ:

V- Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS, NGUYỄN TIẾN THẮNG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nghiên cứu “Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét

Plasmodium spp. và hướng ứng dụng” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng.

Đề tài được thực hiện tại khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét – Ký sinh

trùng – Côn trùng Tp. Hồ Chí Minh. Các số liệu, kết quả, đánh giá đưa ra trong luận

văn chưa được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây.

Những kết quả nghiên cứu, số liệu của tác giả khác trích dẫn trong luận văn

này điều được chú thích đầy đủ.

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm với nhà trường về cam đoan này.

Học viên thực hiện Luận văn

(Ký và ghi rõ họ tên)

ii

LỜI CÁM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn:

Trường Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh; Ban lãnh đạo Viện Sốt rét –

Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh; Khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện

Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện

cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng là người Thầy trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành

luận văn.

Các anh chị đồng nghiệp Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ

Chí Minh, Khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, cùng bạn bè, và gia đình đã động viên, giúp đỡ

em trong quá trình hoàn thành luận văn này.

(Họ và tên của Tác giả Luận văn)

iii

TÓM TẮT

Đặt vấn đề:

Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra, bệnh thường

gặp ở các nước thuộc khu vực nhiệt đới. Bệnh truyền từ người bệnh qua người

lành nhờ vật chủ trung gian truyền bệnh là muỗi đòn xóc (muỗi Anopheles). Hiện

nay, có 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người là: Plasmodium

falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, và

Plasmodium knowlesi. Bệnh SR là vấn đề y tế ảnh hưởng đến sức khỏe, điều kiện

kinh tế của người dân sống trong vùng sốt rét lưu hành. Trong những năm gần

đây, tình hình KST SR có chiều hướng giảm mạnh, do đó việc bảo tồn chủng KST

SR Plasmodium spp. là vấn đề quan trọng để phục vụ cho các nghiên cứu đến KST

SR sau này.

Đề tài “Bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp. và hướng ứng

dụng” đã được tiến hành từ tháng 2/2017 đến tháng 8/2017.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là: Bảo tồn nguồn chủng KST SR, bước đầu

xây dựng ngân hàng Gene KST SR và hướng ứng dụng. Đồng thời tiến hành nuôi

cấy chủng KST SR tại phòng thí nghiệm.

Đề tài tập trung vào các nội dung sau:

 Thu thập, lưu trữ và bảo tồn nguồn chủng KST SR trong Nitơ lỏng.

+ Nuôi cấy chủng KST SR tạo chủng thuần tại phòng thí nghiệm các

nguồn máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và

Plasmodium vivax đơn thuần được thu thập từ thực địa.

+ Lưu trữ nguồn mẫu KST SR từ các mẫu thu thập được trong nghiên

cứu, thử nghiệm,...

 Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được.

+ Chạy PCR định danh những mẫu máu nhiễm KST SR.

+ Giải trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome đặc trưng cho từng loài

KST SR.

iv

+ Giải trình tự đoạn Gene kháng thuốc artemisinin đối với chủng

Plasmodium falciparum

Phương pháp thực hiện đề tài:

Đề tài chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu tại tỉnh Bình Phước, đây là vùng

dịch tể SR lưu hành nặng ở khu vực Nam bộ - Lâm Đồng cũng như cả nước.

Với kích cỡ mẫu là 30 mẫu được khẳng định dương tính với KST SR bằng kỹ

thuật nhuộm Giêm – sa. Chúng tôi sẽ định danh lại các chủng thu thập được bằng

kỹ thuật Nested – PCR, giải trình tự. Các chủng được xác định nhiễm P.

falciparum, P. vivax đơn thuần bằng kỹ thuật Nested – PCR sẽ được tiến hành

nuôi cấy dài ngày chủng KST SR bằng phương pháp nuôi bình nến của Trager và

Jensen (1976) với hồng cầu người, môi trường RPMI 1640, 10% huyết thanh AB

trong điều kiện nồng độ 5% CO2 và O2 thấp, ở nhiệt độ 37°C.

Kết quả nghiên cứu:

Trong quá trình tiến hành đề tài, chúng tôi đã thu thập được 30 mẫu máu dương

tính với ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa, tiến hành định danh 30

mẫu KST SR bằng kỹ thuật Nested – PCR và giải trình tự các mẫu thu thập được tại

phòng thí nghiệm.

Bên cạnh đó, với 14 chủng KST SR nhiễm P. falciparum đơn thuần được phân

lập, chúng tôi tiến hành giải trình tự phát hiện 9/14 chủng KST SR P. falciparum

đơn thuần thu thập được tại Bình Phước có đột biến cánh quạt K13 liên quan đến

kháng artemisinin (chiếm 64,3% các chủng P. falciparum đơn thuần).

Với tần suất xuất hiện các điểm đột biến K13 cánh quạt liên quan đến kháng

artemisinin như sau: C447G có 1 chủng chiếm 7,1%; I543T có 1 chủng chiếm tỉ lệ

7,1%; P553L có 3 chủng chiếm 21,4%; C580Y có 4 chủng chiếm 28,6%. Trong đó

đột biến C580Y có tần suất xuất hiện cao ở Bình Phước, cũng như trong các nghiên

cứu khác ở khu vực Cam-pu-chia, Myanmar đã được công bố.

v

ABSTRACT

Background:

Plasmodium spp. is caused of malaria disease, a common disease in the tropical

countries. Disease is spreaded from patient to person healthy by mosquito (Anopheles

spp.). Currently, there are five species of malaria parasites infecting human:

Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium

ovale and Plasmodium knowlesi. Malaria disease is the issues affecting health and

economic conditions of people living in malaria endemic areas. In recent years, the

situation of malaria tends to decline, so conservation species malaria Plasmodium

spp. is very important to help malaria researchers in the future.

Study "Conservation of species Plasmodium spp. and applications" was

conducted from February to August in 2017.

The objective of this research is conservation malaria species, building initially

the bank Gene malaria and applications. Simultaneously, malaria species are cultured

in the Laboratory.

The subject focuses on the following:

 Collecting, storing and conserving strains of Plasmodium spp. in liquid

nitrogen.

+ Culturing Plasmodium strains to produce pure strains on blood at

Labratory, such as: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax isolated from

patients.

+ Plasmodium strains from this research are stored

 Analyzing the gene of malaria parasites from the samples collected.

+ Using PCR method to identify Plasmodium spp.

+ Anlayzing the gene translation to 18S Ribosomes for each species

Plasmodium.

+ Anlayzing the resistant artemisinin gene of P. Falciparum strains.

vi

Methods:

Our study collected samples in Binh Phuoc province, it is the endemic malaria

epidemiology in the South Vietnam - Lam Dong.

We found 30 samples positive with malaria by staining Giem - sa. We will

identifize strains by Nested – PCR method. And then, the strains of Plasmodium spp.

are cultured at Labratory by candle jar method of Trager and Jensen (1976) with

human erythrocytes, RPMI 1640 medium, 10% serum concentrations AB, in terms

5% of CO2 and O2 low, at a temperature 37°C. Finally, storing on liquid nitrogen.

Results:

In this study, we have collected 30 blood samples were positive for Plasmodium

spp. by staining Giem – sa method, identification 30 samples of malaria by Nested -

PCR method and analyzing DNA of samples at Labratory.

With 14 cases injected P. falciparum, we conducted to analyzing DNA to

detected P. falciparum malaria species on 9/14 samples collected in Binh Phuoc has

mutant K13 propeller involving artemisinin resistance (accounting for 64.3% of the

isolates of P. falciparum samples).

With the point mutatant of K13 propeller involving artemisinin resistance as:

C447G 1 strains accounted for 7.1%; 1 strains I543T proportion of 7.1%; P553L

strains accounted for 21.4% 3; C580Y 4 strains of 28.6%. C580Y have high

frequency appearance in Binh Phuoc, as well as in other studies in Cambodia,

Myanmar has been published.

vii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... I

LỜI CÁM ƠN............................................................................................................II

TÓM TẮT ............................................................................................................... III

ABSTRACT .............................................................................................................. V

MỤC LỤC .............................................................................................................. VII

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... X

DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... XI

DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... XII

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 1

1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1

1.2. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1

1.3. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2

1.4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 2

1.5. Ý nghĩa đề tài ........................................................................................................ 3

1.5.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................... 3

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................ 4

1.6. Tổng quan về bệnh sốt rét .................................................................................... 4

1.6.1. Lịch sử phát hiện bệnh sốt rét ....................................................................... 4

1.6.2. Định nghĩa bệnh sốt rét ................................................................................. 5

1.6.3. Sơ lược về dịch tể học sốt rét ........................................................................ 8

1.6.3.1. Tình hình dịch tể sốt rét trên thế giới ...................................................... 8

1.6.3.2. Tình hình dịch tể sốt rét tại Việt Nam ................................................... 10

1.6.3.3. Tình hình dịch tể sốt rét tỉnh Bình Phước ............................................. 13

1.7. Chu kỳ và hình thể của ký sinh trùng sốt rét ...................................................... 14

1.7.1. Giai đoạn phát triển trong cơ thể người ..................................................... 14

1.7.2. Giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi ....................................................... 16

1.8. Tình hình kháng thuốc hiện nay của ký sinh trùng sốt rét ................................. 17

1.8.1. Định nghĩa kháng thuốc .............................................................................. 17

viii

1.8.2. Trên thế giới ................................................................................................ 18

1.8.3. Tại Việt Nam ................................................................................................ 20

1.9. Tình hình nghiên cứu, bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét trên thế giới và

Việt Nam ............................................................................................................. 22

1.9.1. Trên thế giới ................................................................................................ 22

1.9.2. Việt Nam ...................................................................................................... 23

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 24

2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ............................................................... 24

2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ................................................................. 24

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 24

2.2.2. Thiết kế nghiên cứu ..................................................................................... 24

2.2.3. Phương pháp phân tích mẫu ....................................................................... 24

2.2.3.1. Phát hiện KST Plasmodium spp. bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa ........ 25

2.2.3.2. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Nested – PCR .............. 31

2.2.3.2.1. Giới thiệu khái quát về kỹ thuật PCR và phương pháp phát hiện

KST SR bằng kỹ thuật PCR ......................................................................... 31

2.2.3.2.2. Kỹ thuật tách chiết DNA KST SR Plasmodium spp. ....................... 33

2.2.3.2.3. Kỹ thuật Nested – PCR phát hiện KST SR: ..................................... 35

2.2.3.2.4. Kỹ thuật Nested – PCR để phát hiện điểm đột biến K13 liên quan

đến kháng artemisinin ................................................................................. 36

2.2.3.2.5. Đọc kết quả điện di:.......................................................................... 37

2.2.3.3. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật giải trình tự .................. 38

2.2.3.4. Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm DNA để giải trình tự ............................... 39

2.2.3.4.1. Kỹ thuật PCR giải trinh tự ............................................................... 40

2.2.3.4.2. Phân tích kết quả giải trình tự: ........................................................ 41

2.2.4. Kỹ thuật cất đông chủng ký sinh trùng sốt rét ............................................. 42

2.2.5. Kỹ thuật nuôi cấy dài ngày để tạo chủng Plasmodium spp. thuần ............. 42

2.2.5.1. Kỹ thuật nuôi cấy chủng P. falciparum thuần: ...................................... 43

2.2.5.2. Kỹ thuật nuôi cấy chủng P. vivax thuần ................................................ 43

ix

2.4.5.3. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 43

2.4.5.4. Chuẩn bị hồng cầu lành ......................................................................... 44

2.4.5.5. Chuẩn bị huyết thanh nuôi cấy .............................................................. 44

2.4.5.6. Phá đông chủng KST SR Plasmodium spp. .......................................... 45

2.2.6. Điều kiện nuôi cấy ....................................................................................... 45

2.2.6.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro Plasmodium spp. ....................................... 45

2.2.6.2. Điều kiện trong lấy mẫu tại thực địa ..................................................... 46

2.3. Thống kê và xử lý số liệu ................................................................................... 47

2.4. Y đức .................................................................................................................. 47

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................. 48

3.1. Kết quả xác thu thập mẫu và xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật

nhuộm giêm – sa ................................................................................................. 48

3.2. Kết quả xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Nested – PCR ............... 50

3.3. Kết quả giải trình tự Plasmodium spp. ............................................................... 53

3.4. Kết quả giải trình tự kháng K13 ......................................................................... 55

3.5. Kết quả nuôi cấy chủng Plasmodium spp. thuần bằng phương pháp nuôi cấy

trong phòng nuôi cấy tại phòng thí nghiệm ........................................................ 57

3.6. Kết quả bảo tồn chủng sốt rét Plasmodium spp. và phát hiện kháng K13 liên

quan đến kháng artemisinin. ............................................................................... 59

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 60

4.1. Kết luận ............................................................................................................... 60

4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 62

PHỤ LỤC ................................................................................................................. 70

x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

: Amino acid AA

: Dung dịch chống đông máu ACD

: An toàn sinh học ATSH

: Bộ Y tế BYT

: Bệnh nhân sốt rét BNSR

Hồng cầu O : Hồng cầu của người nhóm máu O

Huyết thanh AB : Huyết thanh của người nhóm máu AB

Huyết thanh O : Huyết thanh của người nhóm máu O

: Ký sinh trùng KST

: Kính hiển vi KHV

: Nuôi cấy NC

: Ngân hàng Gene thế giới NCBI

Nested – PCR : Phản ứng PCR lồng

: Polymerase Chain Reaction PCR

: Phòng chống sốt rét PCSR

: Plasmodium Genenomics Resource PRG

: Kiểm tra Test

RPMI 1640 : Môi trường nuôi cấy ký sinh trùng

sốt rét (R8758, Glutamine, và NaHCO3)

: Vòng trên phút RPM

: Môi trường nuôi cấy không huyết thanh RPS

: Môi trường nuôi cấy có huyết thanh RPHS

: Sốt rét SR

: Sốt rét ác tính SRAT

: Tử vong do bệnh sốt rét TVSR

: Tổ chức Y tế thế giới WHO

: Túi đựng mẫu có khóa kéo Ziplock

xi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp 2009 ............................................ 11

Bảng 1.2. Thời gian xuất hiện P. falciparum kháng với các loại thuốc SR .............. 19

Bảng 2.1. Trình tự mồi của phản ứng PCR – Nested 1, PCR – Nested 2. ................ 35

Bảng 2.2. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR – Nested xác định

loài Plasmodium spp. .............................................................................. 35

Bảng 2.3. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR – Nested 2 xác định

loài 04 loài Plasmodium spp. ................................................................... 36

Bảng 2.4. Trình tự mồi khuếch đại đọan K13 ........................................................... 36

Bảng 2.5. Phản ứng Nested – PCR khếch đại K13 lần 1: ......................................... 37

Bảng 2.6. Phản ứng Nested – PCR khếch đại K13 lần 2: ......................................... 37

Bảng 2.7. Thành phần các hóa chất sử dụng trong PCR của giải trình tự ................ 40

Bảng 2.8. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng control giải trình tự ......... 40

Bảng 3.1. Kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật giêm – sa ............................... 49

Bảng 3.2. Kết quả xác định chủng bằng kỹ thuật Nested –PCR ............................... 52

xii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây phát sinh loài của Plasmodium spp. gây bệnh cho người và

động vật .................................................................................................... 7

Hình 1.2. Bản đồ phân bố tỷ lệ tử vong bệnh sốt rét năm 2010 – 2013 .................. 10

Hình 1.3. Bản đồ tỷ lệ ký sinh trùng gây bệnh sốt rét tại Việt Nam ........................ 12

Hình 1.4. Biểu đồ thể hiện số ca nhập viện và tử vong do KST SR tại

Việt Nam ................................................................................................. 13

Hình 1.5. Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét ở muỗi và người ................... 17

Hình 1.6. Phân bố các vị trí đột biến dựa trên mô hình 3D của kháng K13 ............. 21

Hình 1.7. Sự phân bố đa kháng thuốc sốt rét 2016 .................................................. 21

Hình 2.1. Các bước tiến hành trong kỹ thuật nhuộm giêm – sa ................................ 26

Hình 2.2. Hình thể KST SR P. falciparum soi bằng kỹ thuật nhuộm

giêm – sa ................................................................................................. 27

Hình 2.3. Hình thể KST SR P. vivax soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa .............. 28

Hình 2.4. Hình thể KST SR P. malariae soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa ........ 29

Hình 2.5. Hình thể KST SR P. ovale soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa ............. 30

Hình 2.6. Hình minh họa các bước trong phản ứng PCR ......................................... 33

Hình 2.9. Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tư dùng gel polyacrylamide. ....... 39

Hình 3.1. Hình thể KST SR P. falciparum bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa. ........... 48

Hình 3.2. Hình thể KST SR P. vivax bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa. .................... 49

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm DNA Plasmodium spp. .................................... 51

Hình 3.4. Biểu đồ sánh kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật giêm – sa và kỹ

thuật Nested – PCR .................................................................................. 52

Hình 3.5. Kết quả trình tự DNA P. falciparum với NCBI ........................................ 53

Hình 3.6. Sơ đồ cây P. falciparum với NCBI ........................................................... 53

Hình 3.7. Kết quả trình tự DNA P. vivax với NCBI ................................................. 54

Hình 3.8. Sơ đồ cây P. vivax với NCBI .................................................................... 54

Hình 3.9. Sơ đồ cây P. falciparum và P. vivax với NCBI ........................................ 55

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm DNA kháng K13 của P. falciparum .............. 56

xiii

Hình 3.11. Kết quả trình tự aa K13 của P. falciparum với PGR ............................. 57

Hình 3.12. KST SR Plasmodium spp. được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm............. 58

Hình 3.13. Hình thể P. falciparum được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm .................. 58

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặt vấn đề

Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra, bệnh thường

gặp ở các nước thuộc khu vực nhiệt đới [12] [17]. Bệnh truyền từ người bệnh qua

[5] [17] [45] [58] [74]. Hiện nay, có 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người là:

người lành nhờ vật chủ trung gian truyền bệnh là muỗi đòn xóc (muỗi Anopheles) [3]

Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium

ovale, và Plasmodium knowlesi [4] [5] [12], trong đó Plasmodium falciparum và

Plasmodium vivax là 2 loài thường gặp [3] [6] [7] [45] [74].

Ngày nay, tuy tình hình bệnh SR có chiều hướng giảm so với những thập niên

gần đây, nhưng nó vẫn một vấn đề liên quan đến sức khỏe con người và nhận được

sự quan tâm của toàn cầu, là bệnh truyền nhiễm làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến

sức khỏe, kinh tế [4] [71] và gây nhiều thiệt hại, tổn thất cho nhân loại [35], đặc biệt là

đối với phụ nữ mang thai và trẻ em [68]. Hàng năm, trên toàn cầu có khoảng 350 -

500 triệu người mắc SR và hơn 1 triệu người chết do SR. Đến năm 2010, trên thế

giới có 216 triệu người mắc SR và 655.000 người chết do SR và có khoàng 3,3 tỷ

người sống trong vùng dịch tể sốt rét và có nguy cơ mắc bệnh sốt rét [65].

Theo ước tính của WHO khoảng 40% dân số thế giới hiện nay đang sống

trong vùng có nguy cơ mắc SR. Dân số Việt Nam năm 2013 là 89,9 triệu người, với

khoảng 14,4 triệu người sống ở những vùng có SR lưu hành (khoảng 16% dân số),

có 35.406 ca SR được ghi nhận, trong đó có 17.128 ca xác định có KST SR (60% số

ca xác nhận SR là do KST Plasmodium falciparum gây ra. 6 ca tử vong do SR [1].

1.2. Tính cấp thiết của đề tài

Tỷ lệ mắc sốt rét ở Việt Nam đã liên tục giảm, từ 2,8 ca/1.000 dân năm 1991

xuống 0,87 ca/1.000 dân năm 2001 và năm 2013 chỉ còn 0,2 ca/1.000 dân [28] [66]. Tỷ

lệ mắc sốt rét giảm là do áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật để hạn chế số

lượng mắc và tử vong do KST SR, nhưng vẫn còn hơn 11 triệu người sống trong

vùng dịch tể sốt rét [2]. Theo một báo cáo khác về tình hình tử vong do sốt rét ở Việt

Nam, được đăng trên tạp chí The Guardian năm 2012, số ca tử vong do sốt rét/1.000

2

dân ở các năm 1980, 1990, 2000 và 2010 lần lượt là: 57,5 ca; 36,2 ca; 15,0 ca; 1,4

ca [59].

Trước tình hình bệnh SR có chiều hướng giảm mạnh [7], áp lực điều trị thuốc

SR tăng, di biến động dân từ vùng dịch tể SR diễn biến phức tạp,... làm cho tình

trạng kháng thuốc sốt rét ngày càng tăng cao [62] [63] [69], gia tăng nguy cơ thành dịch

SR. Do đó việc tìm kiếm KST SR để phục vụ nghiên cứu gặp nhiều khó khăn; trong

khi đó các nghiên cứu, thử nghiệm đánh giá đáp ứng thuốc điều trị bệnh sốt rét của

KST SR có vai trò rất quan trọng việc loại trừ SR. Từ các vấn đề trên, đòi hỏi phải

có sẵn nguồn chủng KST SR. Với mong muốn tạo tiền đề cho việc thành lập thư

viện Genenome, thư viện chủng KST SR để phục vụ cho công tác nghiên cứu về

các kỹ thuật chuyên sâu trong chuẩn đoán và điều trị bệnh SR và phát triển vaccine

kháng sốt rét sau này, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bảo tồn chủng Ký sinh trùng

sốt rét Plasmodium spp. và hướng ứng dụng”.

1.3. Mục tiêu nghiên cứu

 Bảo tồn chủng KST SR các mẫu được thu thập ở thực địa, trong quá

trình làm đề tài tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Thành phố Hồ Chí

Minh.

 Bước đầu xây dựng trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome từ các mẫu

KST SR thu thập được trong quá trình thực đề tài.

1.4. Nội dung nghiên cứu

 Thu thập, lưu trữ và bảo tồn nguồn chủng KST SR trong Nitơ

lỏng – 196oC.

+ Nuôi cấy chủng KST SR tạo chủng thuần tại phòng thí nghiệm các nguồn

máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax đơn

thuần được thu thập từ thực địa.

+ Lưu trữ nguồn mẫu KST SR từ các mẫu thu thập được trong nghiên cứu, thử

nghiệm,...

 Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được.

3

+ Chạy PCR định danh những mẫu máu nhiễm KST SR [40] [46].

+ Giải trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome đặc trưng cho từng loài KST

SR [33] [41] [44] [46].

+ Giải trình tự đoạn gene kháng thuốc Artemisinin đối với chủng Plasmodium

falciparum

1.5. Ý nghĩa đề tài

Nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên kết hợp giữa giám sát ca bệnh chủ

động, thu thập và bảo tồn chủng KST SR, đồng thời thời bước đầu xây dựng được

trình tự đoạn Gene bảo tồn các chủng KST SR, làm tiền đề cho việc so cho các

nghiên cứu sau này.

Bên cạnh đó, việc bảo tồn chủng KST SR tại phòng thí nghiệm, cũng góp

phần duy trì nguồn chủng KST, Gene trong điều kiện KST SR đang giảm mạnh như

hiện nay.

Việc bảo tồn chủng KST SR cũng có vai trò quan trọng trong việc cung cấp

chứng dương cho các kỹ thuật sinh học phân tử, cung cấp mẫu cho công tác nghiên

cứu tạo vaccine, kháng thuốc sốt rét, tiêu bản mẫu hình thể KST SR trong công tác

đào tạo nguồn nhân lực y tế.

1.5.1. Ý nghĩa khoa học

Đề tài được thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau từ các kỹ thuật truyền

thống (Giêm – sa) cho đến áp dụng các kỹ thuật hiện đại (sinh học phân tử) trong

chuẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, đồng thời áp dụng kỹ thuật giải trình tự để xác

định trình tự đoạn Gene đặc trưng của từng loài KST SR để phát hiện KST SR, đã

góp phần vào việc chuẩn đoán chính xác các chủng KST SR gây bệnh SR để có

phát đồ điều trị thích hợp.

Góp phần bảo tồn và duy trì nguồn chủng KST SR, nguồn dữ liệu về Gene

trong giai đoạn KST SR đang giảm dần, và tình hình kháng thuốc ngày càng gia

tăng [40] [62] [69] [75], cũng như phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyên sâu về sốt rét

và phát triển thuốc, vaccine sau này.

4

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn

Bình Phước là vùng có sốt rét lưu hành, lưu hành nặng nhất là ở các xã vùng

sâu, vùng xa, giáp ranh với rừng, biên giới Cam-pu-chia [18]. Trước tình trạng dân di

biến động, dân đi rừng, ngủ rẫy [24], thì việc chuẩn đoán nhanh và chính xác ca bệnh

sốt rét sẽ giúp y bác sĩ đề ra những biện pháp phòng tránh, có phác đồ điều trị hiệu

quả, kịp thời. Góp phần cho công tác phòng chống sốt rét ở tỉnh Bình Phước riêng

và sự thành công của chương trình phòng chống sốt rét Quốc gia nói chung.

Bên cạnh đó việc bảo tồn được nguồn chủng, nguồn gene KST SR để phục vụ

cho công tác nghiên cứu sau này như: đánh giá hiệu lực của các thuốc điều trị SR

thế hệ mới, cũng như nuôi cấy để thử nghiệm trong điều kiện in vitro, nghiên cứu về

đáp ứng miễn dịch, sinh học phân tử, phát triển vaccine chống sốt rét,... là những

đóng góp có ý nghĩa của luận văn này.

1.6. Tổng quan về bệnh sốt rét

1.6.1. Lịch sử phát hiện bệnh sốt rét

Bệnh sốt rét được biết đến cách đây hơn 2000 năm, đã được Hipocrates (Hy

Lạp) và bệnh sốt rét được ông mô tả chi tiết từ thế kỷ V trước Công nguyên. Ông

phân chia bệnh SR ra nhiều loại như sốt định kỳ mỗi ngày, sốt mỗi hai ngày hoặc

mỗi bốn ngày [58]. Nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu về bệnh này và đặt ra

những tên gọi khác nhau như: ở Trung Quốc gọi là nghịch tật, Việt Nam gọi là sốt

rét rừng hay sốt ngã nước, tuy nhiên mới chỉ nêu lên một số đặc điểm lâm sàng và

vài yếu tố liên quan [10].

Từ những năm 1600, ở Pêru người da đỏ đã dùng vỏ cây Cinchona để chữa sốt

rét, đến năm 1820 Pelletier và Caventou đã chiết xuất ra hoạt chất alkaloide quinine

và cinchonin từ vỏ cây Cinchona [21].

Đến thế kỷ XIX từ những hiểu biết khá đầy đủ về nguyên nhân gây bệnh sốt

rét, tác nhân gây bệnh sốt rét, véc tơ truyền bệnh sốt rét, cơ chế lan truyền và chu kỳ

phát triển của KST SR.

Vào năm 1880, giáo sư Alphonse Laveran (Đại học Rome) lần đầu tiên phát

hiện và mô tả KST SR trong máu người, đã mở ra một kỷ nguyên mới về quá trình

5

nghiên cứu sinh bệnh học và các yếu tố liên quan về bệnh sốt rét làm cơ sở cho việc

tìm kiếm những chiến lược phòng chống quy mô góp phần giảm thiểu tối đa những

thiệt hại do bệnh sốt rét gây nên.

Năm 1885, nhà bệnh học Ettore Marchiafava (người Ý) tìm thấy những sinh

vật gây bệnh có trong hồng huyết cầu người bệnh và ông đặt tên là Plasmodium.

Năm 1897, bác sĩ Sir Ronald Ross (người Anh), chứng minh có sự hiện diện

của Plasomodium trong muỗi Anopheles cái.

Năm 1924, Schuleman (Đức) đã phát hiện ra thuốc Pamaquine (Plasmoquine)

đến năm 1930 – 1952 hàng loạt thuốc chống sốt rét tổng hợp lần lượt ra đời như

Chloroquine, Proguanil, Primaquine.

Năm 1974 – 1982, Trung Quốc phát triển thuốc trị sốt rét từ cây Quing Hao

Su (Artemisia annua) [21].

Năm 1985 – 1990 Việt Nam đã chiết xuất thành công Artemisinine từ hoạt

chất của cây Thanh Hao hoa vàng mọc hoang ở vùng núi phí Bắc làm giảm rõ rệt tử

vong sốt rét và sốt rét ác tính [10].

Từ những nghiên cứu trên, các nhà khoa học đã đúc kết lại rằng nguyên nhân

của bệnh sốt rét do ký sinh trùng sốt rét (mầm bệnh phát triển trong máu bệnh nhân)

được muỗi Anopheles (trung gian truyền bệnh) đốt truyền từ người bệnh sang người

lành (cơ thể cảm thụ).

1.6.2. Định nghĩa bệnh sốt rét

Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng sốt rét ký sinh trong hồng cầu người

bệnh và gây ra bệnh SR với các triệu chứng toàn thân. Bệnh SR có thể gây ra tổn

[12].

thương ở nhiều cơ quan khác nhau, có thể gây ra tử vong (ở thể sốt rét ác tính) [3]

Với các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như: cơn sốt rét run,

sốt, vã mồ hôi hoặc có kèm theo gan to, lách to hoặc thiếu máu [6] [17] [58].

Bệnh SR lưu hành chủ yếu vùng rừng, đồi, núi, ven biển nước lợ; bệnh xảy ra

quanh năm, phát triển mạnh vào mùa mưa [6].

6

Bệnh sốt rét là bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp.

gây ra và có tính chất chu kỳ [17] [30].

Ký sinh trùng sốt rét thuộc:

: Động vật (Animalia), Giới

: Đơn bào (Protozoa), Ngành

: Bào tử trùng (Sporozoa), Lớp

: Phụ huyết bào tử trùng (Hemosprodidae,) Bộ

: Plasmodidae, Họ

 Giống: Plasmodium (Có 2 tiểu giống: Plasmodium, Laverania)

 Tiểu giống Plasmodium gồm 3 loài vivax, ovle, malariae (giao bào có

hình tròn hay bầu dục).

 Tiểu giống Laverania gồm loài falciparum (có giao bào hình liềm)

 Loài: Có khoảng 120 loài kí sinh trùng gây bệnh sốt rét cho người và các

động vật có xương sống, một số loài tiêu biểu như sau:

 Kí sinh loài khỉ: Plasmodium cynomolgi, Plasmodium rhodhaini,

Plasmodium knowlesi, Plasmodium simii, Plasmodium inui,...

 Kí sinh loài động vật gặm nhấm: Plasmodium berghei, Plasmodium

gonderi,...

 Kí sinh loài chim: Plasmodium gallinaceum, Plasmodium lophurae,

Plasmodium relictum, Plasmodium cathemerium,...



Kí sinh loài bò sát: Plasmodium mexicanum. 

Kí sinh loài lưỡng thê: Plasmodium bufonis, Plasmodium

catesbiana.

7

Hình 1.1. Cây phát sinh loài của Plasmodium spp. gây bệnh cho người và

động vật [19]

8

 Kí sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người thuộc giống Plasmodium spp..

Cho đến nay, kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax,

Plasmodium malariae là những loài làm tăng gánh nặng mô hình bệnh tật, gây tốn

kém về mặt sức khỏe và kinh tế, bệnh cũng gây tai họa cho các nước châu Á, Mỹ la

tinh, khu vực Trung Đông và thậm chí ở một vài vùng của châu Âu, đặc biệt là ở

các vùng cận sa mạc Sahara châu Phi [4].

 Tùy theo loài KST SR mang trong người mà bệnh nhân sốt mỗi ngày một

cơn (P. falciparum), hai ngày một cơn (P. vivax), ba ngày một cơn (P. malariae),

cơn sốt thường xuất hiện đúng giờ, có tính chu kỳ rõ rệt, trùng khớp với nhũng đợt

phát triển của KST SR [9].

Chu kỳ sống của KST SR trong cơ thể người có hạn định. Tùy theo loại KST

SR mà chúng tồn tại trong cơ thể người từ 6 tháng đến 3 năm, một số trường hợp có

thể tồn tại lâu hơn, trên 10 năm như P. malariae [6].

 Người mang KST SR có thể có biểu hiên những triêu chứng lâm sàng điển

hình như rét run, nóng, ra mồ hôi và khát nước [17]. Cũng có thể biểu hiện những

triệu chứng không điển hình như sốt cao, ớn lạnh, đau toàn thân. Nhưng cũng có thể

không biểu hiện gì cả , đó là trường hợp người mang KST lạnh (người mang ký sinh

trùng sốt rét nhưng không có biểu hiện bênh sốt rét) [6] [9].

 Bệnh có thể chữa khỏi nếu được xác định và uống thuốc trong vòng 24

giờ [74]. Phát hiện trễ, bệnh gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm có thể dẫn tới tử

vong (TVSR) do P. falciparum gây ra [5] [9] [12].

1.6.3. Sơ lược về dịch tể học sốt rét

1.6.3.1. Tình hình dịch tể sốt rét trên thế giới

Trên thế giới, bệnh sốt rét phân bố rộng khắp từ vùng nhiệt đới đến ôn đới,

P. falciparum phân bố chủ yếu các vùng khí hậu nhiệt đới và P. vivax phân bố rộng

khắp các vùng ôn đới và nhiệt đới [7]. Bệnh sốt rét đã gây ra nhiều vụ dịch lớn giết

chết nhiều người như vụ dịch ở Pen Giáp ở Ấn Độ (1898) có 307.000 người tử

vong, ở Sri Lanka và Ceylon (1934 -1935) làm 82.000 người tử vong; ở Brazil

(1938) số người mắc bệnh sốt rét là 100.000 người, số chết do sốt rét là 14.000.

9

WHO đã xếp bệnh sốt rét đứng hàng thứ 4 trong danh sách những căn bệnh

nguy hiểm nhất của thế kỷ 21.Trong những năm qua, có rất nhiều phương pháp

nhằm kiểm soát bệnh sốt rét như thực hiện tẩm màn, phun thuốc diệt muỗi trong

nhà và điều trị phối hợp thuốc chống sốt rét.

Cuối năm 2004, có 107 quốc gia và vùng lãnh thổ có nguy cơ lây lan dịch sốt

rét. Trong năm 2006, WHO ước tính rằng 3.3 tỷ người được có nguy cơ nhiễm bệnh

sốt rét. Trong số này, 247 triệu người nhiễm (86% ở châu Phi) và gần 1 triệu (chủ

yếu là trẻ em châu Phi) đã chết vì nhiễm ký sinh trùng sốt rét.

Trong năm 2008, bệnh sốt rét vẫn còn lưu hành hơn 109 quốc gia và vùng lãnh

thổ. Trong đó có 45 quốc gia và vùng lãnh thổ là ở châu Phi. Theo WHO ước tính

có hơn 1 tỉ người chết vì sốt rét mỗi năm.

Theo số liệu thống kê của WHO đến năm 2009, bệnh SR vẫn lưu hành ở 108

quốc gia. Ước tính có khoảng 225 triệu người mắc và 781 nghìn người chết do sốt

rét (SR). Mặc dù bệnh sốt rét đã được thanh toán ở nhiều nơi trên thế giới như Châu

Âu, Bắc Mỹ, một số nước Bắc Á và bệnh SR cũng đã giảm nhiều ở một số nước

trong đó có cả Việt Nam.

Theo WHO ước tính năm 2010 có khoảng 216 triệu người mắc sốt rét ở 106

nước và vùng lãnh thổ có dịch lưu hành trên thế giới. Khoảng 81% số người mắc

sốt rét và 91% các trường hợp tử vong là ở khu vực Châu Phi. 86% bệnh nhân sốt

rét trên toàn cầu là trẻ em dưới 5 tuổi. Tuy vậy, theo Báo cáo sốt rét thế giới 2011,

trong thập kỷ qua tỷ lệ mắc sốt rét ở tất cả các khu vực trên thế giới đã giảm [64] .

Ở châu Á, sốt rét xảy ra nghiêm trọng ở các tiểu vùng sông Mê Kông gồm các

nước: Trung Quốc, Myanmar, Việt Nam, Lào, Thái lan và Cam-pu-chia, với hơn

500.000 ca mắc bệnh mỗi năm. Vùng biên giới các nước này ngày càng có nhiều

nguy cơ mắc bệnh do các hoạt động kinh tế với tình hình bất ổn xã hội, và vấn đề

KST SR kháng thuốc nghiêm trọng nhất trên thế giới [6].

Sốt rét là một trong những vấn đề sức khỏe tại khu vực Đông Nam Á, cùng

với các bệnh tiêu chảy, nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính, lao và HIV/AIDS. Sốt rét lưu

hành hầu hết ở khu vực Đông Nam Á với hơn 88% dân số sống trong khu vực.

10

Hình 1.2. Bản đồ phân bố tỷ lệ tử vong bệnh sốt rét năm 2010 – 2013 [67]

Theo WHO, năm 2016 bệnh sốt rét đã giảm đáng kể nhưng vẫn còn 91 quốc

gia và vùng lãnh thổ chưa loại trừ sốt rét, với 109 quốc gia và vùng lãnh thổ năm

2008. Hầu hết sự thay đổi này có thể là do sự triển khai rộng rãi các biện pháp kiểm

soát sốt rét ở các quốc gia [73].

1.6.3.2. Tình hình dịch tể sốt rét tại Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, là điều kiện tự nhiên thuận lợi

cho bệnh sốt rét phát triển, từ 1958 – 1975 chương trình tiêu diệt sốt rét đã được

tiến hành ở miền Bắc và diệt trừ sốt rét ở miền Nam, sau ngày miền Nam giải phóng

chiến lược PCSR quốc gia xác định khu vực miền Trung – Tây Nguyên là trọng

điểm sốt rét của cả nước. Chỉ trong 2 năm (1976 – 1977) tình hình sốt rét tăng vọt:

số mắc sốt rét 699.000 người, số chết sốt rét 3.976 người và 58 vụ dịch sốt rét đã

xảy ra do dân từ thành thị và các khu tập trung trở về làng cũ ở vùng sốt rét chưa có

biện pháp phòng chống [10].

Trong khoảng 1978 – 1986, nhờ tiến hành các biện pháp thanh toán sốt rét tích

cực đã làm số mắc sốt rét, chết sốt rét mỗi năm giảm xuống 4 lần so với năm 1977.

Từ 1978 – 1990, nguồn lực bị cắt giảm do không còn viện trợ từ Liên Xô cũ,

di biến động dân lớn từ đồng bằng lên miền núi và các tỉnh Tây Nguyên cùng nhiều

nguyên nhân khác làm cho bệnh sốt rét quay trở lại ngày càng nghiêm trọng mà

11

đỉnh cao vào năm 1991, con số mắc sốt rét vẫn lên tới 2 triệu người và có tới trên

4600 người chết do sốt rét [7].

Năm 1991, trước tình hình sốt rét quay trở lại, chương trình quốc gia PCSR

bắt đầu được thực hiện với mục tiêu giảm mắc, giảm chết và giảm dịch sốt rét. Với

sự đầu tư đúng mức của Chính phủ (70 – 100 tỷ đồng/năm) và sự hỗ trợ tích cực từ

các tổ chức quốc tế, trong 15 năm (1991 – 2005) các mục tiêu PCSR ở Việt Nam đã

đạt được những kết quả đáng kể; so sánh năm 2005 với 1991 số BNSR giảm

73,15%, KST SR giảm 60,46%, tử vong do sốt rét giảm 96,8% và chỉ có 5 vụ dịch

xảy ra trên diện hẹp ở một số tỉnh vùng núi phía Bắc.

Khu vực miền Trung – Tây Nguyên luôn được xác định là trọng điểm sốt rét,

qua phân tích diễn biến sốt rét trong 5 năm (2001 – 2005) thì ghánh nặng sốt rét hầu

như tập trung ở đây (số BNSR chiếm 42%, số ca SRAT chiếm 80%, số tử vong do

sốt rét chiếm 82% và số ca nhiễm KST SR chiếm 77% cả nước hàng năm), do đó

PCSR có hiệu quả ở khu vực này cũng có nghĩa là giải quyết được tình hình sốt rét

trên cả nước [10].

Năm 2012, tỉ lệ mắc sốt rét/100.000 dân giảm còn 50,64 và tỉ lệ chết do sốt

rét/100.000 dân giảm còn 0,01 đó là nổ lực lớn của ngành y tế nước ta khi đã kéo

giảm tỉ lệ mắc và chết do sốt rét [8]. Tuy nhiên, đến năm 2015, tại Việt Nam còn

khoảng 11,7 triệu người sống trong vùng sốt rét lưu hành [1] [24].

Bảng 1.1. Phân vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp 2009 [11] [15]

Dân số Tỷ lệ Vùng dịch tễ SR Số xã (triệu người) % dân số

Vùng I. Không có SRLH 5.636 54.530.178 62,5

Vùng II. Nguy cơ SR quay lại 2.798 17.393.146 19,9

Vùng III. SRLH nhẹ 1.527 10.537.391 12,1

Vùng IV. SRLH vừa 810 3.538.473 4,1

Vùng V. SRLH nặng 341 1.203.661 1,3

12

Từ việc phân vùng dịch tể sốt rét, Việt Nam hiện tại có 05 vùng dịch tễ sốt rét

khác nhau [13]. Cả nước có gần 15,5 triệu người sống trong vùng sốt rét, chiếm

17,5% dân số toàn quốc [15].

Theo dự án quốc gia PCSR của Việt Nam định nghĩa dịch sốt rét: “Dịch sốt rét

là khi ở một nơi có mức bệnh sốt rét (ca mắc mới) tăng đột ngột so với diễn biến

bình thường trong một quần thể dân cư (tối thiểu một thôn bản, cụm dân cư) và có

lan truyền bệnh tại chỗ” [43].

Loài ký sinh trùng gây bệnh ở nước ta chủ yếu là Plasmodium falciparum

(54%) và Plasmodium vivax (46%) [29], và chúng cũng là 02 loài gây ra bệnh sốt rét

trên toàn cầu [25].

Theo báo cáo công tác phòng chống sốt rét năm 2016 của Viện Sốt rét – Ký

sinh trùng – Côn trùng Tp. Hồ Chí Minh, số ca mắc sốt rét ở khu vực Nam bộ –

Lâm Đồng có chiều hướng giảm mạnh (1.642 ca mắc sốt rét, trong đó có 9 ca

SRAT và 1 ca TVSR trong năm 2016; so với năm 2013 số ca mắc SR 3.602 ca,

trong đó có 35 ca SRAT và 2 ca TVSR).

Hình 1.3. Bản đồ tỷ lệ ký sinh trùng gây bệnh sốt rét tại Việt Nam [29]

13

Hình 1.4. Biểu đồ thể hiện số ca nhập viện và tử vong do KST SR

tại Việt Nam [29]

1.6.3.3. Tình hình dịch tể sốt rét tỉnh Bình Phước

Bình Phước là một tỉnh thuộc miền Đông Nam bộ, nằm trong vùng kinh tế

trọng điểm phía Nam với 260,433 km đường biên giới giáp với vương quốc Cam-

pu-chia. Tỉnh là cửa ngõ, cầu nối của vùng Đông Nam bộ với Tây Nguyên và Cam-

pu-chia. Cụ thể, phía Đông giáp tỉnh Lâm Đồng và Đồng Nai; phía Tây giáp tỉnh

Tây Ninh và Cam-pu-chia; phía Nam giáp tỉnh Bình Dương; phía Bắc giáp tỉnh Đắk

Lắk và Cam-pu-chia [18].

Tỉnh có diện tích 6.871,5 km², trong đó diện tích đất lâm nghiệp chiếm 51,3%

tổng diện tích đất toàn tỉnh. Dân số 905.300 người, mật độ dân số đạt 132

người/km² (theo số liệu thống kê năm 2011), gồm nhiều dân tộc khác nhau (đồng

bào dân tộc thiểu số chiếm 17,9%) sinh sống trên địa bàn 111 xã, phường, thị trấn

(92 xã, 14 phường và 5 thị trấn) thuộc 8 huyện, 3 thị xã [18].

Theo Báo cáo của các Viện Sốt rét – Ký Sinh Trùng – Côn Trùng tại Hội nghị

tổng kết công tác phòng chống sốt rét và giun sán khu vực Nam Bộ – Lâm Đồng.

Năm 2015, toàn quốc có 19.252 bệnh nhân sốt rét (BNSR) giảm 30,92% so với năm

2014, trong đó miền Đông Nam Bộ BNSR tăng 4,33%; năm 2015 toàn quốc có

9.331 ký sinh trùng sốt rét (KST SR) giảm 40,76% so với năm 2014, trong đó miền

Đông Nam Bộ tăng 9,07%; năm 2015 toàn quốc có 32 ca sốt rét ác tính (SRAT)

giảm 56,16% so với năm 2014, trong đó miền Đông Nam bộ có 14 ca SRAT; năm

14

2015 toàn quốc có 3 trường hợp tử vong do sốt rét (TVSR), thì miền Đông Nam Bộ

chiếm 1 ca [26].

Năm 2015 khu vực Nam Bộ - Lâm Đồng các chỉ số sốt rét (BNSR, KST SR,

SRAT) đều tăng kể cả TVSR và tập trung ở tỉnh Bình Phước do đó, có thể nói Bình

Phước là “điểm nóng sốt rét” của Việt Nam. Trong đó, số KST SR (tác nhân gây

bệnh hay mầm bệnh) của tỉnh Bình Phước trong năm 2015 (1.799 trường hợp)

chiếm 19,28% so với cả nước (9331 trường hợp) và tăng 18,28% so với năm 2014

(1.521 trường hợp), chính vì vậy Viện Sốt Rét – Ký Sinh Trùng – Côn Trùng Trung

ương đã xếp Bình Phước là điểm nóng sốt rét, trong danh sách 10 tỉnh có tỷ lệ KST

SR cao nhất Việt Nam (Bình Phước, Gia lai, Ninh Thuận, Đắc Nông, Khánh Hòa,

Phú Yên, Đắc Lắc, Quảng Bình, Kon Tum, Bình Thuận) [26].

Năm 2009 tại xã Đăk Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước ghi nhận hiệu

lực điều trị khỏi của artemisinin với P. falciparum chỉ đạt 85,4%. Sau khi công bố

kết quả về kháng thuốc tại Bình Phước, tổ chức Y tế Thế giới đã cử 2 đoàn chuyên

gia đến khảo sát và đánh giá lại kết quả đã đưa ra kết luận về việc xuất hiện chủng

P. falciparum kháng artemisinin tại xã Đăk Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình

Phước. Tháng 7 năm 2010, từ kết quả kiểm tra đánh giá về P. falciparum kháng

Artemisinin tỉnh Bình Phước, WHO đã đưa ra khuyến nghị và đề xuất một số biện

pháp nhằm ngăn chặn chủng P. falciparum kháng artemisinin tại tỉnh Bình Phước

để phòng, chống việc lan rộng ra các vùng khác ở Việt Nam [27].

Chính vì thế, Bình Phước là điểm nóng về sốt rét tại khu vực Nam bộ - Lâm

Đồng, là nguồn KST SR để có thể thực hiện thu thập và bảo tồn chủng KST SR

phục vụ cho các nghiên cứu về SR sau này.

1.7. Chu kỳ và hình thể của ký sinh trùng sốt rét

Chu kỳ phát triển của KST SR gồm có 2 giai đoạn: vô tính (ở người), hữu tính

(ở muỗi) [33].

1.7.1. Giai đoạn phát triển trong cơ thể người

Khi ký sinh trùng sốt rét được muỗi truyền vào người bị đốt [45], các mãnh thoa

trùng SR đến gan và phát triển ở đây, các mãnh thoa trùng phát triển và được phóng

15

thích vào máu, hình thành chu kỳ vô tính ở người [45] [48]. Trong hồng cầu, ký sinh

trùng sốt rét phát triển qua các giai đoạn [42].

 Trophozoite (thể sinh dưỡng, tư dưỡng, dinh dưỡng, tự dưỡng).

 Trophozoite non (thể nhẫn – ring form)

Một merozoite ngay sau khi xâm nhập vào hồng cầu, phát triển và hình thành

không bào.

Nhân của KST SR màu đỏ, trông như mặt đá của nhẫn, thường ở chỗ vòng

mảnh nhất. Bào tương của KST SR màu xanh, như vòng nhẫn. Khoảng trống ở giữa

là không bào, không bào lớn lên nguyên sinh chất bào tương dày lên, nhân to ra.

Đặc điểm của thể nhẫn: bào tương mảnh, không có hạt sắc tố, giai đoạn này rất

ngắn.

 Trophozoite phát triển (thể tư dưỡng non)

Nguyên sinh chất bắt màu đậm hơn, có hạt sắc tố, có chân giả. Khối nguyên

sinh chất to dần lên, càng to càng có nhiều hạt sắc tố.

KST SR ở giai đoạn này có nhiều hình thù kì dị, không nhất định, tùy thuộc

vào sự cử động phóng chân giả của kí sinh trùng. Nhân to dần lên, không bào lúc

đầu to, nhưng sau khi nguyên sinh chất dày lên, thì không bào dần dần thu hẹp lại,

hoặc chia ra thành nhiều không bào.

Để phân loại kí sinh trùng sốt rét, các nhà nghiên cứu dựa vào hình thù đặc

chân như: chân giả dài hay ngắn, không bào có một hoặc có nhiều. Giai đoạn này

tương đối dài hơn.

 Trophozoite già (thể tư dưỡng già)

Đến giai đoạn này không bào không còn nữa. Nguyên sinh chất là một khối

đặc dày. Nhân to ra để chuẩn bị phân chia. Hạt sắc tố thường tụ lại thành đám.

 Schizonte (còn gọi là thể phân liệt, thể liệt sinh)

 Schizonte non (thể phân liệt non)

Nhân đã phân chia thành nhiều mảnh, nhưng nguyên sinh chất chưa phân chia.

 Schizonte già (thể phân liệt già)

16

Đến giai đoạn này nguyên sinh chất đã phân chia và chia đều cho các nhân

hình thành các merozoite. Người ta thường dựa vào cách sắp xếp và số lượng của

các merozoite trong hồng cầu để phân biệt các loại kí sinh trùng sốt rét.

 Gametocyte (giao bào)

Từ các merozoite hình thành giao bào đực (microgametocyte) và giao bào cái

(macrogametocyte).

Hình thể giao bào đực và giao bào cái của mỗi loài KST SR khác nhau. Giao

bào đực nhân to, xốp, màu đỏ nhạt, nguyên sinh chất màu xanh nhạt, hạt sắc tố màu

nâu. Giao bào cái nhân đặc, nhỏ, gọn hơn, màu đỏ đậm hơn, hạt sắc tố nâu xẫm

hoặc đen.

Hình thể các loại giao bào ở mỗi loài kí sinh trùng sốt rét cũng khác nhau.

1.7.2. Giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi

Giai đoạn kí sinh trùng sốt rét phát triển ở dạ dày, xoang cơ thể và tuyến nước

bọt của muỗi (trên tiêu bản mổ muỗi).

 Gamete (thể giao tử)

Giao tử hình thành từ giao bào được muỗi hút vào dạ dày. Giao tử đực

(microgamete) có roi và giao tử cái (macrogamete) hình cầu.

 Zygote (thể hợp tử)

Zygote là sản phẩm của sự dung hợp giao tử đực và giao tử cái. Hợp tử hình

cầu, không di động trong vòng 18 – 24 giờ đầu.

 Ookinete (thể trứng di động)

Thể zygote chuyển dạng kéo dài hình sâu và di động được gọi là thể ookinete.

Thể này di chuyển đến thành dạ dày muỗi và chui lọt qua lớp tế bào liên ra bên

ngoài bề mặt dạ dày rồi định cư ở đó.

 Oocyste (thể nang trứng)

Thể ookinete chuyển dạng hình tròn thành hình cầu có lớp màng chun được

gọi là nang trứng (oocyste – tế bào trứng). Nang trứng tăng dần kích thước và xuất

hiện trong dạ dày. Trong nang trứng có nhiều hạt sắc tố. Sự phân bố, kích thước các

17

hạt sắc tố và màu sắc của chúng là đặc điểm phân biệt từng chủng loại kí sinh trùng

sốt rét.

 Sporozoite (thoa trùng)

Nhân và nguyên sinh chất của noãn bào phân chia thành các thể dạng hình kim

gọi là thoa trùng (sporozoite). Thoa trùng hình thoi có nhân ở trung tâm. Người ta

ước tính mỗi noãn bào sinh sản và giải phóng ra khoảng 1000 thoa trùng. Thoa

trùng có thể bắt gặp ở trong xoang cơ thể muỗi và đặc biệt có nhiều ở tuyến nước

bọt của muỗi trưởng thành.

Hình 1.5. Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét ở muỗi và người [33]

1.8. Tình hình kháng thuốc hiện nay của ký sinh trùng sốt rét

1.8.1. Định nghĩa kháng thuốc

Theo WHO, kháng thuốc là “khả năng một chủng ký sinh trùng có thể sống

sót và phát triển mặc dù bệnh nhân đã được điều trị và hấp thu một lượng thuốc,

hoặc chính xác trong máu bệnh nhân đã có nồng độ thuốc mà trước đây vẫn ngăn

cản và diệt được ký sinh trùng số rét đó”. Sự kháng như vậy có thể là tương đối (với

liều lượng cao hơn mà vật chủ dung nạp được vẫn diệt được ký sinh trùng) hoặc

kháng hoàn toàn (với liều lượng tối đa mà vật chủ dung nạp được nhưng không tác

động vào ký sinh trùng).

18

Kháng thuốc sốt rét có thể được chia làm hai nhóm:

- Đề kháng tự nhiên: Ký sinh trùng đã có tính kháng từ trước khi tiếp xúc với

thuốc, do gen của ký sinh trùng biến dị tự nhiên, tính kháng thuốc được di truyền

qua trung gian nhiễm sắc thể. Ký sinh trùng có thể kháng chéo như P. falciparum

kháng cloroquin cũng có thể kháng với amodiaquin.

- Đề kháng mắc phải: Ký sinh trùng nhạy cảm với thuốc, sau một thời gian

tiếp xúc, trở thành không nhạy cảm nữa, do đột biến ở nhiễm sắc thể, tiếp nhận gen

đề kháng từ bên ngoài qua plasmid hoặc transposon (gen nhẩy) của ký sinh trùng.

1.8.2. Trên thế giới

[22], theo đó đề kháng của P. falciparum với các loại thuốc thế hệ cũ như

Đề kháng với thuốc chống sốt rét là một vấn đề khó khăn trong điều trị sốt rét

chloroquine và sulfadoxine - pyrimethamine (SP), trở nên phổ biến trong những

năm 1970 và 1980, làm tan mọi nỗ lực phòng chống bệnh sốt rét.

Theo WHO, đề kháng là “tình trạng KST có thể sống sót hoặc phát triển dù đã

có một lượng thuốc tương đương hoặc liều cao hơn liều thường dung nhưng trong

giới hạn liều dùng được hấp thu” và thuốc cần phải “tiếp xúc với KST hoặc đến

được tế bào hồng cầu nhiễm trong khoảng thời gian cần thiết” [62].

Một trong những khó khăn trong PCSR hiện nay là chủng P. falciparum đã

kháng với hầu hết các thuốc chống sốt rét hiện hành Chloroquine, Sulfadoxine –

Pyrimethamine (SP), Mefloquine ở nhiều nước trên thế giới như Nam Mỹ, Châu

Phi, Châu Á và các nước Đông Nam Á.

Tại tiểu vùng sông Mê Kông, tỉ lệ thất bại điều trị cao khi có sự đề kháng của

KST SR đối với thuốc phối hợp ARTs [70]. Trong những năm gần đây, ký sinh

trùng kháng artemisinin đã được phát hiện tại 5 quốc gia trong khu vực tiểu vùng

sông Mekong: Cam-pu-chia, Lào, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam [73].

Trong khi có rất nhiều yếu tố gây ra sự xuất hiện và lây lan của ký sinh trùng

kháng thuốc thì việc sử dụng artemisinin đơn liều để trị liệu bằng đường uống, được

cho là một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến kháng thuốc [6] [17]. Nếu ký

sinh trùng đề kháng với artemisinin phát triển và lây truyền đến các khu vực địa lý

19

rộng lớn khác, thì nguy cơ dẫn đến dịch rất cao do ký sinh trùng đã đề kháng

thuốc [5].

Theo kết quả nghiên cứu được tiến hành tại 16 quốc gia thời gian 2002 – 2010,

SR kháng thuốc bắt đầu có biểu hiện xuất hiện tại các quốc gia này, trong đó tại

Rwanda, Papua New Guinea là 9,9%, tại Burkina Faso, Cam-pu-chia, Kenya,

Mozambique, Uganda là 9,1 – 12% [62]. KST SR Plasmodium falciparum kháng

Artemisinin làm hơn 584.000 người chết mỗi năm [67].

Trước tình hình KST kháng Artemisinin phát triển và lan rộng, WHO và các

tổ chức trong khu vực đã có những bước đi cần thiết nhằm ngăn chặn KST kháng

thuốc. Theo WHO, Việt Nam là một trong số 5 quốc gia Tiểu vùng sông Mê Kông

(GMS) có tỷ lệ kháng Artemisinine ngày càng gia tăng bao gồm Việt Nam, Thái

Lan, Myanma, Lào và Cam-pu-chia [74] [75].

Bảng 1.2. Thời gian xuất hiện P. falciparum kháng với các loại thuốc SR [23]

Phát hiện kháng Năm Loại thuốc Năm Nước sử dụng

Quinin 1630 1910 Brazil

Chloroquin 1945 1960 Colombia

Amodiaquin 1947 1961 Brazil

Proguanin 1948 1949 Brazil

Pyrimethamin 1951 1952 Gambia

1964 1968 Thái Lan

Fansidar (Pyr/Sul) 1964 1968 Cam-pu-chia

Mefloquin 1972 1982 Thái Lan

Artemisinins 1972 2009 Cam-pu-chia, Thái Lan

20

1.8.3. Tại Việt Nam

Việt Nam là một trong những nước xuất hiện KST SR kháng thuốc sớm trên

thế giới; từ một trường hợp P. falciparum kháng Chloroquine đầu tiên được phát

hiện ở Khánh Hòa năm 1961 đến nay đã lan rộng ra 100% vùng sốt rét ở các tỉnh

miền nam và nhiều tỉnh miền bắc. Tỷ lệ kháng cao với Chloroquine ở các tỉnh miền

Trung – Tây Nguyên: 30 - 55% (1976 -1984), 55 - 90% (1985 - 1995); kháng

Amodiaquine 36,5% in vivo, 50% in vitro; kháng Fansidar in vivo 45 - 50%. Đăk

Lăk cũng là một trong những tỉnh có P. falciparum đa kháng thuốc, các nghiên cứu

1976 - 1996 cho thấy tỷ lệ kháng R2/R3 in vivo với Chloroquine (60 - 80%) và

Fansidar là 45 - 75% [5] [10].

Tại Việt Nam, KST SR Plasmodium falciparum kháng thuốc Artemisinine

được phát hiện đầu tiên tại tỉnh Bình Phước năm 2009 [23] [71].

Từ năm 2010 đến 2015, tỉ lệ chậm làm sạch KST SR tăng lên và được WHO

ghi nhận thêm 3 tỉnh: Gia Lai năm 2010, Đắk Nông năm 2011 và Quảng Nam năm

2012, Khánh Hòa năm 2014, Ninh Thuận năm 2015 [71]. Việc phát hiện KST

SR Plasmodium falciparum đề kháng với artemisinin tại tỉnh Bình Phước làm cho

việc điều trị sốt rét trở nên khó khăn (với tỉ lệ điều trị thất bại hơn 10%) [71] trong

điều trị sốt rét ác tính vì artemisinin là loại thuốc có hiệu lực cao.

Sự xuất hiện KST SR Plasmodium falciparum kháng thuốc ở tỉnh Bình Phước,

Bộ Y tế đã điều chỉnh phác đồ điều trị sốt rét, sử dụng thuốc phối hợp có gốc

Artemsinine (ACTs) thay thế, đồng thời với cấm sử dụng đơn liều để điều trị sốt rét

Artemisinine/Artesunate bằng đường uống (dạng viên) [5] [6] [17].

Cuối năm 2013, các nhà nghiên cứu đã xác định được một dấu phân tử

(maker): các đột biến Kelch 13 (K13) cánh quạt đã cho thấy có liên quan đến sự

chậm làm sạch ký sinh trùng sốt rét khi điều trị bằng artemisinin cả trong in vitro và

in vivo [22] [75]. Việc xác định các marker K13 có liên quan đến kháng artemisinin,

kháng K13 liên quan đến thông tin về các kiểu gen [22] [38] [39].

21

Hình 1.6. Phân bố các vị trí đột biến dựa trên mô hình 3D của kháng K13 liên quan đến kháng artemisinin [76]

Tuy nhiên, danh sách các đột biến liên quan đến kháng artemisinin vẫn còn

đang được hoàn thiện, vì vậy định nghĩa của kháng artemisinin sẽ tiếp tục phát

triển. Định nghĩa hiện tại về kháng artemisinin được chia làm 2 hướng [69]:

 Nghi ngờ kháng artemisinin - được định nghĩa là tần số xuất hiện cao của

kiểu hình làm chậm sự làm sạch ký sinh trùng sốt rét hoặc tần số cao của các đột

biến K13.

 Xác định kháng thuốc artemisinin - được định nghĩa là sự kết hợp của sự

chậm làm sạch ký sinh trùng sốt rét và các đột biến điểm liên quan đến kháng K13 ở

một bệnh nhân.

Hình 1.7. Sự phân bố đa kháng thuốc sốt rét 2016 [72]

22

Theo đó, WHO khuyến cáo giám sát thường xuyên tình trạng kháng thuốc sốt

rét [62] [69] và hỗ trợ các nước nhằm tăng cường những nỗ lực của họ trong lĩnh vực

nghiên cứu quan trọng này. Các khuyến nghị toàn diện hơn có sẵn trong "Kế hoạch

[63] [66]. Đối với các nước trong tiểu vùng sông Mê Kông, WHO đã đưa ra một khuôn

toàn cầu của WHO về kiềm chế kháng Artemisine" được phát hành vào năm 2011

khổ khu vực cho hành động mang tên "Đáp ứng khẩn cấp tới sự đề kháng

artemisinin ở khu vực tiểu vùng sông Mê Kông" (Emergency response to

artemisinin resistance in the Greater Mekong subregion) trong năm 2013 [5] [38].

1.9. Tình hình nghiên cứu, bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét trên thế giới

và Việt Nam

1.9.1. Trên thế giới

Năm 1880, ở tỉnh Constantin (Angieri), Laveran (Bác sĩ người Pháp) lần đầu

tiên phát hiện ra mầm bệnh sốt rét ở người và đặt tên là Oscillaria malariae.

Năm 1886, Golgi (người Italia) quan sát thấy kí sinh trùng phân chia vô giới

và cơn sốt trùng khớp với lúc phân chia của ký sinh trùng sốt rét.

Năm 1890, hai tác giả Grassi và Feletti đã mô tả một cách riêng rẽ mầm bệnh

Plasmodium vivax và Plasmodium malariae.

Năm 1891, Romanovski (người Nga) tìm được phương pháp nhuộm kí sinh

trùng sốt rét đã giúp cho việc nghiên cứu mầm bệnh được dễ dàng.

Từ năm 1895 – 1897, Ronald Ross (người Anh) đã nghiên cứu thực nghiệm

sốt rét trên người và chim, đã chứng minh được muỗi chính là véc tơ truyền bệnh

sốt rét.

Năm 1897, Welch đặt tên cho mầm bệnh sốt rét nhiệt đới là Plasmodium

falciparum. Sau đó nhiều tác giả đã công nhận phát minh của R.Ross, Ông đã được

nhận giải thưởng Nobel.

Năm 1912, Bass và Johns đã tiến hành nuôi cấy với các chủng ký sinh trùng

Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax, môi trường nuôi cấy lúc này glucosa

nên kết quả nuôi cấy đạt được rất hạn chế, KST SR chỉ có khả năng phát triển được

vài chục chu kỳ rồi chết.

23

Năm 1922, Stephens đã mô tả mầm bệnh sốt rét thứ 4 gây bệnh cho người là

Plasmodium ovale.

Năm 1941, với những nghiên cứu của Trager với Plasmodium lophurac,

nghiên cứu của Bull và Gieman với Plasmodium knowlesi là loại KST SR ký sinh

trên khỉ. Tuy những nghiên cứu này không duy trì được sự phát triển của KST SR

tại phòng thí nghiệm, nhưng kết quả nghiên cứu đã được các chuyên gia Tổ chức Y

tế thế giới đúc kết lại thành những kinh nghiệm để phát triển kỹ thuật nuôi cấy cho

giai đoạn.

Năm 1945 Hawking thành công trong nuôi cấy Plasmodium gallinaceum là

KST SR trên gà. Tới năm 1976, Trager và Jensen đã khám phá ra phương pháp bình

đốt nến nuôi cấy Plasmodium falciparum dài ngày. Từ đó mở ra triển vọng cung

cấp Plasmodium falciparum cho nhiều nghiên cứu miễn dịch, hóa sinh, thử thuốc

sốt rét và tạo các mẫu kháng thuốc trong ống nghiệm.

Năm 1948 – 1953, Garnham, Shortt tìm ra và mô tả thể ngoài hồng cầu ở

trong tế bào gan người của kí sinh trùng sốt rét.

Năm 1976, hai tác giả Trager và Jensen (người Mỹ) đã nuôi cấy liên tục thành

công KST SR trong ống nghiệm.

Năm 1987 – 1992, một số vaccine phòng sốt rét đã được thử trên người (ở

Colombia) và tại thực địa (ở Thái Lan); bước đầu đã đem lại kết quả nhất định.

Năm 2002, một nhóm gồm 150 nhà khoa học Mĩ và Anh đã lập được bản đồ

gen của kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum. Bản đồ gen này cung cấp một

công cụ và một cách nhìn mới, đưa đến các đích mới đầy triển vọng cho các thuốc,

vaccine và mang lại hy vọng tìm ra phương pháp điều trị mới.

1.9.2. Việt Nam

Hiện nay, ở nước ta rất ít tài liệu và công trình nghiên cứu về nuôi cấy và tạo

chủng thuần Plasmodium spp.

Năm 2000, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn tiến hành nuôi

cấy sau khi học hỏi và tiếp thu kỹ thuật từ Học Viện SR Quân đội Australia

(AAMI), Khoa Nghiên cứu SR của Bệnh Viện Chợ rẫy và Viện Sốt rét – Ký sinh

trùng – Côn trùng Trung ương. Việc nuôi cấy liên tục được tiến hành trên cơ sở các

24

chủng thuần được các Viện nghiên cứu cung cấp và thu thập KST SR từ thực địa.

Kết quả nuôi cấy trong những năm qua mới chỉ đạt được ở phân lập Plasmodium

falciparum đã được thuần chủng (F25) do Bệnh viện Chợ Rẫy cung cấp được duy

trì ổn định và phát triển tốt, cung cấp nguồn kháng nguyên cho nghiên cứu miễn

dịch và sinh học phân tử.

Năm 2005, Ngô Việt thành và cộng sự của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn

trùng Trung ương đã tạo chủng Plasmodium falciparum kháng artemisinin trong

nuôi cấy dài ngày, kết quả đạt được là tạo được 3 chủng P. falciparum có thể sống

và phát triển ở nồng độ artemisinin 50 ng/ml [14].

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài

 Địa điểm: Đề tài được tiến hành

+ Tại thực địa: tỉnh Bình Phước.

+ Tại phòng thí nghiệm: Khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét – Ký

sinh trùng – Côn trùng Thành phố Hồ Chí Minh.

 Thời gian tiến hành đề tài: 02/2017 đến 8/2017.

2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu

Những bệnh nhân trong vùng dịch tể sốt rét, có các triệu chứng như sốt, rét

run, vã mồ hôi, nôn mữa, từng mắc sổ rét [6] [17],... hoặc đi rừng ngủ rẫy được xác

định dương tính KST SR bằng phương pháp nhuộm Giêm – sa sẽ được tiến hành

thu thập mẫu nghiên cứu.

2.2.2. Thiết kế nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu: điều tra mô tả - cắt ngang.

2.2.3. Phương pháp phân tích mẫu

Việc chẩn đoán nhanh và chính xác loài KST SR gây bệnh sẽ làm tăng năng

lực điều trị bệnh sốt rét, giúp cho công tác PCSR đạt hiệu quả.

25

Cùng với sự phát triển của nhân loại, các phương pháp chuẩn đoán bệnh sốt

rét có nhiều bước tiến quan trọng như là áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong

chuẩn đoán KST SR như: test chuẩn đoán nhanh, PCR, giải trình tự,...

2.2.3.1. Phát hiện KST SR Plasmodium spp. bằng kỹ thuật nhuộm

Giêm – sa

Kỹ thuật nhuộm Giêm – sa để phát hiện ký sinh trùng Plasmodium spp. là

phương pháp cổ điển nhưng được áp dụng rộng rãi, cho đến nay vẫn được WHO coi

là chuẩn vàng trong các phương pháp phát hiện KST SR.

Thường kỹ thuật này lấy máu ngoại vi để xét nghiệm. Soi giọt dày để phát

hiện nhanh và đếm số lượng; soi giọt mỏng để định loại KST.

 Kỹ thuật nhuộm Giêm – sa để phát hiện KST SR trong máu ngoại vi

được thực hiện qua các bước sau:

 Lấy lam máu ở đầu ngón tay, kéo lam máu giọt dày và giọt mỏng

 Cố định giọt mỏng bằng metanol tuyệt đối

 Để khô tự nhiên

 Nhuộm Giêm – sa 3% trong 30 phút

 Rửa lam dưới vòi nước chảy nhẹ

 Để khô, và soi lam với vật kính x100 có sử dụng dầu soi.

 Kỹ thuật đọc kết quả nhuộm Giêm – sa: khi lam kính được nhuộm

bằng Giem – sa và xem dưới kính hiển vi, với kỹ thuật nhuộm Giêm – sa, ta có thể

phát hiện dương tính với KST SR ở nồng độ 10 – 50 KST/µl [31].

Khi soi lam kính được nhuộm Giem – sa hồng cầu bắt màu xanh tím hoặc

xanh da trời, hoặc có màu hồng nhạt. Nếu có hồng cầu bị nhiễm KST SR, thì thấy

những hạt sắc tố và hạt đặc hiệu; bạch cầu đơn nhân có màu xanh tím; tế bào chất

của bạch cầu lympho có màu xanh lơ nhạt; bạch cầu đa nhân trung tính có những

hạt to nhỏ không đều màu xanh lơ tới đỏ; KST SR có hình thể rõ ràng, nhân bắt

màu đỏ sẫm hoặc đỏ tía, nguyên sinh chất màu xanh lơ, hạt sắc tố màu tím sẫm hoặc

nâu đen ánh vàng. nhân bắt màu đỏ sẫm hoặc đỏ tía, nguyên sinh chất màu xanh lơ,

hạt sắc tố màu tím sẫm hoặc nâu đen ánh vàng [54].

26

Trung bình phải xem mỗi lam 20 phút (theo WHO). Chỉ được kết luận âm tính

khi đã soi tới 100 đến 200 vi trường trên giọt dày (hoặc ít nhất > 50.000 hồng cầu

trên giọt mỏng).

Chỉ được kết luận dương tính khi thấy thể vô tính trong hồng cầu.

 Phương pháp dùng hệ thống dấu “+” để đánh giá mật độ KST SR

(+) (1 cộng)  10 ký sinh trùng trên 100 vi trường:

(++) (2 cộng)  11-100 ký sinh trùng trên 100 vi trường:

(+++) (3 cộng)  Mật độ 1-10 ký sinh trùng trên 1 vi trường:

(++++) (4 cộng)  Mật độ >10 ký sinh trùng trên 1 vi trường:

Hình 2.1. Các bước tiến hành trong kỹ thuật nhuộm Giêm – sa định danh KST SR [12]

27

Hình 2.2. Hình thể KST SR Plasmodium falciparum soi bằng kỹ thuật nhuộm

Giêm – sa [36]

Hình 1: Hồng cầu bình thường; Hình 2 – 18: Tư dưỡng (Hình 2 – 10 tư dưỡng

dạng nhẫn); Hình 19 – 26: Phân liệt (Hình 26 phân liệt đã vỡ);

Hình 27, 28: Giao bào cái trưởng thành; Hình 29,30: Giao bào đực trưởng thành.

28

Hình 2.3. Hình thể KST SR Plasmodium vivax soi bằng kỹ thuật nhuộm

Giêm – sa [36]

Hình 1: Hồng cầu bình thường; Hình 2 – 6: Tư dưỡng trẻ (dạng nhẫn); Hình 7 –

18: Tư dưỡng; Hình 19 – 27: Phân liệt; Hình 28 và 29: Giao bào cái; Hình 30: Giao

bào đực.

29

Hình 2.4. Hình thể KST SR Plasmodium malariae soi bằng kỹ thuật nhuộm

Giêm – sa [36]

Hình 1: Hồng cầu bình thường; Hình 2-5: Tư dưỡng trẻ (dạng nhẫn); Hình 6 –

13: Tư dưỡng; Hình 14 – 22: Phân liệt; Hình 23: Giao bào non; Hình 24: Giao bào

cái; Hình 25: Giao bào đực.

30

Hình 2.5. Hình thể KST SR Plasmodium ovale soi bằng kỹ thuật

nhuộm Giêm – sa [36]

Hình 1: Hồng cầu bình thường; Hình 2 – 6: Tư dưỡng trẻ (dạng nhẫn); Hình 7 –

18: Tư dưỡng; Hình 19 – 27: Phân liệt; Hình 28 và 29: Giao bào cái; Hình 30: Giao

bào đực.

31

2.2.3.2. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Nested – PCR [40] [46] [54].

Kỹ thuật Nested – PCR coi là chuẩn vàng chuẩn đoán KST SR bằng kỹ thuật

sinh học phân tử, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao (0,1 KST/µl máu toàn phần) [32],

tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và đội ngũ nhân viên có

kiến thức về sinh học phân tử.

Sử dụng kỹ thuật Nested – PCR giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu cho sản

phẩm PCR, đoạn gene bảo tồn 18s Ribosome là đoạn gene bảo tồn của Eukaryote

được sử dụng nhiều trong việc phát hiện và điều tra tính đa dạng loài. Do đặc tính

bảo tồn của đoạn gene mã hóa 18S Ribosome, chúng tôi tiến hành khếch đại đoạn

gene mã hóa 18S Ribosome bảo tồn của KST SR.

2.2.3.2.1. Giới thiệu khái quát về kỹ thuật PCR và phương pháp phát hiện

KST SR bằng kỹ thuật PCR

PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra

nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli

hay nấm men.

PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục

đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những

bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.

PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một

phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy

trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilo

basepair = kilo cặp base = 1000 cặp base). Phản ứng PCR cho độ nhạy cao (>90 %),

độ đặc hiệu (100%), tùy thuộc vào đoạn mồi được chọn.

 PCR cần rất nhiều thành phần:

 DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại

 Cặp mồi (primer), là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung

với một đầu của mạch khuôn, để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch

đại.

 DNA – polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA.

32

 Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu cho DNA – polymerase để xây

dựng DNA mới.

 Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA – polymerase

 Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt, là một chuỗi gồm

nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: Biến tính.

 Phá vỡ cầu nối Hydrogen nối 2 sợi DNA. Nhiệt độ tăng lên

94 – 96°C để tách hai sợi DNA ra.

 Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để

đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn.

 Thời gian: 1 – 2 phút.

Bước 2: Gắn mồi.

 Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn

vào sợi DNA đơn.

 Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt

độ biến tính 50°C (45 – 60°C).

 Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn

hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện.

 Thời gian: 1 – 2 phút.

Bước 3: Kéo dài.

 DNA – polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt

động dọc theo sợi DNA.

 Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc vào nhiệt độ của DNA – polymerase.

 Thời gian của bước này phụ thuộc vào chiều dài của

DNA – polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại.

33

Hình 2.6. Hình minh họa các bước trong phản ứng PCR

2.2.3.2.2. Kỹ thuật tách chiết DNA KST SR Plasmodium spp.: theo quy trình

tách chiết từ giấy thấm Whatmann 3MM theo kit tách chiết DNA, Thermo DNA

blood mini kit. (Tách chiết DNA từ máu khô)

 Cắt nhỏ mảnh giấy thấm Whatmann 3MM có chứa mẫu máu khô và cho

vào tube eppendorf.

 Thêm 200 µl dung dịch 1x PBS và ủ 5 – 10 phút ở nhiệt độ phòng.

 Thêm 20 µl proteinase K Solution vào 200 µl máu, trộn bằng vortex.

 Tiếp theo thêm 400 µl Lysis Solution, trộn kỹ bằng vortex hoặc pipet.

Chú ý: Nếu tách chiết DNA từ lượng máu ít hơn 200 µl, phải thêm vào một

lượng dung dịch 1X PBS để đảm bảo mẫu đạt 200 µl.

 Ủ mẫu ở 56oC trong 10 phút, trong quá trình ủ thỉnh thoảng vortex hoặc ủ

bằng shaking water bath, nền đá lạnh hoặc thiết bị trộn nhiệt cho đến khi toàn bộ tế

bào bị tiêu vỡ.

 Thêm 200 µl ethanol (96 – 100%) và trộn bằng pipet.

 Chuyển tất cả dung dịch đã chuẩn bị ở trên vào Spin collumn.

 Li tâm 1 phút 6000 x g (khoảng 8.000 rpm).

 Loại bỏ Collection tube và dung dịch chảy qua màng của spin collumn.

 Đặt Collumn vào một Collection tube 2ml mới.

34

Quan trọng: Lực ly tâm không vượt quá mức hướng dẫn.

Chú ý: Đóng kỹ túi chứa các Spin collumn sau khi lấy ra dùng.

 Thêm 500 µl Wash Buffer WB1.

 Ly tâm 1phút 8000 x g (khoảng 10.000 rpm).

 Đổ bỏ dung dịch trong Collection tube và đặt collumn trở lại vào

Collection tube.

 Thêm 500 µl Wash buffer II vào Collumn.

 Ly tâm 3 phút ở tốc độ lớn nhất (≥ 20.000 x g; ≥ 14.000 rpm)

 Đổ bỏ dung dịch trong Collumn tube.

 Đặt cột tinh sạch trở lại tube và ly tâm lại trong 1 phút ở tốc độ lớn nhất (≥

20.000 x g; ≥ 14.000 rpm).

 Loại bỏ Collection tube và dung dịch trong đó. Chuyển Collumn vào tube

eppendorf 1.5 ml đã tiệt trùng.

 Thêm 200 µl Elution Buffer vào giữa màng của collumn rữa giải DNA.

 Ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng.

 Ly tâm 1 phút ở 8000 x g (khoảng 10.000 rpm)

Chú ý: Để thu được lượng DNA tối đa có thể lặp lại bước này lần 2.

Nếu yêu cầu nồng độ DNA đậm đặc hơn hoặc DNA được tách chiết từ lượng

mẫu nhỏ (50 µl) thì lượng Elution buffer thêm vào Column có thể từ

50 – 100 µl. Nhưng nếu lượng Elution Buffer thấp hơn thì lượng DNA được rữa

giải cũng sẽ thấp hơn.

 Loại bỏ purification collumn.

 Lưu giữ DNA đã tách chiết trong tủ âm sâu ở - 20oC

35

2.2.3.2.3. Kỹ thuật Nested – PCR phát hiện KST SR:

Các mẫu được xác định dương tính với KST SR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm –

sa sẽ được tiến hành định danh KST SR bằng kỹ thuật Nested – PCR:

 Tách chiết DNA từ mẫu giấy thấm Whatmann 3MM có chứa DNA KST

SR theo bộ kit Thermo blood mini kit.

 Chạy Nested – PCR để định danh KST gây bệnh sốt rét với trình tự mồi.

Bảng 2.1. Trình tự mồi của phản ứng PCR – Nested 1, PCR – Nested 2.

Phản ứng Trình tự mồi ( 5’ – 3’) Tên mồi

PLU5 5’-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC -3’

Plasmodium spp. PCR – Nested 1 PLU6 5’-TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3’

FAL1 5’-TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT -3’

FAL2 5’-ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC -3’ Plasmodium falciparum PCR – Nested 2

VIV1 5’-CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3’

VIV2 5’-ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3’ Plasmodium vivax PCR – Nested 2

MAL1 5’-ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3’

MAL2 5’-AAA ATT CCC ATG CAT AAA AAA TTA TAC AAA -3’ Plasmodium malariae PCR – Nested 2

OVA1 5’-ATC TCT TTT GCT ATT TTT TAG TAT TGG AGA -3’

OVA2 5’-GGA GGG GGA CAC ATT TGT ATC CTA GTG -3’ Plasmodium ovale PCR – Nested 2

Bảng 2.2. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR –Nested xác định

loài Plasmodium spp.

Thành phần phản ứng Thể tích Chu trình phản ứng

Nước cất 8.5 µl 95oC 5 phút 1 chu kì

My Taq Mix 12.5 µl 94oC 1 phút

Mồi xuôi (2.5 µM) 0.5 µl 58oC 2 phút 27 chu kì

Mồi ngược (2.5 µM) 0.5 µl 72oC 2 phút

36

DNA 3 µl 72oC 8 phút 1 chu kì

Bảng 2.3. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR – Nested 2 xác

định loài 04 loài Plasmodium spp.

Thành phần phản ứng Thể tích Chu trình phản ứng

Nước cất 5 phút 1 chu kì 8.5µl 95oC

My Taq Mix 12.5 µl 94oC 1 phút

Mồi xuôi (2.5 µM) 2 phút 30 chu kì 0.5 µl 58oC

Mồi ngược (2.5 µM) 0.5 µl 72oC 2 phút

DNA 3 µl 72oC 8 phút 1 chu kì

2.2.3.2.4. Kỹ thuật Nested – PCR để phát hiện điểm đột biến K13 liên quan

đến kháng artemisinin [33] [38] [41] [44] [46].

Các mẫu được xác định dương tính với P. falciparum đơn thuần bằng kỹ thuật

Nested – PCR để định danh KST SR sẽ được tiến hành thực hiện chạy Nested –

PCR K13 để phát hiện đột biến K13 kháng artemisinin.

Kỹ thuật Nested – PCR giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu cho kỹ thuật PCR.

DNA sử dụng cho phản ứng K13 PCR – Nested 1 là DNA gốc của KST SR được

tách chiết từ giấy thấm Whatmann 3MM theo bộ kit của Thermo blood mini kit.

Bảng 2.4. Trình tự mồi khuếch đại đọan K13

5’ – CGG AGT GAC CAA ATC TGG GA – 3'

K13_PCR_F

Phản ứng Tên mồi Trình tự mồi ( 5’ – 3’)

K13 – PCR

K13_PCR_R 5’ – GGG AAT CTG GTG GTA ACA GC – 3’

K13_N1_F 5’ – GCC AAG CTG CCA TTC ATT TG – 3’

K13 PCR – Nested 1 K13_N1_R 5’ – GCC TTG TTG AAA GAA GCA GA – 3’

37

Bảng 2.5. Phản ứng Nested – PCR khếch đại K13 lần 1:

Thành phần phản ứng Thể tích Chu trình phản ứng

Nước cất 7.5 µl 95oC 15 phút 1 chu kì

My Taq Mix 12.5 µl 94oC 30 giây

Mồi xuôi K13- PCR (2.5µM) 0.5 µl 58oC 2 phút

Mồi ngược K13- PCR (2.5µM) 0.5 µl 72oC 2 phút 30 chu kì

DNA 5 µl 72oC 10 phút 1 chu kì

Bảng 2.6. Phản ứng Nested – PCR khếch đại K13 lần 2:

Thành phần phản ứng Thể tích Chu trình phản ứng

1 chu kì Nước cất 7.5 µl 95oC 15 phút

My Taq Mix 12.5 µl 95oC 30 giây

Mồi xuôi K13- N1 (2.5µM) 0.5 µl 58oC 2 phút

Mồi ngược K13 –N1 (2.5µM) 0.5 µl 72oC 2 phút 40 chu kì

1 chu kì DNA 5 µl 72oC 10 phút

DNA sử dụng cho chu trình PCR – Nested 2 này là sản phẩm của

PCR – Nested 1 của K13.

Quy trình khuếch đại đoạn K13 theo quy trình được công bố của Frédéric

Ariey (tác giả công bố đọan đột biến K13), Unité d’Immunologie Moléculaire des

Parasites, Institut Pasteur, Paris, France [37] [38].

Để so sánh các điểm đột biến trên K13, chúng tôi sử dụng trình tự tham chiếu

từ chủng P. falciparun dòng 3D7 được công bố tại Plasmodium Genomics Resource

(PGR) [53] với kích thước trình tự là 2181 bp.

2.2.3.2.5. Đọc kết quả điện di:

 Sản phẩm Nested – PCR được xác định bằng cách điện di trên gel agarose

2% và nhuộm Ethidium Bromide với đệm TBE 0.5 X, trong thời gian 30 phút, với

điện thế 110 Vol.

38

 Chụp ảnh gel sau khi chạy điện di bằng hệ thống chụp ảnh chuyên dụng

Bio – Rad.

 Phân tích kết quả: Hình ảnh điện di được phân tích bằng máy chụp ảnh

điện di.

 Đánh giá sản phẩm Nested – PCR xác định loài Plasmodium spp.

 Kích thước Nested – PCR đặc hiệu cho P. falciparum: 205 bp

 Kích thước Nested – PCR đặc hiệu cho P. vivax: 120 bp

 Kích thước Nested – PCR đặc hiệu cho P. malariae: 144 bp

 Kích thước Nested – PCR đặc hiệu cho P. ovale: 786 bp

 Đánh giá sản phẩm PCR xác định đột biến K13.

 Kích thước PCR đặc hiệu cho K13: 849 bp [37] [38]

2.2.3.3. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật giải trình tự

DNA là cơ sở hóa học của gen. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai

mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờ các base của chúng, đó

là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này nối

kết liên tiếp với nhau theo một thứ tự xác định.

Giải trình tự của gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide

này trên phân tử DNA.

Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương

pháp enzyme, nhưng khi làm giải trình tự thì thường dùng các máy tự động chứ

không dùng kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây.

Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản

sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch

điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser.

Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính yếu, đó là: phần

điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di

polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát

hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước

nó.

39

Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một

vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng

này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng

trong biểu đồ.

Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh

tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA.

Máy gồm hai phần: phần điện di gel polyacrylamide, phần phát hiện các vạch

điện di. Các vạch điện di được các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia

laser và phát sáng lên. Tín hiệu được mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị

thành các đỉnh cường độ sáng.

Hình 2.9. Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tư dùng bản

gel polyacrylamide.

2.2.3.4. Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm DNA để giải trình tự

Trước khi giải trình tự, sản phẩm PCR của đoạn cần giải trình tự cần được tinh

sạch DNA và các sản phẩm tạp trong quá trình PCR.

Việc tinh sạch DNA được thực hiện trên bộ kit Expin PCR SV – GeneAll như

sau:

 Cho 5 lần thể tích Buffer PB vào 1 thể tích mẫu, trộn mẫu và chuyển sang

cột. VD: 100 µl Buffer PB + 20 µl mẫu

 Ly tâm 30 giây, 10.000 x g (> 12.000 rpm), bỏ dịch ly tâm

40

 Cho 700 µl Buffer NW, ly tâm 30 giây, 10.000 x g, bỏ dịch ly tâm

 Ly tâm 1 phút, 10.000 x g

 Thay cột sang ống 1,5 mL mới

 Cho 20 – 30 µl nước vào cột, lưu ý: thao tác để dung dịch vào đúng trung

tâm của màng.

 Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút – 5 phút.

 Ly tâm 10.000 x g, 1 phút.

 Đo nồng độ DNA sau khi được tinh sạch

2.2.3.4.1. Kỹ thuật PCR giải trinh tự

 Thành phần phản ứng để giải trình tự

 Thành phần cho một phản ứng PCR giải trình tự:

Bảng 2.7. Thành phần các hóa chất sử dụng trong PCR của giải trình tự

Hóa chất Thể tích

8 µl 3 µl 3.2µl 5.8 µl Hỗn hợp phản ứng Mẫu Mồi H2O

Tổng thể tích 20 µl

 Thành phần phản ứng Control:

Bảng 2.8. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng Control

của giải trình tự

Thể tích Hóa chất

8 µl 1 µl 4 µl 7 µl Hỗn hợp phản ứng Mẫu Mồi H2O

20 µl Tổng thể tích

41

 Chu trình nhiệt:

+ 96oC: 1 phút

+ 25 chu kỳ 96oC: 10 giây

50oC: 5 giây

60oC: 4 phút

+ Giữ nhiệt 4oC

 Chuẩn bị nguồn DNA cho giải trình tự:

Sau khi mẫu DNA được tinh sạch và chạy PCR tinh sạch xong, ta tiến hành

chạy giải trình tự bằng cách gắn tín hiệu huỳnh quang vào DNA theo kit BigDye

Xterminator Purinfication của GeneAll.

 Vortex dd XTerminator: ở tốc độ tối đa, trong ít nhất 10 giây

 Chuẩn bị hỗn hợp XTerminator và SAM solution. Lưu ý: sử dụng đầu tip

có đường kính lỗ >1 mm, nếu để XTerminator để lắng trong quá 2 phút phải được

vortex lại. Nếu SAM solution có xuất hiện kết tủa, cho ủ ở 37oC, và để nguội về

nhiệt độ phòng.

 Mẫu sau khi PCR sequencing, ly tâm mẫu trong 1 phút

 Chia hỗn hợp đã chuẩn bị vào mẫu.

 Lưu ý: chia mẫu nhanh, tránh hỗn hợp bị lắng.

 Vortex mẫu 30 phút, tốc độ 2000 rpm.

 Ly tâm mẫu 2000 vòng/ 2 phút

 Giải trình tự trên máy giải trình tự tự động 3500 của hãng Applied

Biosystems Thermo Scientific – Mỹ:

 Hút 80 µl mẫu vào đĩa giải trình tự, đậy septa.

 Đặt đĩa vào khay đĩa, đậy nắp khay đúng khớp.  Đưa khay đĩa vào máy giải trình tự để giải trình tự. 2.2.3.4.2. Phân tích kết quả giải trình tự:

Các kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần miền BioEdit và Clustal

42

2.2.4. Kỹ thuật cất đông chủng ký sinh trùng sốt rét

Các mẫu đã được định danh bằng kỹ thuật Nested – PCR, sẽ tiến hành rửa

hồng cầu nhiễm bằng môi trường nuôi cấy RPMI 1640 của Sigma và cho ly tâm

2000 vòng/5 phút (3 lần) để loại bỏ huyết thanh và chất chống đông. Sau đó cho

chất chống đông với tỉ lệ 1ml hồng cầu : 1ml chất chống đông, và được ghi lại trong

sổ nhật ký: tên mẫu, loại ký sinh trùng nhiễm, mật độ và giữ trong bình ni tơ lạnh để

lưu trữ.

2.2.5. Kỹ thuật nuôi cấy dài ngày để tạo chủng Plasmodium spp. thuần

Sau khi xác định ca bệnh dương tính với Plasmodium spp. và được sự đồng ý

của bệnh nhân, chúng tôi tiến hành lấy 2 giọt máu tĩnh mạch cho vào giấy thấm

Whatmann 3MM, 4ml máu tĩnh mạch cho vào ống nghiệm có chứa sẵn heparin [55].

Ký sinh trùng sốt rét ký sinh vào hồng cầu và phụ thuộc vào sự gắn kết của

các ký sinh trùng ký sinh trùng với các thụ thể bề mặt tế bào để xâm nhập. Trong số

này, ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum là nguy hiểm nhất do có thể gây

ra SRAT với tỉ lệ tử vong cao [47].

Việc nuôi cấy KST SR Plasmodium spp., tác nhân gây bệnh sốt rét trong in

vitro đã và đang là một thành công lớn nghiên cứu, dẫn đến hiểu biết sâu hơn về ký

sinh trùng sốt rét [49] [57].

Ống nghiệm có chứa ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp. thu thập tại thực

địa, được chuyển về phòng thí nghiệm khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét –

Ký sinh trùng – Côn trùng Tp. Hồ Chí Minh bằng dụng cụ chứa mẫu có nhiệt độ

bảo quản là 4oC. Khi ống nghiệm có chứa KST SR về đến phòng thí nghiệm, sẽ

được bảo quản trong tủ bảo ôn và tiến hành định danh bằng kỹ thuật PCR và giải

trình tự.

Những chủng có dương tính P. falciparum đơn thuần hoặc P. vivax đơn thuần

bằng kỹ thuật Nested – PCR sẽ được chúng tôi tiến hành nuôi cấy liên tục dài ngày

trong phòng thí nghiệm, các chủng nhiễm phối hợp sẽ được cất đông trong ni tơ

lỏng.

43

2.2.5.1. Kỹ thuật nuôi cấy chủng P. falciparum thuần:

Trước khi tiến hành nuôi cấy, những mẫu máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét

Plasmodium falciparum thuần được ly tâm 2000 vòng/5 phút, hút bỏ dịch nổi để

phân lập hồng cầu nhiễm KST SR.

Sau đó cho thêm môi trường RPS tỉ lệ 2:1 ly tâm 2000 vòng/5 phút, hút bỏ

dịch nổi (thực hiện 2 lần).

Cho môi trường RPHS tỉ lệ 2:1 ly tâm 2000 vòng/5 phút, hút bỏ dịch nổi và

tiến hành nuôi cấy.

Nuôi cấy chủng P. falciparum thuần dài ngày tại phòng thí nghiệm khoa Nuôi

[60], có môi trường dinh dưỡng giàu acid amin RPMI 1640, Hepes, Gentamicin,

cấy – Miễn dịch được thực hiện bằng phương pháp bình nến của Trager và Jensen

[37].

NaHCO3 và hồng cầu O hoặc A, 10 % huyết thanh AB, đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ

37oC [16] [56], với 5% CO2

2.2.5.2. Kỹ thuật nuôi cấy chủng P. vivax thuần

Để chuẩn bị cho việc nuôi cấy, những mẫu máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét

P. vivax thuần được ly tâm 2000 vòng/5 phút, hút bỏ dịch nổi để phân lập hồng cầu

nhiễm KST SR.

Sau đó cho thêm môi trường RPS tỉ lệ 2:1 ly tâm 2000 vòng/5 phút, hút bỏ

dịch nổi (thực hiện 2 lần).

Cho môi trường RPHS tỉ lệ 2:1 ly tâm 2000 vòng/5 phút, hút bỏ dịch nổi và

tiến hành nuôi cấy.

Nuôi cấy Plasmodium vivax dài ngày tại phòng thí nghiệm của khoa Nuôi cấy

– Miễn dịch được thực hiện bằng phương pháp bình nến của Trager và Jensen [60],

có môi trường dinh dưỡng giàu acid amin RPMI 1640, Hepes, Gentamicin,

[37].

NaHCO3 và hồng cầu non nhóm máu O [61], 10 % huyết thanh AB, đặt trong tủ ấm ở

nhiệt độ 37oC [16] [56] [57], với 5% CO2

2.4.5.3. Môi trường nuôi cấy

Môi trường để tiến hành thí nghiệm là môi trường nuôi cấy RPMI 1640 để tiến

hành nuôi giữ chủng KST SR (Phụ lục 3)

 Môi trường RPMI 1640

44

 Môi trường RPS để rửa hồng cầu

 Môi trường đầy đủ RPHS

2.4.5.4. Chuẩn bị hồng cầu lành

 Lấy 10ml máu tĩnh mạch nhóm O cho vào tube ly tâm có chứa chất chống

đông: 0,25 – 0,3 ml ACD cho 1 ml máu.

 Trộn đều máu và ACD.

 Ly tâm 2000 vòng/ 5 phút. Hút bỏ phần nổi.

 Thêm môi trường RPS (môi trường không có huyết thanh) vào cặn hồng

cầu theo tỷ lệ 2 : 1

 Ly tâm 2000 vòng/ 5 phút.

 Hút bỏ phần nổi. Rửa 2 lần với môi trường RPS.

 Lần thứ 3 rửa với môi trường đầy đủ có 10% huyết thanh (RPHS).

 Trộn cặn hồng cầu với môi trường RPHS để có dịch treo 40 %

(4 ml hồng cầu + 6 ml RPHS).

 Chia vào các lọ nhỏ (2 – 3 ml).

 Ghi ngày lấy máu.

 Kiểm tra vô trùng: Lấy 1 ít hồng cầu vừa rửa cho vào lọ có chứa 1ml môi

 Bảo quản hồng cầu ở 4oC trong vòng 30 ngày.

trường RPMI, đặt vào tủ ấm 37oC trong 24h. Nếu tủa trắng đục là nhiễm trùng, phải

bỏ đi.

2.4.5.5. Chuẩn bị huyết thanh nuôi cấy

 Lấy 250 ml máu nhóm O (hoặc AB với các chủng mới phân lập), không

cho chất chống đông cho vào chai hoặc lọ thủy tinh vô trùng.

 Để lọ nằm nghiêng (bề mặt tiết diện càng rộng, sự tách huyết thanh càng

lớn).

 Để ở nhiệt độ phòng 1 – 2 giờ, sau đó để tủ lạnh 4oC qua đêm.

 Dùng pipett nhẹ nhàng hút phần huyết thanh chuyển vào tube ly tâm. Ly

tâm 2000 vòng trong 5 phút.

 Hút phần huyết thanh nổi ở trên chia vào các lọ nhỏ.

45

 Ghi tên nhóm máu, số lượng và ngày tách trên lọ.

 Kiểm tra vô trùng giống như với hồng cầu.

 Tiệt trùng huyết thanh ở 56oC trong 30 phút (đặt trong nồi cách thủy, chú

ý không để nước ngập tới nắp của lọ).

 Để nguội và bảo quản ở - 20oC trong vòng 180 ngày.

2.4.5.6. Phá đông chủng KST SR Plasmodium spp.

 Lấy các mẫu từ trong nitơ lỏng ra và làm tan đông bằng cách đặt tube máu

vào nồi cách thuỷ 37oC trong 1 – 2 phút.

 Chuyển máu đã được làm tan sang tube ly tâm.

 Cho đồng thể tích dung dịch sorbitol 27% (nhỏ từng giọt và trộn

nhẹ nhàng).

 Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút.

 Hút bỏ phần nổi.

 Thêm sorbitol 5% vào cặn hồng cầu theo tỉ lệ (2 : 1). Trộn nhẹ nhàng sau

khi nhỏ từng giọt. (Rửa 2 lần với sorbitol 5%).

 Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút.

 Hút bỏ phần nổi.

 Thêm RPHS vào cặn hồng cầu theo tỷ lệ 2 : 1 và rửa 3 lần.

 Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút.

 Hút bỏ phần nổi.

 Treo hồng cầu vào môi trường đầy đủ (RPHS) với 20% huyết thanh để có

dịch treo 4%.

 Chia vào các đĩa petri có thể tích 3 ml.

2.2.6. Điều kiện nuôi cấy

2.2.6.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro Plasmodium spp.

 Phòng nuôi cấy được vệ sinh bằng dung dịch Javel 5%.

 Các dung dịch dùng trong nuôi cấy phải được lọc vô trùng qua màng lọc

millipore 0,2 µm và bảo quản ở 4oC hoặc - 20oC tuỳ theo từng loại.

46

 Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh (chai, lọ có thể tích 5ml, 10ml, 50ml, 100ml,

200ml,...) phải được ngâm trong dung dịch acid sulfocromic đậm đặc ít nhất 3 giờ.

Rửa sạch dưới vòi nước và ngâm trong nước cất 2 lần. Để khô và sấy vô trùng ở

nhiệt độ 180oC trong 30 phút.

 Đối với những nắp nhựa hoặc cao su hấp ướt ở 121oC trong 30 phút, với

áp suất 1 atm.

 Khi rửa các dụng cụ bằng thuỷ tinh phải đeo găng tay dày. Đeo kính và

găng tay khi tiếp xúc với dung dịch sulfocromic đậm đặc.

 Khi làm việc trong phòng vô trùng phải có áo choàng, thay dép. Rửa tay,

đeo găng và sát trùng bàn bằng cồn ethanol 70o trước và sau khi làm việc.

 Các pipett dùng trong nuôi cấy KST phải dùng quả bóp cao su hoặc pipett

trợ giúp (pipett aid), tuyệt đối không dùng miệng để hút.

 Tất cả các dụng cụ bẩn đều được bỏ vào thùng đựng rác y tế, chuyển ra

khỏi phòng vô trùng sau khi đã làm xong, và được hấp bỏ.

 Cuối ngày phải vệ sinh lại phòng và bật đèn cực tím qua đêm.

2.2.6.2. Điều kiện trong lấy mẫu tại thực địa

 Nơi tiến hành lấy máu phải thoáng và sạch.

 Tất cả các dụng cụ dùng cho thực nghiệm phải đảm bảo vô trùng. Sát

trùng bằng cồn ethanol 70o trước khi mở các lọ môi trường và hoá chất.

 Kiểm tra tất cả các dụng cụ trước khi tiến hành thử nghiệm, tránh dùng

những dụng cụ hỏng hoặc không tốt.

 Trong khi thao tác kỹ thuật phải đảm bảo vô trùng, tránh nhiễm.

 Rửa sạch tay bệnh nhân trước khi lấy máu bằng xà phòng và sát trùng

bằng cồn ethanol 70o.

 Tuyệt đối không dùng chung kim chích máu. Để đề phòng các bệnh lây

nhiễm qua đường máu (HIV, Viêm gan siêu vi,…) phải dùng găng tay khi tiếp xúc

với máu của bệnh nhân. Tránh máu dính vào da hoặc qua các niêm mạc mắt, mũi .

 Rửa tay trước và sau khi làm việc với xà phòng sau đó dùng ethanol 70o

để sát trùng.

47

 Khi ly tâm các mẫu máu không dùng quá tốc độ cho phép tránh gây vỡ.

 Khi vận chuyển các mẫu máu phải vặn chặt nắp cẩn thận, quấn màng

paraphin và đựng trong túi nilon kín.

 Những rác thải (kim, bơm tiêm, bông, các phiến nhựa đã dùng,…) phải

được để vào nơi qui định về chất thải y tế.

2.3. Thống kê và xử lý số liệu

Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Excel 2013®, các kết quả

giải trình tự được sử dụng phần mềm BioEdit, Clustal, Mega và được so sánh với

Gene Bank.

2.4. Y đức

Bệnh nhân được giải thích về mục đích của nghiên cứu này và có quyền từ

chối tham gia nghiên cứu mà không ảnh hưởng đến sự chăm sóc y tế

cần thiết.

Trả lời kết quả soi KST SR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa trong vòng 2 giờ

cho những người có triệu chứng rét run, sốt, vã mồ hôi, nôn ói,... sống trong vùng

dịch tể sốt rét.

Tất cả bệnh nhân được xác định dương tính với KST SR đều được điều trị

theo phác đồ điều trị sốt rét của Bộ Y tế.

48

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

3.1. Kết quả xác thu thập mẫu và xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ

thuật nhuộm giêm – sa

Những đối tượng đi rừng, ngủ rẫy hoặc những bệnh nhân đã từng mắc sốt rét,

người dân trong vùng dịch tể sốt rét có các triệu chứng lâm sàng như sốt, ớn lạnh,

vã mồ hôi,... đều được chúng tôi lấy máu ngoại vi, và sử dụng kỹ thuật nhuộm Giêm

– sa để phát hiện ký sinh trùng sốt rét.

Những bệnh nhân có kết quả dương tính với ký sinh trùng sốt rét, và được sự

chấp thuận của bệnh nhân, chúng tôi sẽ tiến hành thu thập máu trên giấy thấm

Whatmann 3MM, 4 ml máu tĩnh mạch cho vào tube ống có chứa heparin sẽ được

gởi về phòng thí nghiệm khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng –

Côn trùng Tp. Hồ Chí Minh để tiến hành các bước nghiên cứu tiếp theo.

Với kỹ thuật nhuộm Giêm – sa vẫn là tiêu chuẩn vàng trong chuẩn đoán KST

SR, nhưng bên cạnh đó vẫn còn nhiều hạn chế của kỹ thuật nhuộm Giêm – sa đã

dẫn đến việc định danh nhầm giữa các loài Plasmodium spp., cũng như không phát

7,8 µm

hiện được KST SR ở mật độ thấp [34] [42].

Hình 3.1. Hình thể KST SR P. falciparum bằng kỹ thuật nhuộm

giêm – sa.

7,8 µm

49

Hình 3.2. Hình thể KST SR P.vivax bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa.

Trong quá trình tiến hành đề tài, chúng tôi đã phát hiện được 30 ca bệnh

dương tính với KST SR bằng kỹ thuật nhuộm Giem - sa. Với kết quả được thể hiện

trong bảng 3.1.

Dựa trên kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa, trong

tổng số 30 mẫu được xác định là dương tính với Plasmodium spp.: 2 mẫu nhiễm

phối hợp P. falciparum và P. vivax (chiếm 6.7 %), 5 mẫu nhiễm P. vivax (16.7 %),

23 mẫu nhiễm P. falciparum (76.6 %), trong quá trình tiến hành đề tài chúng tôi

không phát hiện bệnh nhân nhiễm KST SR P. malariae và P. ovale.

Bảng 3.1. Kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật giêm – sa

Mã số BN Xác định loại KST SR Mật độ KST SR Nhiệt độ cơ thể (oC)

BP 1 P. falciparum +++ 40

BP 2 P. falciparum ++ 38,7

BP 3 P. falciparum + 40

BP 4 P. falciparum + 39

BP 5 P. falciparum ++++ 38,9

BP 6 P. falciparum ++ 38,2

BP 7 38,5 P. falciparum + P. vivax P.f ++/P.v +

BP 8 P. falciparum +++ 39,3

50

++ BP 9 P. falciparum 37,1

+++ BP 10 P. falciparum 39

++ BP 11 P. falciparum 38,5

++ BP 12 P. vivax 37

+++ BP 13 P. falciparum 38,2

+ BP 14 P. vivax 38,2

+ BP 15 P. falciparum 38,9

+++ BP 16 P. vivax 38,9

+ BP 17 P. falciparum 39,5

BP 18 P. falciparum + P. vivax Pf +/Pv + 38,8

+++ BP 19 P. falciparum 36,7

++++ BP 20 P. falciparum 38

++ BP 21 P. falciparum 38,3

+++ BP 22 P. falciparum 40,5

++ BP 23 P. vivax 37,6

++++ BP 24 P. falciparum 41

++ BP 25 P. falciparum 38,3

+ BP 26 P. falciparum 37,7

+++ BP 27 P. falciparum 39,3

+ BP 28 P. falciparum 37,5

+ BP 29 P. vivax 37,3

++ BP 30 P. falciparum 38,5

3.2. Kết quả xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật

Nested – PCR

Các mẫu máu có KST SR được thu thập trên giấy thấm Whatmann 3MM, sẽ

được tách chiết DNA theo quy trình tách chiết DNA từ giấy thấm, DNA tách chiết

được sẽ tiến hành chạy Nested – PCR để định danh bằng phương pháp sinh học

phân tử.

51

Trong 30 mẫu máu được xác định KST SR dương tính bằng kỹ thật nhuộm

Giêm – sa, chúng tôi đã tiến hành định danh bằng kỹ thuật Nested – PCR tại phòng

thí nghiệm khoa Nuôi cấy – Miễn dịch. Kết quả xác định bằng phương pháp PCR

được thể hiện trong Bảng 3.2

Qua kết thực hiện kỹ thuật Nested – PCR định danh ký sinh trùng sốt rét,

chúng tôi nhận thấy 30 mẫu dương tính với KST SR được thu thập ở vùng sốt rét

lưu hành tỉnh Bình Phước có: 14 mẫu nhiễm P. falciparum (46,7 %), 12 mẫu nhiễm

P. vivax (40,0 %), 4 mẫu nhiễm phối hợp P. falciparum – P. vivax (13,3 %) được

thể hiện ở hình 3.3.

205 bp

120 bp

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm DNA Plasmodium spp.

Ghi chú:

: Vị trí nạp DNA của P. vivax kích thước 120 bp

: Vị trí nạp DNA của P. falciparum kích thước 205 bp

Giếng V Giếng –V : Vị trí nạp DNA của chứng âm P. vivax Giếng +V : Vị trí nạp DNA của chứng dương P. vivax Giếng F Giếng –F : Vị trí nạp DNA của chứng âm P. falciparum Giếng +F : Vị trí nạp DNA của chứng dương P. falciparum Giếng M : Vị trí nạp DNA của P. malariae Giếng O Giếng T : Vị trí nạp DNA của P. ovale : Vị trí nạp thang kích thước 100 bp

52

Bảng 3.2. Kết quả xác định chủng bằng kỹ thuật Nested –PCR

Tên chủng Số lượng Tỷ lệ %

Plasmodium falciparum 14 46,7 %

Plasmodium vivax 12 40,0 %

Nhiễm phối hợp P. falciparum và P.vivax 4 13,3 %

Tổng 30 100,0 %

Từ kết quả định danh bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa và kỹ thuật Nested -

PCR, chúng tôi đã tiến hành so sánh, kết quả so sánh được thể hiện ở hình 3.4. Giữa

2 kỹ thuật trên có sự khác biệt trong định danh KST SR. Từ đó, cho thấy kỹ thuật

nhuộm Giêm – sa có sự nhầm lẫn trong định danh loài KST SR do phụ thuộc vào

các yếu tố như: kỹ thuật soi lam, so sánh về hình thể KST SR, độ nhạy và đặc hiệu

của kỹ thuật. Kỹ thuật Nested – PCR cho kết quả chính xác hơn do có độ nhạy và

độ đặc hiệu cao, và kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật Nested – PCR cũng

90.000%

80.000%

70.000%

Giêm - sa

60.000%

Nested - PCR

50.000%

40.000%

30.000%

20.000%

10.000%

.000%

P.falciparum

P.vivax

P.falciparum - P.vivax

phù hợp với các công bố của WHO về tình hình sốt rét của Việt Nam.

Hình 3.4. Biểu đồ so sánh kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật

Giêm – sa và kỹ thuật Nested – PCR

53

3.3. Kết quả giải trình tự Plasmodium spp.

Với kết quả định danh ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật Nested – PCR đối

với những ca dương tính với Plasmodium spp. Chúng tôi tiến hành giải trình tự

Gene và so sánh trình tự Gene với NCBI [51] [52], bằng công cụ Bio Edit Clustal và

Mega.

Hình 3.5. Kết quả trình tự DNA P. falciparum với NCBI

Hình 3.6. Sơ đồ cây P. falciparum với NCBI

54

Hình 3.7. Kết quả trình tự DNA P. vivax với NCBI

Hình 3.8. Sơ đồ cây P. vivax với NCBI

55

Hình 3.9. Sơ đồ cây P. falciparum và P. vivax với NCBI

3.4. Kết quả giải trình tự kháng K13

Qua kết quả chạy Nested – PCR K13 đối với những ca dương tính P.

falciparum đơn thuần, 14 mẫu/14 mẫu P. falciparum đơn thuần có đột biến K13

liên quan đến kháng artemisinin. Chúng tôi tiến hành giải trình tự kháng K13 và so

sánh với trình tự Gene trên Plasmodium Genus Resource (PGR) [53]. Từ đó cho thấy

kỹ thuật Nested – PCR phát hiện được đột biến K13 liên quan đến kháng

artemisinin trong điều trị sốt rét.

Dựa trên kết quả trình tự so sánh trình tự K13 của 14 mẫu thu thập được trong

quá trình tiến hành đề tài với trình tự trên PGB. Chúng tôi nhận thấy các đột biến

điểm tại vị trí như sau: vị trí C447G có 1 chủng BP24; vị trí I543T có 1 chủng

BP27; vị trí P553L có 3 chủng BP11, BP20, BP28; vị trí C580Y có 4 chủng BP10,

BP13, BP22, BP30 được thể hiện ở hình 3.10.

56

849 bp

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm DNA kháng K13 của P. falciparum

Ghi chú:

Giếng 6: thang 100 bp

Giếng 7: chứng âm K13

Giếng 1 – 5, 8 – 15: sản phẩm điện di K13, kích thước 849 bp.

Với 14 chủng KST SR nhiễm P. falciparum đơn thuần, 9/14 chủng KST SR

P. falciparum đơn thuần thu thập được tại Bình Phước phát hiện đột biến K13 liên

quan đến kháng artemisinin (chiếm 64,3%), với tỉ lệ các điểm đột biến như sau:

C447G có 1 chủng chiếm 7,1%; I543T có 1 chủng chiếm tỉ lệ 7,1%; P553L có 3

chủng chiếm tỉ lệ 21,4%; C580Y có 4 mẫu chiếm tỉ lệ 28,6%. Trong đó đột biến

C580Y có tần suất xuất hiện cao ở Bình Phước, cũng xuất hiện tại trong nghiên cứu

của Frederic và cs. tại Cam-pu-chia, năm 2013 [38] với tỉ lệ của đột biến C580Y là

65,4% các đột biến K13, ở vùng biên giới Trung Quốc – Myanmar trong nghiên cứu

của Zenglei Wang và cs., giai đoạn 2007 – 2012 [76] là 1,6%, trong nghiên cứu của

Myat Htut Nyunt và cs. tại Myanmar, năm 2017 [50] là 42,9%. Dựa vào các dữ kiện

trên có thể cho thấy điểm đột biến C580Y là điểm đột biến có tỉ lệ và tần suất xuất

hiện ở các nước Việt Nam, Cam-pu-chia, Myanmar và vùng biên giới Trung Quốc –

Myanmar.

57

Hình 3.11. Kết quả trình tự aa K13 của P. falciparum với PGR [53]

3.5. Kết quả nuôi cấy chủng Plasmodium spp. thuần bằng phương pháp nuôi

cấy trong phòng nuôi cấy tại phòng thí nghiệm

Chúng tôi đã thành công trong việc vận chuyển và nuôi cấy tại phòng thí

nghiệm các mẫu máu nhiễm KST SR P. falciparum được thu thập từ thực địa.

Các chủng P. falciparum, P. vivax đơn thuần được tiến hành nuôi cấy trong

phòng thí nghiệm khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn

trùng Tp. Hồ Chí Minh. Các chủng KST SR được nuôi cấy trong bình nuôi cấy theo

phương pháp Trager và cs.[60] như hình 3.12.

Với những mẫu máu nhiễm phối hợp KST SR P. falciparum – P. vivax sẽ

được chúng tôi rửa hồng cầu và cất đông, bảo quản trong Nitơ lỏng

-196oC.

Để đánh giá mật độ KST SR Plasmodium spp. và sự phát triển của KST SR

trong điều kiện nuôi cấy tại phòng thí nghiệm. Chúng tôi tiến hành kỹ thuật nhuộm

giêm – sa sau mỗi lần thay môi trường để đánh giá sự phát triển và mật độ KST SR

như ở hình 3.13.

Thực hiện nuôi cấy 12 chủng P. vivax đơn thuần tại phòng thí nghiệm, chúng

tôi nhận thấy các đĩa nuôi chủng P. vivax chỉ duy trì được trong 48 giờ, và sau đó

58

giảm dần về mật độ KST. Nguyên nhân của việc nuôi cấy KST SR P. vivax không

phát triển được có thể là do chưa phân lập được hồng cầu non.

Việc nuôi cấy 14 chủng P. falciparum đơn thuần có nhiều thuận lợi hơn, có 9

chủng KST SR P. falciparum phát triển tốt trong điều kiện nuôi cấy phòng thí

nghiệm. Qua thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy những mẫu KST SR P. falciparum

có mật độ KST SR (+++) và (++++) nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm có tỉ

lệ thành công cao hơn các chủng có mật độ KST SR (+) và (++).

Hình 3.12. KST SR Plasmodium spp. được nuôi cấy

7,8 µm

tại phòng thí nghiệm

Hình 3.13. Hình thể P. falciparum được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm

59

3.6. Kết quả bảo tồn chủng sốt rét Plasmodium spp. và phát hiện kháng K13

liên quan đến kháng artemisinin.

Trong quá trình làm đề tài, chúng tôi đã tiến hành định danh, thu thập, bảo tồn,

và lưu trữ chủng ký sinh trùng sốt rét được:

 Bộ tiêu bản KST SR gồm: P. falciparum 50 tiêu bản, P. vivax 18 tiêu

bản, 10 tiêu bản phối hợp P. falciparum – P. vivax.

 Thu thập 30 chủng ký sinh trùng sốt rét và lưu giữ trong ni tơ lỏng ở

nhiệt

độ - 196oC

 Thu thập 30 mẫu giấy thấm Whatmann 3MM có KST SR được bảo

quản trong tủ âm sâu – 86oC.

 Phát hiện 9 chủng KST SR P. falciparum có đột biến K13 liên quan

đến kháng artemisinin.

Với những kết quả trên đã góp phần bảo tồn và duy trì nguồn chủng KST SR,

nguồn dữ liệu về Gene trong giai đoạn KST SR đang giảm dần, và tình hình kháng

thuốc ngày càng gia tăng [40] [62] [69] [75], cũng như phục vụ cho công tác nghiên cứu

chuyên sâu về sốt rét và phát triển thuốc, phát triển vaccine phòng chống bệnh sốt

rét sau này.

60

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Đề tài này, đã đánh dấu được bước đầu xây dựng ngân hàng sinh học, để tiến

hành thành lập ngân hàng gene cho đoạn gene bảo tồn 18S Ribosome của các chủng

KST SR, được phân lập được từ bệnh nhân trong vùng dịch tể sốt rét lưu hành ở

tỉnh Bình Phước.

Việc tìm thấy 9 chủng KST SR có đột biến K13 liên quan đến kháng

artemisinin của P. falciparum (chiếm 63,3% trên tổng số 14 ca nhiễm P. falciparum

được định danh bằng kỹ thuật Nested – PCR), cho thấy diễn biến kháng thuốc sốt

rét ngày càng phức tạp.

Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã xác định được trình tự gene

kháng K13 liên quan đến kháng atemisinin bằng kỹ thuật giải trình tự gene bằng

máy giải trình tự tự động. Với kết quả xác định được điểm đột biến C580Y, với tần

suất xuất hiện cao (28,6% các điểm đột biến K13 được xác định). Đồng thời đột

biến C580Y cũng xuất hiện trong nghiên cứu của Frederic và cs. tại Cam-pu-chia,

năm 2013; vùng biên giới Trung Quốc – Myanmar trong nghiên cứu của

Zenglei Wang và cs., giai đoạn 2007 – 2012; nghiên cứu của Myat Htut Nyunt và

cs. tại Myanmar, năm 2017 là 42,9% .

Kết quả của nghiên cứu, đã góp phần vào việc chứng minh kỹ thuật sinh học

phân tử (Nested – PCR, giải trình tự) có thể coi là chuẩn vàng trong chuẩn đoán tác

nhân gây bệnh SR và phát hiện được đột biến liên quan đến kháng thuốc điều trị

bệnh SR.

Qua các trình giải trình tự KST SR phân lập được ở Bình Phước, chúng tôi đã

bước đầu xây dựng thành công trình tự gene và cây phân loài các chủng KST thu

thập được.

Chúng tôi đã phân lập, bảo tồn và lưu trữ các chủng KST SR thu được:

 30 chủng ký sinh trùng sốt rét và lưu giữ trong ni tơ lỏng ở nhiệt

độ - 196oC.

 9 chủng KST SR P. falciparum có đột biến K13 liên quan đến kháng

artemisinin.

61

 30 mẫu giấy thấm Whatmann 3MM có ký sinh trùng ký sinh trùng

sốt rét.

 Bộ tiêu bản KST SR: P. falciparum 50 tiêu bản, P. vivax 18 tiêu bản,

10 tiêu bản phối hợp P. falciparum – P. vivax.

Với các kết quả đạt được trong nghiên cứu này, cũng góp một phần vào công

tác dự báo sự bùng phát và cảnh báo tình hình kháng thuốc của KST SR cho các nhà

dịch tể học, các nhà nghiên cứu cập nhật được tình hình bệnh sốt rét ở vùng nghiên

cứu.

Bên cạnh đó việc bảo tồn được nguồn chủng, nguồn gene KST SR để phục vụ

cho công tác nghiên cứu sau này như: đánh giá hiệu lực của các thuốc điều trị SR

thế hệ mới, cũng như nuôi cấy để thử nghiệm trong điều kiện in vitro, nghiên cứu về

đáp ứng miễn dịch, sinh học phân tử, phát triển vaccine chống sốt rét,... được thuận

lợi hơn.

Với các tiêu bản KST SR, các quy trình phát hiện và định danh KST SR có thể

giúp ích trong công tác đào tạo nguồn nhân lực y tế, trong các nghiên cứu về bệnh

SR sau này là những đóng góp có ý nghĩa của luận văn này.

4.2. Kiến nghị

 Thực hiện việc thu thập và bảo tồn các chủng KST SR ở các khu vực

có sốt rét lưu hành như: Giai Lai, Bình Thuận, Đắk Nông, Đắk Lắc và Quảng

Nam,... nhằm đánh giá khách quan hơn tình trạng SR kháng thuốc, đa kháng

thuốc.

 Đẩy mạnh các nỗ lực và hành động khẩn cấp để giảm số ca mắc và tử

vong do sốt rét gây ra bằng việc ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử

trong chuẩn đoán và điều trị bệnh sốt rét.

 Cần phải kết hợp kỹ thuật truyền thống và kỹ thuật chuẩn đoán hiện

đại như PCR, Real – time, giải trình tự,… trong chuẩn đoán ca bệnh sốt rét.

62

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

[1]. Bộ Kế Hoạch - Đầu Tư, 2016, Báo cáo quốc gia kết quả 15 năm thực hiện các

mục tiêu phát triển thiên niên kỷ của Việt Nam

[2]. Bộ Y Tế, 2015, Hội thảo quốc gia về đầu tư bền vững cho công tác phòng

chống Sốt rét, Cổng thông tin Bộ Y tế, 15/5/2015

[3]. Bộ Y Tế, 2015a, Cập nhật thông tin về sốt rét trên thế giới đầu năm 2015,

Cổng thông tin Bộ Y tế

[4]. Bộ Y Tế, 2015b, Một số thách thức đối với bệnh sốt rét ở Việt Nam cũng như

thế giới, Cổng thông tin Bộ Y tế

[5]. Bộ Y Tế, 2015c, Thông tin cập nhật về sốt rét trên thế giới đầu năm 2015,

Cổng thông tin Bộ Y tế

[6]. Bộ Y Tế, 2016, Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị và dự phòng bệnh sốt rét

[7]. Bùi Trí Cường, 2016, Bệnh sốt rét có thể xuất hiện ở thủ đô Hà Nội

[8]. Cục Y Tế Dự Phòng, 2016a, Báo cáo thực hiện và đánh giá hiệu quả dự án

phòng chống bệnh truyền nhiễm khu vực tiểu vùng sông mê kông giai đoạn 2

năm 2011-2012, Cục y tế dự phòng, Bộ Y tế

[9]. Cục Y Tế Dự Phòng, 2016b, Bệnh sốt rét, Cục Y tế dự phòng, Bộ Y tế

[10]. Đỗ Viết Tiến, 2009, Thực trạng sốt rét và các yếu tố nguy cơ ảnh hưởng đến

tình hình dịch tễ sốt rét tại huyện Krông Bông, tỉnh Đăk Lăk năm 2008 - 2009,

Luận văn thạc sỹ y khoa

[11]. Hoàng Hà, 2014, Nghiên cứu thực trạng sốt rét và đánh giá kết quả can thiệp

phòng chống sốt rét tại một số xã biên giới của huyện Hướng Hóa, Tỉnh

Quảng Trị, Luận văn tiến sỹ y học

[12]. Huỳnh Trung Triệu, 2014, Bệnh Sốt rét, Y học Cộng đồng

[13]. Lê Khánh Thuận, 2004, Phân vùng dịch tể sốt rét và can thiệp toàn quốc trong

chương trình phòng chống sốt rét tại Việt Nam hiện nay

[14]. Ngô Việt Thành, 2005, Tạo chủng Plasmodium falciparum kháng artemisinin

trong nuôi cấy dài ngày

63

[15]. Nguyễn Mạnh Hùng, 2011, Phân Vùng Dịch Tễ Sốt Rét Can Thiệp Tại Việt

Nam Năm 2009

[16]. Phạm Nguyễn Thúy Vy, 2015, Quá trình nuôi giữ chủng ký sinh trùng sốt rét

trước khi sử dụng trong nghiên cứu, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng

Tp. Hồ Chí Minh

[17]. Cục Y Tế Dự Phòng, 2017, Sổ Tay Xét Nghiệm Bệnh Truyền Nhiễm Tập I,

Ban hành kèm theo Quyết định số 217/QĐ-DP ngày 02 tháng 12 năm 2016

của Cục trưởng Cục Y tế dự phòng

[18]. Tỉnh Bình Phước, 2017, Tổng quan tỉnh Bình Phước, Cổng thông tin tỉnh Bình

Phước, .

[19]. Triệu Nguyên Trung Và Huỳnh Hồng Quang, 2011, Từ nguồn gốc tiến hóa

của loài người đến mối liên quan nhiễm ký sinh trùng sốt rét từ khỉ sang

người, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Qui Nhơn

[20]. Triệu Nguyên Trung, 2013, Ưu, nhược điểm của các phương pháp và kỹ thuật

nghiên cứu đánh giá ký sinh trùng sốt rét nhạy, kháng thuốc, Viện Sốt rét - Ký

sinh trùng - Côn trùng Qui Nhơn

[21]. Viện Sốt Rét - Ký Sinh Trùng - Côn Trùng Qui Nhơn, 2008, Lịch sử về sự ra

đời của 4 loại thuốc điều trị thông dụng

[22]. Viện Sốt Rét - Ký Sinh Trùng - Côn Trùng Qui Nhơn, 2016a, Ký sinh trùng

sốt rét Plasmodium falciparum kháng thuốc Artemisinine và các giá trị nghiên

cứu sinh học phân tử phát hiện đột biến gen K13 Propeller (Phần 1)

[23]. Viện Sốt Rét - Ký Sinh Trùng - Côn Trùng Qui Nhơn, 2016b, Tổng quan đa

hình đột biến gen K13 và những phát hiện mới về góc độ sinh học phân tử

[24]. Viện Sốt Rét - Ký Sinh Trùng - Côn Trùng Tp. Hồ Chí Minh, 2016, Nghiên

cứu về tính dễ bị tổn thương của người di cư với sốt rét và đặc điểm dịch tễ sốt

rét kháng artemisinin tại tỉnh Bình Phước, Việt Nam

[25]. Viện Sốt Rét - Ký Sinh Trùng - Công Trùng Qui Nhơn, 2011, Tafenoquine

Succinate – Hợp chất thuốc triển vong trong các nghiên cứu lâm sàng 2011

[26]. Vũ Hải An, 2016, Bình Phước: “Cái nôi” sốt rét và sốt rét kháng thuốc của

Việt Nam. Viện Sốt Rét - Ký Sinh Trùng - Côn Trùng Tp. Hồ Chí Minh

64

[27]. WHO, 2010a, Báo cáo tình hình sốt rét toàn cầu

[28]. WHO, 2014b, Sốt rét - thông tin cần biết

[29]. WHO, 2015b, Báo cáo tình hình sốt rét toàn cầu

[30]. WIKIPEDIA, 2016, Ký sinh trùng sốt rét

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG NƯỚC NGOÀI

[31]. Arrow K.J., P. C. 2004. Saving Lives, Buying Time: Economics of Malaria

Drugs in an Age of Resistance

[32]. Banchamlak Tegegne, S. G., ET. AL 2017. Performance of loop-mediated

isothermal amplification (LAMP) for the diagnosis of malaria among malaria

suspected pregnant women in Northwest Ethiopia. Malaria Journal

https://doi.org/,16

[33]. Birgit Pöschl, J. W., et. al 2010. Comparative Diagnosis of Malaria Infections

by Microscopy, Nested PCR, and LAMP in Northern Thailand. The American

Journal of Tropical Medicine and Hygiene. The American Society of Tropical

Medicine and Hygiene.CDC 2016. Biology

[34]. Charles Delahunt, M. P. H., et. al 2014. Limitations of haemozoin-based

diagnosis of Plasmodium falciparum using dark-field microscopy. Malaria

Journal 201413:147

[35]. Charlotte Joos, M.-L. V., et. al 2015 Antibodies to Plasmodium falciparum

merozoite surface protein-1p19 malaria vaccine candidate induce antibody-

dependent respiratory burst in human neutrophils. Malaria Journal, 14 : 409

[36]. Coatney G.R., C. W., et. al 1971. The Primate Malarias. In: Department Of

Health, E. A. W., Bethesda (ed.). U.S

[37]. Djimde AA, K. L., et. al 2007. In vitro cultivation of fields isolates of

Plasmodium falciparum in Mali. Bull Soc Pathol Exot. , 2007 Feb; 100, 3 - 5

[38]. Frédéric Ariey, B. W., et. al, 2013, A molecular marker of artemisinin-

resistant Plasmodium falciparum malaria, Nature 505, (02 January 2014),

505, 50 - 55

65

[39]. Frederic Ariey, D. M. 2013. PCR_Sequencing for genotyping SNPs

PF3D7_1343700 Kelch protein propeller domain

[40]. Georges Snounou, S. V., et. al, 1993, Identification of the four human malaria

parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and

detection of a high prevalence of mixed infection, Molecular and Biochemical

Parasitology, 58, 283 - 292

[41]. Hanron AE, B. Z., et. al, 2017, Multiplex, DNase-free one-step reverse

transcription PCR for Plasmodium 18S rRNA and spliced gametocyte -

specific mRNAs, Malaria Journal 2017 16, 208

[42]. Howard M. Shapiro, F. M., 2007, Cytometry in malaria: Moving beyond

Giemsa

[43]. IOM, 2015, Malaria Prevention and Continuum of Carefor Migrants,

International Organization for Migration - Migration Health Division

[44]. Jun Li, R. R. G., et. al, 1997, Regulation and Trafficking of Three Distinct 18S

Ribosomal RNAs During Development of the Malaria Parasite, J. Mol. Biol.,

269, 203 - 213

[45]. Liwang Cui, N. T., et. al, 2008. Culture of Exoerythrocytic Stages of the

Malaria Parasites Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax. MIMB,

470, 263-273

[46]. Masatsugu Kimuraa, O. K., et. al, 1997, Identification of the four species of

human malaria parasites by nested PCR that targets variant sequences in the

small subunit rRNA gene, Parasitology International, 46, 91- 95

[47]. Mayer D.C., et. al, 2004. Polymorphism in the Plasmodium falciparum

erythrocyte-binding ligand JESEBL/EBA-181 alters its receptor specificity

[48]. Mazier D., L. I., , et. al, 1984. Cultivation of the liver forms of Plasmodium

vivax in human hepatocytes. Nature 505, (02 January 2014), 307 (5949), 9

[49]. Michele Leroux, V. L., et. al, 2009. Plasmodium falciparum biology: analysis

of in vitro versus in vivo growth conditions, Trends in Parasitology, 25, 474 -

481

66

[50]. Myat Htut Nyunt, et. al, 2017, Molecular surveillance of artemisinin

resistance falciparum malaria among migrant goldmine workers in Myanmar,

Malaria Journal 201716:97

[51]. NCBI 2017a, Trình tự gene so sánh với P. falciparum từ nguồn NCBI:

Plasmodium falciparum isolate Pf36 18S ribosomal RNA gene, partial

sequence

[52]. NCBI 2017, Trình tự gene so sánh với P. vivax từ nguồn NCBI: Plasmodium

vivax isolate YV35 18S ribosomal RNA gene

[53]. PGR, 2017, So sánh trình tự K13 với ngân hàng gene >Pf3D7_13_v3,

Plasmodium falciparum 3D7. Plasmodium Genomics Resource

[54]. Philip Bejon, L. A., et. al, 2006, Thick blood film examination for Plasmodium

falciparum malaria has reduced sensitivity and underestimates parasite

density, Malar J. , 5

[55]. Rachanee Udomsangpetch, S. S., et. al, 2006. Short - term in vitro culture of

field isolates of Plasmodium vivax using umbilical cord blood, Parasitology

International 56 (2007) 65 - 69

[56]. Rojas Mo, W. M, 1993, Effect of low temperature on the in vitro growth of

Plasmodium falciparum, J. Eukaryot Microbiol, 1993 Mar - Apr; 40(2):149 -

52

[57]. Schuster, F. L., 2002, Cultivation of Plasmodium spp., Clin Microbiol Rev,

2002 Jul; 15 (3): 355 – 364

[58]. Sherratt, H., 2016, Malaria and Greek History Publications Of The University

Of Manchester, Historical series

[59]. The Guardian, 2012, Malaria deaths country by country: how many there?

Truy cập ngày 20/6/2016:

https://www.theguardian.com/news/datablog/2012/feb/03/malaria-deaths-

mortality#data

[60]. Trager W., J. B, 1976, Human malaria parasites in Continuous culture,

Science 193 : 673 - 5, 1976. Department of Parasitology, The Rockefeller

University, NY

67

[61]. Wanlapa Roobsoong, C. S. T., et. al, 2015, Improvement of culture conditions

for long-term in vitro culture of Plasmodium vivax, Malaria Journal

201514:297

[62]. WHO 2010b, Global report on antimalarial drug efficacy and drug resistance

:2000 - 2010

[63]. WHO 2011a, Global plan for artemisinin resistance containment (GPARC).

[64]. WHO 2011b, Malaria deaths are down but progress remains fragile

[65]. WHO 2011c, World malaria report 2011

[66]. WHO 2014a, Malaria

[67]. WHO 2014c, World Health Organization estimates Malaria Report 2014

[68]. WHO 2015a, Action and investment to defeat malaria 2016 - 2030

[69]. WHO 2015c, Status report on artemisinin and ACT resistance

[70]. WHO 2015d, World malaria report 2015

[71]. WHO 2016a, Artemisinin and artemisinin - based combination therapy

resistance

[72]. WHO 2016b, World malaria report 2016

[73]. WHO 2016c, World malaria report 2016 summary

[74]. WHO 2017a, Malaria

[75]. WHO 2017b, Q&A on artemisinin resistance

[76]. Zenglei Wang, et. al, 2015, Prevalence of K13-propeller polymorphisms in

Plasmodium falciparum from China-Myanmar border in 2007 – 2012, Malaria

Journal, 201514 : 168

70

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Trình tự tham chiếu so sánh K13 liên quan đến artemisinin:

>gi|124513603|ref|XM_001350122.1| Plasmodium falciparum 3D7 Kelch protein,

putative (PF13_0238) mRNA, complete cds

ATGGAAGGAGAAAAAGTAAAAACAAAAGCAAATAGTATCTCGAATT TTTCTATGACGTATGATAGGGAATCTGGTGGTAACAGCAATAGTGAT GATAAAAGCGGAAGTAGTAGCGAGAATGATTCTAATTCATTTATGAA TCTAACTAGTGATAAAAATGAGAAAACGGAAAATAATAGTTTCCTTT TAAATAATAGTAGTTATGGAAATGTTAAAGATAGCCTATTAGAATCC ATTGATATGAGTGTATTAGATTCGAACTTTGATAGTAAAAAAGATTTT TTACCAAGTAATTTATCAAGAACATTTAATAATATGTCTAAAGATAAT ATAGGAAATAAATATTTAAATAAATTGTTAAATAAAAAAAAAGATAC TATTACAAATGAAAATAATAATATTAATCATAATAATAATAATAATA ATCTGACAGCAAATAATATAACTAATAATCTTATTAATAATAATATG AATTCTCCATCAATTATGAATACCAACAAAAAAGAGAATTTTTTAGA TGCAGCAAATCTTATAAATGATGATTCTGGATTAAACAATTTAAAAA AATTTTCAACTGTAAATAATGTAAATGATACTTATGAAAAGAAAATT ATTGAAACGGAATTAAGTGATGCTAGTGATTTTGAAAATATGGTAGG TGATTTAAGAATTACATTTATTAATTGGTTAAAAAAGACACAAATGA ATTTTATTCGAGAAAAAGATAAATTATTTAAAGATAAGAAAGAACTA GAAATGGAAAGAGTACGATTGTACAAAGAATTAGAAAACCGTAAAA ATATTGAAGAACAGAAATTACATGATGAAAGAAAGAAATTAGATATT GATATATCTAATGGTTATAAACAAATAAAAAAAGAAAAAGAAGAAC ATAGGAAACGATTTGATGAAGAAAGATTAAGATTTTTACAAGAAATC GATAAAATTAAATTAGTATTATATTTAGAAAAAGAAAAATATTATCA AGAATATAAAAATTTTGAGAATGATAAAAAAAAAATTGTTGATGCAA ATATTGCTACTGAAACTATGATTGATATTAATGTTGGTGGAGCTATTT TTGAAACATCTAGACATACCTTAACACAACAAAAAGATTCATTTATA GAGAAATTATTAAGTGGAAGACATCATGTAACCAGAGATAAACAAG GAAGAATATTCTTAGATAGGGATAGTGAGTTATTTAGAATTATACTTA ACTTCTTAAGAAATCCGTTAACTATACCCATACCAAAAGATTTAAGTG AAAGTGAAGCCTTGTTGAAAGAAGCAGAATTTTATGGTATTAAATTT TTACCATTCCCATTAGTATTTTGTATAGGTGGATTTGATGGTGTAGAA TATTTAAATTCGATGGAATTATTAGATATTAGTCAACAATGCTGGCGT ATGTGTACACCTATGTCTACCAAAAAAGCTTATTTTGGAAGTGCTGTA TTGAATAATTTCTTATACGTTTTTGGTGGTAATAACTATGATTATAAG GCTTTATTTGAAACTGAGGTGTATGATCGTTTAAGAGATGTATGGTAT GTTTCAAGTAATTTAAATATACCTAGAAGAAATAATTGTGGTGTTACG TCAAATGGTAGAATTTATTGTATTGGGGGATATGATGGCTCTTCTATT ATACCGAATGTAGAAGCATATGATCATCGTATGAAAGCATGGGTAGA GGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGTGTTGCTTT

TGATAATAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAATGGTGAGAGATTAA ATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTT CCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCTTTTAATTAC CTTAATCAAATATATGTTGTTGGAGGTATTGATAATGAACATAACATA TTAGATTCCGTTGAACAATATCAACCATTTAATAAAAGATGGCAATTT CTAAATGGTGTACCAGAGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTGCCACATT GTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGAGAAAATGGCGAAGTTCTAA ATTCATGTCATTTCTTTTCACCAGATACAAATGAATGGCAGCTTGGCC CATCTTTATTAGTTCCCAGATTTGGTCACTCCGTTTTAATAGCAAATA TATAA

Phụ lục 2: Kết quả định danh bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa và kỹ thuật

Nested – PCR trong định danh KST SR:

Mã số BN Kỹ thuật nhuộm Giêm - sa Kỹ thuật Nested – PCR

BP 1 P. falciparum P. falciparum

BP 2 P. falciparum P. falciparum

BP 3 P. falciparum P.vivax

BP 4 P. falciparum P. vivax

BP 5 P. falciparum P. falciparum

BP 6 P. falciparum P. falciparum

BP 7 P. falciparum + P.vivax P. falciparum + P.vivax

BP 8 P. falciparum P. falciparum

BP 9 P. falciparum P. vivax

BP 10 P. falciparum P. falciparum

BP 11 P. falciparum P. falciparum

BP 12 P.vivax P.vivax

BP 13 P. falciparum P. falciparum

BP 14 P.vivax P.vivax

BP 15 P. falciparum P. vivax

BP 16 P.vivax P.vivax

BP 17 P. falciparum P. vivax

BP 18 P. falciparum + P.vivax P. falciparum + P.vivax

BP 19 P. falciparum P. falciparum+ P.vivax

BP 20 P. falciparum P. falciparum

BP 21 P. falciparum P. falciparum+ P.vivax

BP 22 P. falciparum P. falciparum

BP 23 P.vivax P.vivax

BP 24 P. falciparum P. falciparum

BP 25 P. falciparum P. vivax

BP 26 P. falciparum P. vivax

BP 27 P. falciparum P. falciparum

BP 28 P. falciparum P. falciparum

BP 29 P.vivax P.vivax

BP 30 P. falciparum P. falciparum

Phụ lục 3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

 Môi trường RPMI 1640

Bột RPMI 1640 10,4 g

Hepès 5,94 g

Glucoza 2,00 g

Gentamicine 0,04 g

Nước cất 2 lần vừa đủ 960 ml

 Môi trường RPS để rửa hồng cầu

10 ml Môi trường RPMI

0,42 ml NaHCO3 5%

 Môi trường đầy đủ RPHS

10 ml Môi trường RPMI

0,42 ml NaHCO3 5%

Huyết thanh O (AB) 10% 1,2 ml

Phụ lục 4: Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh sốt rét

(Ban hành kèm theo Quyết định số 4845/QĐ-BYT ngày 08 tháng 9 năm 2016 của

Bộ trưởng Bộ Y tế)

1. NGUYÊN TẮC ĐIỀU TRỊ

 Điều trị sớm, đúng và đủ liều.

 Điều trị cắt cơn sốt kết hợp với chống lây lan (sốt rét do P. falciparum ) và

điều trị tiệt căn (sốt rét do P.vivax, P.ovale).

 Các trường hợp sốt rét do P. falciparum không được dùng một thuốc sốt rét

đơn thuần, phải điều trị thuốc sốt rét phối hợp để hạn chế kháng thuốc và tăng

hiệu lực điều trị.

 Điều trị thuốc sốt rét đặc hiệu kết hợp với điều trị hỗ trợ và nâng cao thể

trạng.

 Các trường hợp sốt rét ác tính phải chuyển về đơn vị hồi sức cấp cứu của

bệnh viện từ tuyến huyện trở lên, theo dõi chặt chẽ và hồi sức tích cực.

2. ĐIỀU TRỊ CỤ THỂ

 Điều trị đặc hiệu:

Bảng 1: Thuốc sốt rét theo nhóm người bệnh và chủng loại ký sinh trùng sốt rét

Sốt rét do

Nhóm người bệnh Sốt rét lâm sàng Sốt rét do P.vivax /P.ovale Sốt rét do P.malariae /P.knowlesi P. falciparum Sốt rét nhiễm phối hợp có P. falciparum

DHA-PPQ(1) DHA-PPQ(1) Chloroquin Chloroquin DHA-PPQ(1) Dưới 6 tháng tuổi

DHA-PPQ(1) Từ 6 tháng tuổi trở lên Chloroquin +Primaquin Chloroquin +Primaquin DHA- PPQ(1)hoặc thuốc phối hợp khác DHA-PPQ(1) +Primaquin thuốc hoặc hợp phối khác

Chloroquin Chloroquin Quinin + Clindamycin Quinin + Clindamycin Quinin + Clindamycin Phụ nữ có thai 3 trong tháng đầu

DHA-PPQ(1) Chloroquin Chloroquin Phụ nữ có thai trên 3 tháng

DHA- PPQ(1)hoặc thuốc phối hợp khác DHA- PPQ(1)hoặc thuốc phối hợp khác

Chú thích: (1) DHA(Dihydroartemisinin)-PPQ(Piperaquin phosphat): biệt

dược là CV Artecan, Arterakine.

2.1. Điều trị sốt rét chưa biến chứng (Sốt rét thường)

Dựa vào chẩn đoán để chọn thuốc điều trị phù hợp, liều lượng xem ở các

Bảng 2, 3, 4, 5.

a) Thuốc điều trị ưu tiên:

 Sốt rét do P. falciparum: Dihydroartemisinin - Piperaquin phosphat uống 3

ngày (Bảng 3) và Primaquin 0,5 mg base/kg liều duy nhất (Bảng 5).

 Sốt rét phối hợp có P. falciparum: Dihydroartemisinin - Piperaquin phosphat

uống 3 ngày (Bảng 3) và Primaquin 0,25 mg base/kg x 14 ngày (Bảng 5).

 Sốt rét do P. vivax hoặc P. ovale: Chloroquin uống 3 ngày (Bảng 2) và

Primaquin 0,25 mg base/kg/ngày x 14 ngày (Bảng 5).

 Sốt rét do P. malariae hoặc P. knowlesi: Chloroquin uống 3 ngày (Bảng 2) +

primaquin 0,5 mg base/kg liều duy nhất.

b) Xử trí các trường hợp điều trị thất bại (phụ lục 4)

* Tất cả các trường hợp điều trị thất bại, phải lấy lam máu để xét nghiệm

lại và điều trị như sau:

i. Xuất hiện các dấu hiệu nguy hiểm trong vòng 3 ngày đầu và còn ký sinh

trùng sốt rét thì phải điều trị như sốt rét ác tính (mục 2.3).

ii. Nếu người bệnh xuất hiện lại KST SR trong vòng 14 ngày, điều trị bằng

thuốc điều trị thay thế (mục 2.1 c).

iii. Nếu người bệnh xuất hiện lại KST SR sau 14 ngày, được coi như tái nhiễm

và điều trị bằng thuốc lựa chọn ưu tiên (mục 2.1.a).

iv. Nếu gặp các trường hợp điều trị thất bại đối với một loại thuốc sốt rét tại cơ

sở điều trị, cần báo lên tuyến trên để tiến hành xác minh KST SR kháng thuốc.

c) Thuốc điều trị thay thế:

 Quinine sulfat điều trị 7 ngày (Bảng 4, 7, 8) + Doxycyclin điều trị 7 ngày

(Bảng 9).

 Hoặc Quinin sulfat điều trị 7 ngày (Bảng 4, 7, 8) + Clindamycin điều trị 7

ngày (Bảng 10) cho phụ nữ có thai và trẻ em dưới 8 tuổi.

 Các thuốc ACT khác (Phụ lục 5).

 Người bệnh nhiễm P. vivax mà thất bại điều trị với chloroquine trước ngày

28 sau dùng thuốc thì sử dụng Dihydroartemisinin - Piperaquin phosphat uống 3

ngày (Bảng 3) và primaquin 0,25 mg base/kg cho đủ liều 14 ngày (Bảng 5).

d) Điều trị sốt rét tại vùng có sốt rét kháng thuốc

Tại các vùng có bằng chứng tỷ lệ trường hợp thất bại điều trị của P.

falciparum với Dihydroartemisin - piperaquine phosphate > 10% trên tổng số

trường hợp điều trị, tất cả người bệnh nhiễm P. falciparum hoặc nhiễm phối hợp

có P. falciparum được điều trị bằng phác đồ sốt rét chống kháng: artesunate +

mefloquin (Bảng 11) hoặc Quinine sulfat điều trị 7 ngày (Bảng 4, 7, 8) +

Doxycyclin (Bảng 9) hoặc Clindamycin (Bảng 10) điều trị 7 ngày hoặc các thuốc

phối hợp khác (Phụ lục 5).

2.2. Điều trị sốt rét thông thường ở phụ nữ có thai

Phụ nữ có thai mắc sốt rét hay bị thiếu máu, hạ đường huyết, phù phổi cấp, dễ

chuyển thành sốt rét ác tính, vì vậy việc điều trị phải nhanh chóng và hiệu quả.

a) Phụ nữ có thai trong 3 tháng đầu:

 - Điều trị sốt rét do P. falciparum hoặc nhiễm phối hợp có P.

falciparum: thuốc điều trị là Quinin sulfat 7 ngày (Bảng 4) + Clindamycin 7 ngày

(Bảng 10).

 Điều trị sốt rét do P.vivax hoặc P. malariae hoặc P. ovale hoặc P.

knowlesi: thuốc điều trị là Chloroquin x 3 ngày (Bảng 2)

b) Phụ nữ có thai trên 3 tháng:

 Điều trị sốt rét do P. falciparum hoặc nhiễm phối hợp có P.

falciparum: Thuốc điều trị là Dihydroartemisinin - Piperaquin phosphat uống 3

ngày (Bảng 3).

 Điều trị sốt rét do P.vivax hoặc P.malariae hoặc P.ovale hoặc P.knowlesi:

thuốc điều trị là Chloroquin tổng trong 3 ngày (Bảng 2)

Chú ý:

 Không điều trị Primaquin cho phụ nữ có thai, trẻ em dưới 6 tháng tuổi và

người thiếu men G6PD.

 Không điều trị Dihydroartemisinin - Piperaquin phosphat cho phụ nữ có thai

trong 3 tháng đầu

2.3. Điều trị sốt rét ác tính

2.3.1. Điều trị đặc hiệu

Sử dụng Artesunat tiêm hoặc Quinin hoặc Artemether (liều lượng thuốc xem

Bảng 6, 7, 8) theo thứ tự ưu tiên như sau:

a) Phác đồ điều trị ưu tiên:

 Artesunat tiêm: Liều giờ đầu 2,4 mg/kg, tiêm nhắc lại 2,4 mg/kg vào giờ thứ

12 (ngày đầu). Sau đó mỗi ngày tiêm 1 liều 2,4 mg/kg cho đến khi người bệnh

tỉnh, có thể uống được, chuyển sang thuốc Dihydroartemisinin - Piperaquin

phosphat 3 ngày (Bảng 6). Với trẻ em < 20kg liều sử dụng là 3mg/kg. Điều trị

artesunat tiêm cần tối thiểu 24h, kể cả khi người bệnh có thể uống được thuốc

trước khi hết 24h.

b) Phác đồ điều trị thay thế:

 Quinin dihydrochloride: tiêm hoặc truyền tĩnh mạch với liều 20 mg/kg cho 8

giờ đầu, sau đó 10 mg/kg cho mỗi 8 giờ tiếp theo (Bảng 8), cho đến khi tỉnh

thì chuyển sang uống Quinin sunfat (Bảng 4) + Doxycyclin (Bảng 9) cho đủ 7

ngày hoặc Dihydroartemisinin - Piperaquin phosphat liều 3 ngày (Bảng 3).

 Artemether tiêm:

+ Đường dùng: Tiêm bắp sâu.

+ Liều tính theo cân nặng:

• Ngày đầu tiên: 3,2 mg/kg.

• Từ ngày thứ 2: 1,6 mg/kg (không dùng quá 7 ngày), cho đến khi người

bệnh tỉnh, có thể uống được, chuyển sang sử dụng thuốc uống

Dihydroartemisinin - Piperaquin phosphate x 3 ngày liên tục.

Chú ý:

 Không dùng Artemether cho phụ nữ có thai trong 3 tháng đầu trừ trường

hợp sốt rét ác tính mà không có Quinin tiêm.

 Trong trường hợp không có thuốc Quinin tiêm thì sử dụng thuốc viên qua

sonde dạ dày.

 Khi dùng Quinin đề phòng hạ đường huyết và trụy tim mạch do truyền

nhanh.

2.3.2. Điều trị sốt rét ác tính ở phụ nữ có thai

Phụ nữ có thai khi bị sốt rét ác tính có thể dẫn đến sẩy thai, đẻ non, thai chết lưu và

dẫn đến tử vong. Do vậy phải tích cực điều trị diệt ký sinh trùng sốt rét kết hợp điều

trị triệu chứng, biến chứng.

 Điều trị sốt rét ác tính ở phụ nữ có thai trong 3 tháng đầu: dùng Quinin

dihydrochloride (Bảng 8) + Clindamycin (Bảng 10).

 Điều trị sốt rét ác tính ở phụ nữ có thai trên 3 tháng: dùng Artesunat tiêm như

với người bệnh sốt rét ác tính, khi tỉnh có thể chuyển sang uống

Dihydroartemisinin - Piperaquin phosphat (3 ngày)

Chú ý:

 Phụ nữ có thai hay bị hạ đường huyết, nhất là khi điều trị Quinin, nên truyền

Glucose 10% và theo dõi Glucose máu.

 Khi bị sảy thai hoặc đẻ non cần phải điều trị chống nhiễm khuẩn tử cung.

2.4. Điều trị hỗ trợ

a) Sốt cao hạ nhiệt bằng cách:

 Chườm mát

 Thuốc hạ nhiệt: Nếu nhiệt độ ≥ 38°5C với trẻ em hoặc ≥ 39°C với người

lớn. Thuốc hạ nhiệt chỉ dùng acetaminophen (Paracetamol) liều 15mg/kg/lần ở

người lớn hoặc 10 mg/kg/lần với trẻ em, không quá 4 lần trong 24 giờ.

b) Cắt cơn co giật:

 Dùng Diazepam, liều 0,1 - 0,2 mg/kg tiêm tĩnh mạch chậm hoặc bơm vào

hậu môn (liều 0,5 - 1,0 mg/kg). Tiêm nhắc lại liều trên nếu còn cơn co giật, thận

trọng khi dùng cho trẻ em dưới 1 tuổi.

 Ngoài ra có thể dùng phenobacbital (15 mg/kg sau đó duy trì liều 5

mg/kg/ngày trong 48 giờ). Khi sử dụng phenobacbital phải theo dõi sát tình trạng

nhịp thở của người bệnh và SpO2.

c) Xử trí sốc:

 Cần đo áp lực tĩnh mạch trung tâm (CVP) và duy trì áp lực tĩnh mạch trung

tâm không quá 6,5 cm H2O ở người bệnh không có suy hô hấp cấp và không quá

5,0 cm H2O ở người bệnh có hội chứng suy hô hấp cấp.

 Nếu huyết áp vẫn không cải thiện cần sử dụng thêm các thuốc vận mạch như

Noradrenalin, hoặc Dopamin. Nếu huyết áp vẫn không lên sau khi dùng

Noradrenalin liều 3mg/giờ thì phối hợp thêm với Adrenalin duy trì huyết áp tâm

thu > 90 mmHg.

 Với trẻ em có sốc, xử trí như trên (chú ý liều lượng cho thích hợp và bảo

đảm huyết áp tâm thu theo các lứa tuổi như sau: Huyết áp tối đa > 80 mmHg trẻ

em trên 10 tuổi, > 70 mmHg ở trẻ em 1 tháng đến 10 tuổi và > 60 mmHg ở trẻ sơ

sinh).

 Sử dụng thêm kháng sinh phổ rộng để phòng nhiễm khuẩn và nên cấy máu

trước khi dùng kháng sinh.

d) Xử trí suy hô hấp:

 Đặt Canule miệng họng.

 Hút đờm rãi miệng, họng.

 Nằm đầu cao 30°- 45°.

 Đặt ống thông dạ dày để cho ăn.

 Thở oxy 4-6 lít/phút duy trì SpO2 > 92%.

 Nếu hôn mê Glasgow ≤ 10 điểm thì đặt ống nội khí quản.

 Thở máy với thể tích lưu thông 6ml/kg cân nặng, tần số 16-20 lần phút,

FiO2 50%, PEEP 5 cm nước.

 Nếu tổn thương phổi nặng: tỉ lệ P/F < 300 thì thở máy theo phương thức

ARDS.

 Dùng kháng sinh khi có bội nhiễm phổi.

Chú ý: hạn chế mở khí quản và dùng thuốc ức chế hô hấp

đ) Xử trí suy thận cấp:

Trong trường hợp người bệnh suy thận cấp thể vô niệu hoặc thiểu niệu cần hạn chế

truyền dịch và duy trì cân bằng lượng nước vào như sau:

- < 15 mmol/l) có thể truyền Natri

Lượng nước vào = Lượng nước ra + 500 ml

 Nếu người bệnh có toan chuyển hóa (HCO3

bicarbonat 1,4%, theo dõi khí máu động mạch để điều chỉnh thích hợp.

 Nếu Huyết áp > 90 mmHg, nước tiểu < 0,5ml/kg cân nặng cần dùng thêm

Furosemid từ 40 mg - 80mg tiêm tĩnh mạch, theo dõi đáp ứng của thận và điều

chỉnh dịch truyền và liều Furosemid sao cho duy trì nước tiểu 80-100 ml/giờ, nếu

vẫn không có kết quả thì phải lọc máu (chạy thận nhân tạo hoặc lọc máu liên tục

nếu có tụt huyết áp).

 Chỉ định lọc máu khi:

• Nước tiểu 24 giờ < 500 ml sau khi đã được bù dịch đủ và dùng thuốc lợi

tiểu.

• Hoặc người bệnh có phù hoặc đe dọa phù phổi cấp.

• Hoặc có một trong các tiêu chuẩn sau: Creatinin máu > 500 μmol/l, kali

máu > 6 mmol/l, pH < 7,25 mà không điều chỉnh được bằng Bicacbonat.

• Lactac máu > 5 mmol/l.

 Khoảng cách lọc: Lọc máu hàng ngày hay cách ngày phụ thuộc mức độ thừa

dịch, tình trạng của người bệnh.

e) Xử trí thiếu máu do huyết tán hoặc xuất huyết:

 Truyền khối hồng cầu khi Hematocrit < 20% hoặc hemoglobin < 7g/dl.

 Truyền khối tiểu cầu khi tiểu cầu < 20.000/ml máu nếu không làm thủ thuật

xâm lấn hoặc < 50.000/ml nếu làm các thủ thuật xâm lấn.

 Không truyền Plasma nhưng nếu PT < 50% mà cần làm thủ thuật xâm lấn thì

nên truyền.

f) Xử trí hạ đường huyết:

 Duy trì ăn qua ống thông dạ dày liên tục hoặc nhiều bữa.

 Nếu có hạ đường huyết thì tiêm tĩnh mạch chậm 30-50 ml Glucose ưu trương

20% (trẻ em 1-2 ml/kg), sau đó truyền duy trì Glucose 10% liên tục 24 giờ đặc

biệt ở các người bệnh có vàng da, suy gan cấp (mỗi giờ 5-6 gam glucose) để

tránh hạ đường huyết tái phát, ngược lại nếu có tăng đường máu >10 mmol/l thì

truyền insulin tĩnh mạch liên tục liều thấp 1-2 đơn vị /giờ (duy trì đường huyết

khoảng 8-10 mmol/l).

g) Xử trí đái huyết cầu tố:

 Dấu hiệu và triệu chứng thường gặp của sốt rét đái huyết cầu tố là cơn sốt rét

điển hình có vàng da-niêm mạc và nước tiểu màu như nước vối hay cà phê đen.

Cần hỏi kỹ bệnh sử đái huyết cầu tố, các loại thuốc mới dùng gần đây, xét

nghiệm máu tìm ký sinh trùng sốt rét và thử nước tiểu tìm hemoglobin, số lượng

hồng cầu nhiều lần (trong đái huyết cầu tố số lượng hồng cầu giảm rất nhanh) và

xét nghiệm G6PD nếu có điều kiện.

 Xử trí:

+ Truyền Natri clorua 0,9% và các dịch khác duy trì lượng nước tiểu ≥ 2500

ml/24 giờ, 10-12 ml/kg/24 giờ với trẻ em.

+ Truyền khối hồng cầu khi Hematocrit < 25% hoặc hemoglobin < 7g/dl.

+ Nếu đang dùng Primaquin hoặc Quinin mà xuất hiện đái huyết cầu tố thì

ngừng ngay thuốc và thay bằng thuốc sốt rét khác.

+ Nếu người bệnh bị suy thận thì xử trí như suy thận do sốt rét ác tính.

Chú ý: Hiện tượng đái huyết cầu tố thường gặp trên người thiếu G6PD, khi gặp

các tác nhân gây ô xy hóa như thuốc, nhiễm khuẩn và một số loại thức ăn. Vì vậy

cần hỏi kỹ tiền sử, xét nghiệm máu nhiều lần để xác định đái huyết cầu tố do ký sinh

trùng sốt rét và loại trừ đái huyết cầu tố do các nguyên nhân khác.

h) Điều chỉnh rối loạn nước điện giải, kiềm toan

 Cân người bệnh hàng ngày (nếu có điều kiện) hoặc tính lượng dịch vào-ra

đầy đủ.

 Dấu hiệu mất nước: Giảm đàn hồi da, môi khô, mạch nhanh, huyết áp hạ,

giảm độ căng nhãn cầu, nước tiểu ít.

 Xử trí:

+ Dùng các dịch truyền đẳng trương nhưng không quá 2,5 lít/ngày với người

lớn và 20ml/kg trong 1-2 giờ đầu đối với trẻ em và theo dõi các xét nghiệm điện

- <15 mmol/l) có thể truyền natri

giải đồ, huyết áp và nước tiểu.

+ Nếu người bệnh có toan huyết (HCO3

bicarbonat 1,4%, theo dõi khí máu động mạch để điều chỉnh thích hợp.

Chú ý: Xác định thiểu niệu, vô niệu bằng cách đo lượng dịch thải ra (nước tiểu,

chất nôn...) và lượng dịch đưa vào. Cần thận trọng việc bù nước để tránh phù phổi

cấp (đặc biệt đối với người bệnh suy thận), theo dõi huyết áp, áp lực tĩnh mạch

trung tâm và hematocrit. Trước một người bệnh thiểu, vô niệu (lượng nước tiểu <

400 ml/24 giờ) cần tìm nguyên nhân do thiếu nước hay do suy thận cấp.

i) Chăm sóc, nuôi dưỡng:

 Để người bệnh nằm nơi sạch sẽ, khô, thoáng mát, tránh gió lùa, xoay trở 2-3

giờ một lần tránh loét tư thế (nên nằm đệm chống loét).

 Theo dõi người bệnh chặt chẽ: bằng máy theo dõi nếu có điều kiện.

 Theo dõi: Huyết áp, mạch, SpO2, nước tiểu, ý thức, nhịp thở 1 giờ /lần nếu

người bệnh có tụt huyết áp, đo nhiệt độ 3 giờ/ lần.

 Mạch, huyết áp, nhịp thở, nước tiểu, ý thức 3 giờ/lần nếu người bệnh ổn

định.

 Dinh dưỡng: Chế độ ăn đảm bảo đủ dinh dưỡng (khoảng 1500 - 2000

calo/ngày). Cho người bệnh ăn lỏng qua ống thông dạ dày nhiều bữa nhỏ hoặc

nhỏ giọt liên tục nếu người bệnh hôn mê. Nếu người bệnh nôn nhiều, không thể

ăn qua đường tiêu hóa thì nuôi dưỡng qua đường tĩnh mạch.

2.5. Liều lượng thuốc

Bảng 2: Bảng tính liều Chloroquin phosphat viên 250 mg (chứa 150 mg

baze) theo nhóm tuổi và cân nặng

 Liều tính theo cân nặng: Tổng liều 25mg baze/kg, hai ngày đầu chia 2 lần

uống cách nhau 6h; ngày thứ 3 uống 1 lần. Liều lượng thuốc điều trị như sau:

+ Ngày 1: 10 mg base /kg cân nặng.

+ Ngày 2: 10 mg base /kg cân nặng.

+ Ngày 3: 5 mg base/kg cân nặng.

 Liều tính theo nhóm tuổi (nếu không có cân) như sau:

Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Nhóm tuổi (viên) (viên) (viên)

½ ¼ Dưới 1 tuổi ½

1 ½ 1 - dưới 5 tuổi 1

2 1 5 - dưới 12 tuổi 2

3 1 ½ 12 - dưới 15 tuổi 3

4 2 Từ 15 tuổi trở lên 4

Bảng 3: Liều Dihydroartemisinin-Pipcraquin phosphate theo nhóm tuổi và cân

nặng

Mỗi viên thuốc chứa 40mg Dihydroartemisinin 40 mg và 320 mg Piperaquin

phosphate (biệt dược là Arterakine, CV Artecan). Điều trị ngày 1 lần, liên tục

trong 3 ngày, liều thuốc tính theo cân nặng như sau:

Cân nặng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

< 8kg ½ viên ½ viên ½ viên

8 - <17 kg 1 viên 1 viên 1 viên

17 - <25 kg 1 ½ viên 1 ½ viên 1 ½ viên

25 - <36kg 2 viên 2 viên 2 viên

36 - < 60kg 3 viên 3 viên 3 viên

≥ 60 kg 4 viên 4 viên 4 viên

Chú ý: Không dùng cho phụ nữ có thai 3 tháng đầu.

Bảng 4: Liều Quinin sulfat viên 250 mg tính theo nhóm tuổi và cân nặng

Liều tính theo cân nặng: 30 mg/kg/24 giờ (chia đều 3 lần mỗi ngày) điều trị 7

ngày. Liều tính theo nhóm tuổi (nếu không có cân) như sau:

Nhóm tuổi Số viên/ngày x số ngày Ghi chú

Dưới 1 tuổi 1 viên/ngày x 7 ngày

1 - dưới 5 tuổi 1½ viên/ngày x 7 ngày

5 - dưới 12 tuổi 3 viên/ngày x 7 ngày Chia đều 3 lần mỗi ngày

12 - dưới 15 tuổi 5 viên/ngày x 7 ngày

Từ 15 tuổi trở lên 6 viên/ngày x 7 ngày

Bảng 5: Liều Primaquin (viên 13,2 mg chứa 7,5 mg Primaquin base)

theo nhóm tuổi và cân nậng

 Liều tính theo cân nặng:

+ Điều trị giao bào P. falciparum/P. malariae/P.knowlesi liều duy nhất 0,5 mg

base/kg vào ngày thứ 3 của đợt điều trị.

+ Điều trị P.vivax hoặc P.ovale liều 0,25 mg base/kg/ngày x 14 ngày, điều trị

vào ngày đầu tiên cùng Chloroquin để diệt thể ngủ trong gan chống tái phát xa.

 Liều tính theo nhóm tuổi (nếu không có cân) như sau:

P. falciparum / P.vivax/P.ovale Nhóm tuổi P.knowles/P.malariae điều trị 14 ngày điều trị 1 lần

6 tháng - dưới 3 tuổi 1/2 viên uống 1 lần 1/4 viên/ngày x 14 ngày

3 - dưới 5 tuổi 1 viên uống 1 lần 1/2 viên/ngày x 14 ngày

5 - dưới 12 tuổi 2 viên uống 1 lần 1 viên/ngày x 14 ngày

12 - dưới 15 tuổi 3 viên uống 1 lần 1½ viên/ngày x 14 ngày

Từ 15 tuổi trở lên 4 viên uống 1 lần 2 viên/ngày x 14 ngày

Chú ý:

 Không dùng Primaquin cho trẻ em dưới 6 tháng tuổi và phụ nữ có thai, phụ

nữ trong thời kỳ cho con <6 tháng tuổi bú, người có bệnh gan. Nếu không có

điều kiện xét nghiệm G6PD thì cần theo dõi biến động khối lượnghồng cầu, màu

sắc da và màu sắc nước tiểu (nước tiểu chuyển mầu sẫm như nước vối hoặc mầu

nước cà phê đen) để dừng thuốc kịp thời.

 Với người bệnh thiếu G6PD nhiễm P. vivax hoặc P. ovale liều dùng khuyến

cáo là: 0,75mg base/kg trong 1 tuần x 8 thuần. Người bệnh phải được theo dõi

chặt chẽ trong suốt quá trình điều trị.

 Uống Primaquin sau khi ăn.

Bảng 6: Liều Artesunat tiêm, lọ 60 mg theo nhóm tuổi và cân nặng

 Liều tính theo cân nặng:

+ Liều giờ đầu 2,4 mg/kg, tiêm nhắc lại 2,4 mg/kg vào giờ thứ 12 (ngày đầu).

Sau đó mỗi ngày tiêm 1 liều 2,4 mg/kg (tối đa là 7 ngày) cho đến khi người bệnh

tỉnh, có thể uống được, chuyển sang thuốc Dihydroartemisinin - Piperaquin x 3

ngày.

+ Liều tính theo lứa tuổi (nếu không có cân) như sau:

Liều ngày thứ nhất Liều những ngày

sau Liều giờ thứ nhất Liều giờ thứ 12 Nhóm tuổi (dung dịch sau khi (dung dịch sau khi (dung dịch sau

pha thuốc) pha thuốc) khi pha thuốc)

Dưới 1 tuổi 2 ml 2 ml 2 ml

1 - dưới 5 tuổi 4 ml 4 ml 4 ml

5 - dưới 12 tuổi 8 ml 8 ml 8 ml

12 - dưới 15 tuổi 10 ml 10 ml 10 ml

Từ 15 tuổi trở lên 12 ml (2 lọ) 12 ml (2 lọ) 12 ml (2 lọ)

Chú ý:

 Không dùng Artesunat cho phụ nữ có thai trong 3 tháng đầu trừ trường hợp

sốt rét ác tính mà không có Quinin.

 Việc pha thêm 5 ml Natriclorua 0,9% là để chia liều lượng chính xác cho

người bệnh là trẻ em.

 Trường hợp không tiêm được tĩnh mạch thì có thể tiêm bắp. Chỉ cần pha bột

thuốc với 1 ml Natri bicarbonat 5%, lắc kỹ cho bột Artesunat tan hoàn toàn, rồi

tiêm bắp.

Bảng 7: Liều Quinin hydrochloride, ống 500 mg theo nhóm tuổi

Mỗi đợt điều trị 7 ngày. Liều tính theo nhóm tuổi (nếu không có cân) như sau:

Nhóm tuổi Số ống x số lần/ngày

Dưới 1 tuổi ống x 3 lần / ngày

1 - dưới 5 tuổi - ống x 3 lần / ngày

5 - dưới 12 tuổi ống x 3 lần / ngày

12 - dưới 15 tuổi ống x 3 lần / ngày

Từ 15 tuổi trả lên 1 ống x 3 lần / ngày

Chú ý: Tiêm Quinin dễ gây áp xe, cần tiêm bắp sâu và bảo đảm vô trùng.

Bảng 8: Liều Quinin dihydrochloride, ống 500 mg theo cân nặng

 Liều theo cân nặng: Tiêm bắp: 30 mg/kg/24 giờ. Mỗi đợt điều trị 7 ngày.

Liều 8 Liều 8 giờ Liều 8 giờ

Tên thuốc giờ đầu tiếp theo tiếp theo Liều mỗi ngày từ ngày 2-7

(0 - 8h) (9 - 16h) (17 - 24h)

Quinin- 20 10 mg/kg 10 30 mg/kg chia 3 lần cách nhau 8

Dihydro- mg/kg mg/kg giờ. Khi uống được chuyển sang

chlodride thuốc uống theo hướng dẫn

 Thuốc được pha trong Natri clorua 0,9% hoặc Glucose 5% để truyền tĩnh

mạch. Nếu trước đó người bệnh chưa điều trị Quinin thì truyền tĩnh mạch với liều

20 mg/kg 8 giờ đầu, sau đó 10 mg/kg 8 giờ một lần cho đến khi người bệnh uống

được chuyển sang dùng Quinin sulfat liều 30 mg/kg chia 3 lần trong ngày, cho đủ

7 ngày điều trị, nên phối hợp với Doxycyclin liều 3 mg/kg x 7 ngày (không dùng

cho trẻ em dưới 8 tuổi và phụ nữ có thai) hoặc Clindamycin liều 15 mg/kg/24

giờ x 7 ngày.

Ví dụ: 1 người nặng 50kg, liều truyền đầu tiên 1000 mg Quinin dihydrochloride

(8 giờ đầu), sau đó cứ 8 giờ truyền 500 mg, pha trong 500 ml Natri clorua 0,9%

hoặc Glucose 5%, với tốc độ 40 giọt/phút.

Chú ý: Trường hợp người bệnh suy thận cần tính toán tổng lượng dịch truyền

thích hợp, nếu cần chuyển sang tiêm bắp.

Bảng 9: Liều Doxycyclin viên 100mg theo nhóm tuổi và cân nặng

 Liều lượng tính theo cân nặng: 3mg/kg/ngày uống 1 lần x 7 ngày

 Liều tính theo nhóm tuổi nếu không có cân như sau:

Nhóm tuổi Số viên/ngày x số ngày

8 - dưới 12 tuổi 1/2 viên/ngày x 7 ngày

12 - dưới 15 tuổi 3/4 viên/ngày x 7 ngày

Từ 15 tuổi trở lên 1 viên/ngày x 7 ngày

Chú ý: Chỉ dùng phối hợp với Quinin viên (Quinin sulfat) hoặc Quinin tiêm

(Quinin hydrochloride/dihydrochloride) ở người lớn và trẻ em trên 8 tuổi

Bảng 10: Liều Clindamycin (viên 150mg hoặc 300mg) theo tuổi

và cân nậng

 Liều tính theo cân nặng 15 mg/kg/24 giờ chia 2 lần x 7 ngày.

 Liều tính theo nhóm tuổi, nếu không có cân như sau:

Số viên/ngày x số ngày Nhóm tuổi Viên 150 mg Viên 300 mg

Dưới 3 tuổi 1 viên/ngày x 7 ngày 1/2 viên/ngày x 7 ngày

Từ 3 - dưới 8 tuổi 1½ viên/ngày x 7 ngày 3/4 viên/ngày x 7 ngày

Từ 8 - dưới 12 tuổi 2 viên/ngày x 7 ngày 1 viên/ngày x 7 ngày

Từ 12 - dưới 15 tuổi 3 viên/ngày x 7 ngày 1½ viên/ngày x 7 ngày

Từ 15 tuổi trở lên 4 viên/ngày x 7 ngày 2 viên/ngày x 7 ngày

Chú ý: Chỉ dùng phối hợp với Quinin viên (Quinin sulfat) hoặc Quinin tiêm

(Quinin hydrochlodride/dihydrochlodride) ở phụ nữ có thai dưới 3 tháng và trẻ em

dưới 8 tuổi.

Bảng 11: Liều thuốc phối hợp Artesunat 100mg và Mefloquin base 200mg theo

tuổi và cân nặng

 Uống ngày 1 lần, liên tục trong 3 ngày.

 Liều lượng thuốc theo tuổi hoặc cân nặng như sau:

Nhóm tuổi Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Cân nặng tương ứng

5-9kg 9-18 kg 18 - 30 kg

2,5 - 11 tháng 1 - 5 tuổi 5 - dưới 10 tuổi Từ 10 tuổi trở lên > 30 kg ¼ viên ½ viên 1 viên 2 viên ¼ viên ½ viên 1 viên 2 viên ¼ viên ½ viên 1 viên 2 viên

 Không sử dụng điều trị thuốc cho những người có biểu hiện tâm thần, tiền sử

động kinh, phụ nữ có thai.

2.6. Theo dõi trong quá trình điều trị

a) Theo dõi lâm sàng:

 Nếu bệnh diễn biến nặng hơn hoặc trong 3 ngày điều trị mà người bệnh vẫn

sốt hoặc tình trạng bệnh xấu đi và còn ký sinh trùng sốt rét (KST SR) thì dùng

thuốc điều trị thay thế.

 Nếu bệnh diễn biến nặng hơn hoặc trong 3 ngày điều trị mà người bệnh vẫn

sốt hoặc tình trạng bệnh xấu đi và không còn ký sinh trùng sốt rét thì tìm nguyên

nhân khác.

 Nếu người bệnh bị nôn trong vòng 30 phút sau khi uống thuốc, thì phải uống

liều khác thay thế hoặc dùng thuốc dạng tiêm.

b) Theo dõi ký sinh trùng:

 Lấy lam máu kiểm tra KST SR hàng ngày.

 Chỉ cho người bệnh ra viện khi kết quả soi lam âm tính.

Bảng 12: Phân tuyến điều trị bệnh sốt rét

Tuyến điều trị

Thể bệnh

Trạm y tế xã Y tế thôn, bản Cơ sở y tế tư nhân Bệnh viện Trung ương, Tỉnh Bệnh viện huyện và tương đương

chưa rét

+ + + + +

Sốt biến chứng (SR thường)

+ + + + Sốt rét ở phụ nữ có thai

+ + Sốt rét thể ác tính Xử trí ban đầu (1) Xử trí ban đầu (1) Xử trí ban đầu (1)

Chú thích (1) Xử trí ban đầu và chuyển người bệnh lên tuyến trên.

3.1. Y tế thôn bản xử trí ban đầu:

Theo dõi người bệnh nếu có một trong các dấu hiệu dự báo sốt rét ác tính (xem

mục 3.2.1), thì cần cho uống ngay liều đầu tiên của Dihydroartemisinin - Piperaquin

phosphate (Bảng 4) và chuyển lên tuyến trên. Thuốc phải được nghiền nhỏ và pha

trong nước cho tan hoàn toàn. Trước khi cho uống thuốc phải cho người bệnh uống

một ít nước, nếu uống được, không bị sặc, mới cho uống tiếp thuốc đã pha.

3.2. Trạm y tế xã, cơ sở y tế tư nhân xử trí ban đầu:

Người bệnh có các dấu hiệu dự báo sốt rét ác tính cần xử trí như sau:

a) Tiêm ngay liều đầu tiên Artesunat (Bảng 6) hoặc Quinin hydrochloride nếu là

phụ nữ có thai dưới 3 tháng tuổi (Bảng 7, 8) hoặc uống 1 liều DHA- PPQ (Bảng 3)

hoặc Quinine sulfat (Bảng 7) sau đó chuyển người bệnh lên tuyến trên. Nếu thời

gian vận chuyển dài trên 8 giờ thì cần cho liều tiếp theo.

b) Không chuyển ngay những người bệnh đang trong tình trạng sốc (mạch nhanh

nhỏ khó bắt, chân tay lạnh, vã mồ hôi, tụt huyết áp), phù phổi cấp, co giật...

c) Trường hợp không thể chuyển lên tuyến trên được, cần đề nghị tuyến trên tới

tăng cường bằng phương tiện nhanh nhất, đồng thời tiếp tục điều trị tích cực trong

khi chờ đợi.

Phụ lục 5: Bảng thống kê số ca tử vong do sốt rét ở Việt Nam và thế giới

(Đăng trên: The Guadian, truy cập 20/6/2016)

Country

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 1980

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 1990

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 2000

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 2010

Afghanistan SOURCE: THE LANCET 21.4 30.8 17.2 5.1

Angola 63.3 67.4 119.4 79.8

Argentina 0.4 <0.1 <0.1 <0.1

Armenia 0.4 <0.1 <0.1 ..

Azerbaijan 0.6 0.1 <0.1 <0.1

Bangladesh 20.1 11.7 5.8 2.8

Belize 7.3 5 3 1.4

Benin 102.2 100.8 120.2 138.3

Bhutan 29.9 15.8 7.3 2

Bolivia 3.3 2.1 0.7 0.3

Botswana 8.5 9.1 25.4 18.5

Brazil 0.7 0.5 0.1 <0.1

Burkina Faso 108.8 132.1 205.7 184.1

Burma 248.8 145.3 103.3 53.3

Burundi 100.2 140.7 243 141.6

Cambodia 113 83.8 48.3 13.4

Cameroon 82.8 92.7 174.9 99.6

112.8 165 147.6 242.9 Central African Republic

Chad 69.9 68.6 97.8 87.7

China <0.1 <0.1 <0.1 <0.1

Country

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 1980

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 1990

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 2000

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 2010

Colombia 1.3 0.3 0.1 0.5

Comoros 55 136.6 57.1 71.7

Congo 105.6 247.8 105 173.6

Costa Rica 0.2 <0.1 <0.1 <0.1

Côte d’Ivoire 81.2 159.2 141.7 113.6

102.1 141.7 222.1 145.8 Democratic Republic of the Congo

Djibouti 8.7 38.3 26.6 15.8

0.6 0.2 0.1 0.3 Dominican Republic

Ecuador 1 0.5 0.1 0.7

Egypt 0.1 .. .. <0.1

El Salvador 0.5 <0.1 <0.1 <0.1

104.4 223.9 110.8 160.5 Equatorial Guinea

Eritrea 49.8 87.7 55.3 51.3

Ethiopia 40.2 103.7 50.6 81.4

Gabon 66.1 188 111.9 145.5

Gambia 48.8 66.9 93.3 51.3

Georgia 0.4 <0.1 <0.1 <0.1

Ghana 61.9 93.1 96.7 73.1

Guatemala 8.7 0.9 0.3 3.4

Guinea 116.4 157.2 121.7 123.8

121.1 118.7 142.7 116.3 Guinea- Bissau

Country

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 1980

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 1990

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 2000

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 2010

Guyana 6 4.5 4.4 2.2

Haiti 29.9 21.8 19.8 10.3

Honduras 1.5 0.7 0.4 0.2

India 37.2 20.8 12.7 4.9

Indonesia 38.2 15.8 9 4.2

Iran <0.1 <0.1 <0.1 <0.1

Iraq 0.5 <0.1 <0.1 <0.1

Kenya 44.8 97.2 127.2 63.4

Kyrgyzstan 0.6 0.1 <0.1 <0.1

Laos 61.1 42.4 26.6 11.6

Liberia 94.6 102.5 176.5 158.2

Libya <0.1 <0.1 <0.1 ..

Madagascar 43.2 70.4 80.6 110.7

Malawi 47.8 114.1 84 66.9

Malaysia 2.2 0.8 0.3 0.1

Mali 127.6 125.9 161.8 169.7

Mauritania 27.2 29.3 49.8 44.2

Mauritius 3.8 1.6 .. ..

Mexico 0.5 <0.1 <0.1 <0.1

Morocco 5.8 2.2 1.2 ..

183.1 263.1 176.1 Mozambique 144.5

Namibia 14.8 15.1 26.7 27.3

Nepal 20.2 13.2 6.8 3.4

Nicaragua 3 1.1 0.5 0.3

Country

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 1980

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 1990

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 2000

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 2010

Niger 76.6 94.8 119.1 76.2

Nigeria 101 161.8 155 115.8

North Korea 0.4 <0.1 <0.1 <0.1

Oman 0.2 <0.1 .. <0.1

Pakistan 16.5 6.5 3.2 9.3

Panama 0.3 0.1 <0.1 0.2

88.1 53.4 31.6 70.9 Papua New Guinea

Paraguay 0.4 <0.1 <0.1 <0.1

Peru 0.4 0.1 <0.1 0.2

Philippines 2.8 0.8 0.4 1.5

Rwanda 75.9 185.5 108.9 125.7

88 104.1 105 93.1 Sao Tome and Principe

Saudi Arabia 0.1 <0.1 <0.1 <0.1

Senegal 73.1 151.9 95 100.9

Sierra Leone 128.1 231.8 152.1 136.5

66.9 26.5 16.4 44.2 Solomon Islands

Somalia 48 151.4 97.6 94.7

South Africa 1.1 3.6 1.4 1.1

South Korea 0.4 <0.1 <0.1 <0.1

Sri Lanka 0.9 0.4 0.1 0.3

Sudan 32.4 75.3 34.9 48.4

Suriname 2.9 3.3 0.7 2.5

Country

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 1980

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 1990

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 2000

Cumulative probability of malaria death (per 1000 population) 2010

Swaziland 15.8 49.1 69.2 31.3

Syria 0.4 0.2 <0.1 ..

Tajikistan 0.6 0.4 0.4 0.2

Tanzania 93.7 171.8 192.7 81.1

Thailand 10.7 4.1 1.4 0.4

Timor-Leste 122.4 90.9 65.8 34.3

Togo 96.3 93.5 99.3 119.9

Turkey 0.7 0.1 <0.1 <0.1

Turkmenistan 0.7 0.1 <0.1 ..

Uganda 81.6 123.4 203.5 111

<0.1 <0.1 .. .. United Arab Emirates

Uzbekistan 0.5 0.1 <0.1 <0.1

Vanuatu 12.7 7.3 4.2 2.2

Venezuela 0.2 0.3 0.1 <0.1

Vietnam 57.5 36.2 15 1.4

Yemen 24.2 24.2 43.9 29.2

Zambia 76.2 148.4 250.9 113.6

Zimbabwe 29.9 34.1 78.8 60.9