Bước đầu chuyển gen Bt vào cây mía

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179<br /> <br /> BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN Bt VÀO CÂY MÍA (Saccharum officinarum L.)<br /> Phan Tường Lộc*, Hoàng Văn Dương, Mai Trường, Lê Tấn Đức, Trần Thị Ngọc Hà,<br /> Văn Đắc Thành, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ<br /> Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)locphan@itb.ac.vn<br /> TÓM TẮT: Nhóm sâu đục thân là một trong những loài sâu hại làm giảm năng suất đáng kể cho mía.<br /> Việc phun thuốc bảo vệ mía gặp một số trở ngại do mật độ mía ở ruộng rất dày, lá mía sắc và sâu đục thân<br /> lại sống bên trong thân mía. Chuyển gen kháng sâu (Bt- tổng hợp) cry1Ab và cry1B-cry1Ab (gen lai) vào<br /> hai giống mía VN 84 4137 và Suphanbury 7 nhằm mong muốn tạo ra các giống mía có khả năng kháng<br /> sâu hiệu quả, chủ yếu là sâu đục thân. Hai dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được biến nạp<br /> các plasmid mang gen cry1Ab và gen cry1B-cry1Ab dùng để chuyển gen vào thực vật. Khảo sát các điều<br /> kiện nuôi cấy mô mía cho thấy, khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ mảnh lá non ở lõi ngọn mía ex vitro, tỉ lệ tạo<br /> mô sẹo cao nhất của giống VN84 4137 trên môi trường có 2,4-D ở nồng độ 3 mg/l là 93,33%, trong khi<br /> của giống Suphanbury 7 ở nồng độ 2 mg/l là 96,67%. Tỉ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao nhất trên môi trường<br /> có tổ hợp BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là 100% ở cả hai giống. Bước đầu chuyển gen cry1Ab và cry1Bcry1Ab gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mía đã thu được các khối mô sẹo có biểu<br /> hiện GUS và kháng chất chọn lọc phosphinothricin ở nồng độ 3 mg/l, là nồng độ gây chết khi khảo sát khả<br /> năng chống chịu phosphinothricin ở mô sẹo không chuyển gen.<br /> Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Bt, chuyển gen, sâu đục thân cây mía.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Hơn một thập niên qua, ngành mía đường<br /> Việt Nam vẫn luôn gặp khó khăn do nguồn<br /> nguyên liệu mía cung cấp không đủ để sản xuất.<br /> Với nhu cầu ngày càng tăng, và theo dự kiến<br /> của ngành, đến năm 2020 cả nước sẽ đạt mức<br /> tiêu thụ đường 2 triệu tấn/năm [25], việc bảo<br /> đảm sản lượng mía đáp ứng đủ và ổn định cho<br /> sản xuất là vấn đề cần thiết.<br /> Một trong những nguyên nhân làm giảm sản<br /> lượng mía là do sâu hại, trong đó, nhóm sâu đục<br /> thân thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera) có thể<br /> gây thiệt hại có thể lên đến 30% [14, 24]. Ứng<br /> dụng chuyển gen Bt là một giải pháp tiềm năng<br /> để tạo ra được các giống mía có khả năng kháng<br /> các loại sâu đục thân [3, 9, 18, 21], mà tập tính<br /> sống của chúng thường gây khó khăn cho việc<br /> xử lý bằng hóa chất [14].<br /> Độc tố kháng côn trùng từ Bacillus<br /> thuringiensis (Bt) là các độc tố crystal viết tắt là<br /> Cry do các gen cry mã hóa [20]. Độc tố Cry<br /> được phân loại dựa trên cơ sở đồng dạng của<br /> trình tự amino acid của tiền độc tố. Các protein<br /> tiền độc tố với ít hơn 45% sự đồng nhất trình tự<br /> sẽ có hệ số khác nhau trong dãy phân hạng đầu<br /> tiên (ví dụ Cry1, Cry2) và ở mức dưới 78% và<br /> 95% đồng dạng sẽ thiết lập ranh giới cho các<br /> dãy phân hạng thứ hai và thứ ba (ví dụ Cry1Ab)<br /> 170<br /> <br /> [12]. Tính đặc hiệu và hoạt tính của độc tố Cry<br /> là kết quả của sự tương tác và ly giải của tiền<br /> độc tố bên trong hệ thống tiêu hóa của từng loài<br /> côn trùng cụ thể [12]. Do biến nạp vào thực vật<br /> dùng các gen cry đơn, nguyên bản cho biểu hiện<br /> độc tố không cao trong giai đoạn ban đầu,<br /> nghiên cứu chuyển gen Bt đã có những cải tiến<br /> trong giai đoạn sau này. Các gen cry được tổng<br /> hợp có nhiều thay đổi trình tự so với nguyên<br /> bản, như giảm các thành phần A, T, tăng tỷ lệ C<br /> + G, để thích hợp biểu hiện cao ở thực vật [5,<br /> 9]; hoặc áp dụng mô hình hiệu quả quy tụ<br /> (pyramiding) để tạo hiệu quả kháng sâu cao khi<br /> lai các gen cry có tác động khác nhau lại và<br /> đồng chuyển vào thực vật [9].<br /> Theo các công bố, gen cry1Ab có tính kháng<br /> chủ yếu với côn trùng thuộc bộ Lepidoptera [1,<br /> 2, 6, 12] và cry1B có tính kháng kép trên<br /> Lepidoptera và Coleoptera [5, 12]. Protein lai<br /> Cry1B-Cry1Ab có thể tạo hiệu ứng kháng hiệu<br /> quả hơn đối với Lepidoptera và cả Coleoptera<br /> [4].<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> Giống mía: Hai giống mía được dùng để<br /> chuyển gen là Suphanbury 7 (Thái Lan) và<br /> VN84 4137 (Việt Nam), được cung cấp bởi<br /> <br /> Phan Tuong Loc et al.<br /> Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía<br /> Đường, xã Phú An, huyện Bến Cát, tỉnh Bình<br /> Dương.<br /> Chủng vi khuẩn: Chủng vi khuẩn E. coli<br /> mang plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và<br /> chủng E. coli DH5α. Chủng vi khuẩn<br /> Agrobacterium tumefaciens EHA 105 có mang<br /> sẵn helper plasmid chứa các gen vir và gen<br /> kháng kháng sinh rifampicin.<br /> Plasmid: Plasmid pCRY1B-1Ab, kích thước<br /> khoảng 17 kb, mang tổ hợp gen Pubi/cry1Bcry1Ab/Tnos (cry1B-cry1Ab: gen lai - tổng hợp)<br /> và gen chọn lọc P70S/bar/T35S trong T-DNA<br /> A<br /> B<br /> <br /> KaR<br /> <br /> LB<br /> <br /> LB<br /> <br /> T35S<br /> <br /> bar<br /> <br /> T35S<br /> <br /> bar<br /> <br /> P35S<br /> <br /> P70S<br /> <br /> PUbi<br /> <br /> biểu hiện ở thực vật, và gen nptII kháng<br /> kanamycin biểu hiện ở vi khuẩn. Gen bar quy<br /> định tính kháng phosphinothricin (PPT) dùng để<br /> chọn lọc đối tượng chuyển gen (hình 1A).<br /> Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab, có kích<br /> thước 15,6 kb, từ plasmid pCAMBIA3301 được<br /> chèn thêm tổ hợp gene Pubi-1/cry1Ab/Tnos<br /> trong TDNA (Pubi : maize ubiquitin-1 (Ubi-1)<br /> promoter, Tnos: nopaline synthase (NOS)<br /> terminator, cry1Ab: gen tổng hợp) (hình 1B).<br /> Các gen cry1Ab, cry1B-cry1Ab có nguồn gốc<br /> từ Altosaar I. (Canada), chương trình trao đổi<br /> khoa học.<br /> cry1Ab<br /> <br /> Tnos<br /> <br /> cry1Ab<br /> <br /> Tnos<br /> <br /> cry1B<br /> <br /> P35S<br /> <br /> 5'UTR Ubi<br /> <br /> gus<br /> <br /> Tnos<br /> <br /> PUbi<br /> <br /> RB<br /> <br /> RB<br /> <br /> KaR<br /> <br /> Hình 1. Sơ đồ plasmid<br /> A. Plasmid pCRY1B-1Ab; B. Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab<br /> <br /> Môi trường<br /> Môi trường nuôi cấy vi khuẩn gồm môi<br /> trường LB (Luria-Bertani) dùng nuôi cấy và giữ<br /> giống E. coli và Agrobacterium tumefaciens;<br /> môi trường AB (Chilton) dùng để chuyển gen.<br /> Môi trường nuôi cấy thực vật gồm môi<br /> trường khoáng cơ bản MS, vitamin MS, vitamin<br /> B5, đường 30 g/l, pH 5,8; chất điều hòa sinh<br /> trưởng BAP, NAA.<br /> Phương pháp<br /> Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli bằng<br /> xung điện<br /> Biến nạp được thực hiện bằng xung điện<br /> trên máy BTX ECM 830 ở 2500 V, 40 uF, 5 ms,<br /> cuvette 2 mm. Vi khuẩn sau khi biến nạp được<br /> chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung<br /> kanamycin 100 mg/l và được ly trích plasmid<br /> để kiểm tra đặc điểm, kích thước bằng enzyme<br /> cắt giới hạn HindIII [8, 15].<br /> Biến nạp plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium<br /> tumefaciens<br /> Biến nạp được thực hiện bằng phương pháp<br /> CaCl2 nhiệt. Vi khuẩn sau khi biến nạp được<br /> cấy chọn lọc trên môi trường có bổ sung<br /> rifampicin 100 mg/l và kanamycin 100 mg/l.<br /> Theo dõi kết quả sau 24-48 giờ [10, 11, 16].<br /> <br /> Kiểm tra sự hiện diện của các gen cry1Ab và<br /> gen cry1B-cry1Ab bằng phương pháp PCR<br /> Đối với gen cry1Ab, trình tự mồi xuôi là<br /> (F): 5’-TTC CT T GGA CGA AAT CCC ACC3’ và mồi ngược là (R): 5’-GCC AGA ATT<br /> GAA CAC ATG AGC GC-3’ kích thước đoạn<br /> khuếch đại tương ứng 559 bp. Đối với gen<br /> cry1B-cry1Ab, trình tự mồi xuôi là (F): 5’-GAT<br /> AGC AGG ACC TAT CCA AT-3’ và mồi<br /> ngược là (R): 5’-GCC GAA GAG GGA GGC<br /> GTC AA-3’, kích thước đoạn khuếch đại tương<br /> ứng là 0,5 kb. Chương trình nhiệt phản ứng<br /> PCR: 94oC/4 phút (94oC/30 giây, 50-54oC/1<br /> phút, 72oC/30-90 giây), 72oC/10 phút, với 35<br /> chu kỳ. Hỗn hợp các thành phần của phản ứng<br /> PCR gồm có 5 l buffer PCR 5X, 0,5 l dNTP<br /> 10 mM, 0,25 l taq polymerase 5 U/l, 2 l mồi<br /> xuôi 1 M, 2 l mồi ngược 1 M, 1 l DNA<br /> plasmid, thêm nước cất đủ thể tích 25 l [7].<br /> Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên quá trình tạo<br /> mô sẹo từ lá non<br /> Phần lõi lá non bên trong ngọn mía, thường<br /> ở tình trạng vô trùng, được cắt thành các khoanh<br /> dày 2 mm và tách các lớp lá để nuôi cấy trên<br /> môi trường tạo mô sẹo gồm thành phần khoáng<br /> MS, vitamin MS, casein 0,5 g/l và agar 10 g/l,<br /> có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ khác nhau<br /> 171<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179<br /> <br /> (0; 1; 2; 3; 4 mg/l) để đánh giá ảnh hưởng của<br /> 2,4-D lên quá trình tạo mô sẹo của mẫu [19].<br /> Khảo sát ảnh hưởng của BAP và NAA lên quá<br /> trình tái sinh chồi từ mô sẹo<br /> Mô sẹo sau thời gian nuôi sẽ được cho tái<br /> sinh chồi trên môi trường có thành phần khoáng<br /> MS, vitamin B5, bổ sung tổ hợp chất điều hòa<br /> sinh trưởng BAP (1; 2 mg/l) NAA (0,2; 0,5; 1<br /> mg/l) [23].<br /> Khảo sát ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT lên<br /> sự phát triển mô sẹo, cây con in vitro<br /> Nuôi cấy tạo mô sẹo và nuôi cấy cây con<br /> trên môi trường có bổ sung PPT ở các nồng độ<br /> khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/l) vào môi trường,<br /> để đánh giá ảnh hưởng của PPT lên sự phát<br /> triển của mô sẹo và cây con [13].<br /> Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi<br /> khuẩn Agrobacterium tumefaciens và chọn lọc<br /> mô chuyển gen<br /> Vi khuẩn A. tumefaciens được nuôi cấy lắc<br /> qua đêm ở 28oC trong môi trường LB có bổ<br /> sung kháng sinh kanamycin 100 mg/l và<br /> rifampicin 50 mg/l, sau đó, được ly tâm lấy<br /> sinh khối ở 4000 g, trong 5 phút và chuyển sang<br /> nuôi mới trong môi trường AB ở các điều kiện<br /> như trên có bổ sung thêm acetocyringone 200<br /> M trong 1 giờ. Mô sẹo được để khô bớt độ ẩm<br /> trong tủ cấy vô trùng khoảng 30 phút, rồi ngâm<br /> 10 phút trong dịch vi khuẩn ở điều kiện áp suất<br /> thường, sau đó đưa vào điệu kiện chân không 50 kPa trong 3 phút rồi đưa trở lại môi trường<br /> áp suất thường 5 phút, trước khi được mang ra<br /> thấm khô và chuyển sang ủ chung với vi khuẩn<br /> trên môi trường tạo mô sẹo, khoảng 2-3 ngày.<br /> Mô sẹo sau đó được rửa sạch bằng dung<br /> dịch kháng sinh cefotaxime 500 mg/l để diệt<br /> khuẩn Agrobacterium tumefaciens, rồi chuyển<br /> sang chọn lọc mô chuyển gen trên môi trường<br /> tạo mô sẹo, có bổ sung cefotaxime ở nồng độ<br /> 500 mg/l và PPT ở nồng độ ngưỡng gây chết<br /> [17].<br /> Khảo sát sự biểu hiện của gen chỉ thị gus bằng<br /> kỹ thuật hóa mô [13]<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Biến nạp tạo chủng vi khuẩn E. coli chứa<br /> vector plasmid pCRY1B-1Ab<br /> 172<br /> <br /> Để có thể lưu giữ và nhân bản, plasmid<br /> pCRY1B-1Ab được biến nạp vào dòng E. coli<br /> DH5 bằng phương pháp xung điện. Vi khuẩn<br /> sau khi chuyển gen được cấy trải để chọn lọc<br /> trên môi trường LB rắn có bổ sung kanamycin<br /> 100 mg/l. Sau 2 ngày, nhận được khoảng 70<br /> khuẩn lạc mọc trên đĩa petri nuôi cấy, được giả<br /> định đã biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab, trong<br /> khi ở đĩa đối chứng nuôi cấy vi khuẩn E. coli<br /> DH5 không biến nạp, không có khuẩn lạc nào<br /> xuất hiện.<br /> Các khuẩn lạc giả định biến nạp plasmid<br /> được chọn và nuôi cấy trong môi trường LB<br /> lỏng có bổ sung kanamycin 100 mg/l để tách<br /> plasmid và phân tích.<br /> Plasmid sau khi tách chiết, được cắt bằng<br /> enzyme giới hạn HindIII và điện di kiểm tra<br /> trên gel agarose, cho thấy có 1 băng DNA 17 kb<br /> phù hợp với kích thước plasmid pCRY1B-1Ab<br /> chứng tỏ các dòng E. coli DH5 đã được biến<br /> nạp plasmid pCRY1B-1Ab (hình 2).<br /> L<br /> <br /> 1<br /> 17 kb<br /> <br /> Hình 2. Kiểm tra plasmid cry1B-cry1Ab sau khi<br /> biến nạp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5<br /> L. Thang chuẩn DNA -HindIII; 1. Plasmid kiểm tra<br /> được cắt bằng enzyme HindIII có kích thước khoảng<br /> 17 kb.<br /> <br /> Biến nạp tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium<br /> tumefaciens mang plasmid pCAMBIA3301cry1Ab và dòngvi khuẩn A. tumefaciens<br /> mang plasmid pCRY1B-1Ab<br /> Hai dòng E. coli mang plasmid<br /> pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab được<br /> nhân lên và tách plasmid. Biến nạp plasmid<br /> pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab vào<br /> <br /> Phan Tuong Loc et al.<br /> vi khuẩn Agrobacterium tumefacien EHA 105<br /> được thực hiện bằng phương pháp xử lý nhiệt<br /> với CaCl2.<br /> Vi khuẩn sau khi biến nạp được cấy chọn<br /> lọc trên môi trường LB rắn có bổ sung<br /> kanamycin 100 mg/l và rifampicin 100 mg/l (hệ<br /> thống binary vector) ở 28oC. Sau 2 ngày, trên<br /> các đĩa nuôi cấy xuất hiện khoảng 20 khuẩn lạc<br /> Agrobacterium tumefaciens EHA 105 giả định<br /> đã biến nạp plasmid.<br /> Tách khuẩn lạc và kiểm tra sự có mặt của<br /> các gen cry1Ab và cry1B-cry1Ab trong cấu trúc<br /> bằng phương pháp PCR với các mồi đặc hiệu.<br /> Kết quả biểu hiện trên gel agarose với marker<br /> 1 kb cho thấy, ở dòng A. tumefaciens biến<br /> nạp plasmid pCAMBIA-Cry1Ab và dòng<br /> A. tumefaciens biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab,<br /> sản phẩm PCR từ các plasmid được tách đều có<br /> băng khuếch đại của gen cry1Ab giống với đối<br /> chứng dương<br /> (được khuếch đại từ<br /> pCAMBIA3301-cry1Ab của E. coli), phù hợp<br /> với trình tự mục tiêu là 559 bp (hình 3). Trong<br /> khi đó ở dòng A. tumefaciens biến nạp<br /> pCRY1B-1Ab còn có thêm băng khuếch đại<br /> trình tự đặc hiệu của đoạn DNA cry1B-cry1Ab<br /> giống với đối chứng dương (được khuếch đại từ<br /> pCRY1B-1Ab của E. coli) phù hợp với trình tự<br /> mục tiêu là khoảng 0,5 kb (hình 4).<br /> L<br /> <br /> PC H2O 1<br /> <br /> 500 bp<br /> <br /> Hình 3. Kết quả kiểm tra bằng PCR sự hiện diện<br /> gen cry1Ab trên các plasmid của vi khuẩn<br /> Agrobacterium tumefaciens.<br /> L. Thang chuẩn DNA 1 kb; PC. Băng DNA 559 bp<br /> được khuếch đại từ vi khuẩn E. coli mang<br /> pCAMBIA3301-cry1Ab; 1. Băng DNA 559 bp được<br /> <br /> khuếch đại từ vi khuẩn A. tumefaciens biến nạp<br /> pCAMBIA3301-cry1Ab; 2. Băng DNA 559 bp được<br /> khuếch đại từ vi khuẩn A. tumefaciens biến nạp<br /> pCRY1B1Ab.<br /> <br /> L<br /> 2<br /> <br /> PC H2O<br /> <br /> 1<br /> <br /> 559 bp<br /> <br /> Hình 4. Kết quả kiểm tra bằng PCR sự hiện diện<br /> của gen cry1B-cry1Ab trên plasmid của vi<br /> khuẩn A. tumefaciens bằng PCR.<br /> L. Thang chuẩn DNA 1 kb; PC. Băng DNA 0,5 Kb<br /> được khuếch đại từ vi khuẩn E. coli mang pCRY1BAb; 1. Băng DNA 0,5 Kb được khuếch đại từ vi<br /> khuẩn A. tumefaciens biến nạp pCRY1B-1Ab.<br /> <br /> Như vậy, dòng vi khuẩn A. tumefaciens EHA<br /> 105 biến nạp plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab<br /> và dòng vi khuẩn A. tumefaciens EHA 105 biến<br /> nạp plasmid pCRY1B-1Ab đã được thực hiện<br /> thành công và có thể dùng để chuyển gen vào<br /> thực vật.<br /> Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên quá trình<br /> tạo mô sẹo của mô lá<br /> Mô lá non mía được nuôi cấy trên môi<br /> trường tạo mô sẹo có bổ sung chất điều hòa sinh<br /> trưởng 2,4-D ở các nồng độ khác nhau. Mô sẹo<br /> bắt đầu hình thành sau 12 ngày ở các mép mô.<br /> Mô sẹo của giống Suphanbury 7 mềm và ướt<br /> hơn ở giai đoạn đầu, màu sắc khối mô vàng nhạt<br /> hơn so với giống VN84 4137 (hình 5). Sau 28<br /> ngày, tỉ lệ mô sẹo hình thành khác biệt rõ rệt<br /> nhất giữa các công thức. Công thức với nồng độ<br /> 2,4-D 3 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất<br /> ở giống VN84 4137 và 2,4-D 2 mg/l ở giống<br /> Suphanbury 7 (bảng 1). Tiếp tục nuôi cấy<br /> khoảng 1,5 tháng, mô sẹo phát triển thành các<br /> khối mô chắc, có bề mặt căng láng (hình 6).<br /> <br /> 173<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả tạo mô sẹo của giống VN84 4137 và giống Suphanbury 7 trên môi trường MS có<br /> bổ sung nồng độ 2,4-D khác nhau<br /> Công thức<br /> thí nghiệm<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> <br /> 2,4-D (mg/l)<br /> 0<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> <br /> Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo<br /> ở giống VN84 4137 (%)<br /> 0a<br /> 40 b<br /> 76,67 c<br /> 93,33 d<br /> 63,33 e<br /> <br /> Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo ở<br /> giống Suphanbury 7 (%)<br /> 0 a<br /> 76,66 bd<br /> 96,67 c<br /> 80 bd<br /> 66,67 bde<br /> <br /> Các giá trị trung bình không theo cùng nhóm có mẫu chữ giống nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở<br /> mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê LSD.<br /> <br /> Giống VN84 4137<br /> <br /> Giống Suphanbury 7<br /> <br /> Hình 5. Khối mô sẹo phát sinh từ mô lá non mía sau<br /> khoảng 20 ngày nuôi cấy<br /> Các khối mô này được mang đi tái sinh trên<br /> môi trường MS có bổ sung các tổ hợp chất điều<br /> hòa sinh trưởng BAP và NAA khác nhau. Sau 1<br /> tuần, chồi có dấu hiệu hình thành. Số liệu được<br /> lấy ở các công thức đạt tỷ lệ tạo chồi tuyệt đối<br /> sau 21 ngày.<br /> Kết quả kiểm tra ở ngày 21 cho thấy, ở<br /> <br /> Hình 6. Mô sẹo phát triển hình thành<br /> các khối tế bào có khả năng tái sinh<br /> <br /> công thức gồm tổ hợp NAA 1 mg/l và BAP 2<br /> mg/l có 100% mẫu tạo chồi ở cả hai giống mía,<br /> số lượng chồi trên mẫu nhiều, chồi có hình dạng<br /> bình thường. Các công thức khác cũng hình<br /> thành chồi nhưng chậm hơn, số lượng ít hơn và<br /> các chồi có hình dạng không đồng đều trên cùng<br /> khối mô hoặc dị dạng (bảng 2, hình 7).<br /> <br /> Bảng 2. Kết quả tái sinh chồi của giống mía VN84 4137 và giống Suphanbury 7 trên môi trường<br /> MS có bổ sung các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA khác nhau<br /> Công<br /> Tỷ lệ mô sẹo hình thành chồi<br /> Tỷ lệ mô sẹo hình thành chồi trên<br /> BAP<br /> NAA<br /> thức<br /> trên một nghiệm thức ở giống<br /> một nghiệm thức ở giống<br /> (mg/l) (mg/l)<br /> TN<br /> VN84 4137 (%)<br /> Suphanbury 7 (%)<br /> 1<br /> 0<br /> 0<br /> 13,33 a<br /> 0 a<br /> 2<br /> 1<br /> 0,2<br /> 80,00 cd<br /> 60,00 c<br /> 3<br /> 1<br /> 0,5<br /> 86,67 de<br /> 73,33 cd<br /> 4<br /> 1<br /> 1<br /> 53,33 b<br /> 40,00 b<br /> 5<br /> 2<br /> 0,2<br /> 80,00 cd<br /> 80,00 d<br /> 6<br /> 2<br /> 0,5<br /> 66,67 bc<br /> 86,67 de<br /> 7<br /> 2<br /> 1<br /> 100 e<br /> 100 e<br /> Các giá trị trung bình không theo cùng nhóm có mẫu chữ giống nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở<br /> mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê Duncan.<br /> <br /> 174<br /> <br />