ĐỀ TÀI: CẢI TIẾN SẢN LƯỢNG CEPHALOSPORIN C BẰNG ADN TÁI TỔ HỢP ĐƯỢC HỢP NHẤT TRONG ACREMONIUM CHRYSOGENUM

CHUYÊN Đ :Ề

«C I TI N S N L Ế Ả ƯỢ B NG ADN TÁI T H P Đ

NG CEPHALOSPORIN C C H P NH T

Ổ Ợ ƯỢ Ợ

Ả Ấ Ằ TRONG ACREMONIUM CHRYSOGENUM»

Giáo viên h

ướ

ng d n: ẫ

Nguy n Th Minh H ng ị

ễ

ằ

Nhóm sinh viên th c hi n: Nguy n Th Kim Liên ệ

ự

ễ

ị

Nguy n Th Huy n

ễ

ề

ị

C n Đ Tu n

ỗ ầ

ấ

Hoàng Ti n Quyên ế

Tr n Đ c Tài

ứ

ầ

«C I TI N S N L Ế

Ả

Ả ƯỢ

Ổ Ợ

Ằ

C H P NH T TRONG ACREMONIUM CHRYSOGENUM»

Đ

NG CEPHALOSPORIN C B NG ADN TÁI T H P Ấ

ƯỢ Ợ

ng pháp

ươ

1. Đ t v n đ ề ặ ấ 2. T ng quan ổ 3. N i dung và ph ộ 4. K t lu n ậ ế

Kháng sinh là m t nhóm thu c đ

I. Đ T V N Đ Ặ Ấ Ề

ộ

ọ

ổ ế

ễ

ề ậ

c s ố ượ ử d ng ph bi n trong y h c đi u tr các ị ụ b nh viêm nhi m do vi sinh v t gây ra. ệ β- c s ợ ượ ử

ộ ổ

ệ

ề

ệ

ủ nhiên tuy v y năng su t ch a cao.

Cephalosporin C (CPC) thu c nhóm lactam, là kháng sinh bán t ng h p đ d ng r ng rãi hi n nay. ộ ụ c s n xu t b ng quy trình lên men CPC đ ấ ằ ượ ả truy n th ng trên quy mô công nghi p nh ờ ố ố Acremonium chrysogenum ch ng n m m c ấ t ậ ự

ư

ấ

Áp d ng các kĩ thu t di truy n đã c i thi n

ụ

ề

ệ

ả ả

ủ

ế

ng cao.

ậ quy trình tìm ki m các ch ng cho s n l ượ ừ

T đó cho phép t o ra ch ng n m ạ

ủ

ấ

ổ

Acremonium chrysogenum mang ADN tái t h p cho s n l ợ quy trình s n xu t.

Các gen đ

c h p nh t trong ch ng

ng kháng sinh cao trong ả ượ ấ ả ượ ợ

ủ

ng sinh t ng h p CPC:

ườ

ọ

ổ

ợ

ấ Acremonium chrysogenum là các gen quan tr ng trong con đ cefEF, cefG ,vgb

1. S l ơ ượ ề ự 2. N m m c ấ

II. T NG QUAN Ổ

c v s phát hi n kháng sinh ệ ố Acremonium

3. Con đ

ng sinh t ng h p CPC

chrysogenum ườ

ổ

ợ

S L C V S PHÁT HI N KHÁNG Ơ ƯỢ Ề Ự Ệ

SINH

ng kìm hãm kh năng gây

ả

ẩ Bacillus anthracis

Hi n t ệ ượ b nh c a vi khu n ủ ệ (Pasteur và Joubert, 1877)

ề

1 ch ph m tách t ế ẩ ị

ệ

ẩ

ồ

n m m c dùng đ ể ố ừ ấ đi u tr các b nh truy n nhi m trên da ễ ề do c u khu n gây ra (Gratia và đ ng nghi p, 1925)

ầ ệ

S L C V S PHÁT HI N KHÁNG Ơ ƯỢ Ề Ự Ệ

SINH

t ch t kháng

1929, Fleming mô t

ế

ể ề

ng v i s l

chi ti ả ề Trong chi n tranh th gi ế ớ ế c dùng đ đi u tr b nh cho i b th ng ườ ị ươ

ấ sinh trong báo cáo v Penicillin. i th II, kháng ứ ị ệ ớ ố ượ

sinh đ ượ nh ng ng ữ l n.ớ

ậ

ấ ằ

Các nhà khoa h c nh n th y r ng ọ ả ự

ậ

ỉ

ả

ậ

không ch các vi sinh v t mà c th c v t, đ ng v t cũng có kh năng sinh ộ ậ kháng sinh.

S L C V S PHÁT HI N KHÁNG Ơ ƯỢ Ề Ự Ệ

T th c t

SINH

đó, Glasby(1976) đã đ a ra đ nh ừ ự ế ư ị

ề ấ

ợ

ấ ộ ấ ượ ổ ế ố

Trong s đó thì kháng sinh nhóm β-lactam

n ng đ th p”. nghĩa v ch t kháng sinh: “ M t ch t kháng sinh là m t h p ch t đ ộ ợ ta t c a vi sinh v t ngay ủ c t ng h p c th s ng và c ch quá trình s ng ứ ở ồ ừ ơ ể ố ậ ộ ấ

ố

đ ượ ử ụ ổ ế ề ấ

c s d ng nhi u và ph bi n nh t. Các Cephalosporin C là kháng sinh bán t ng ổ

ộ ệ

ượ ẩ ộ

h p thu c nhóm β-lactam hi n đang đ c ợ s d ng r ng rãi vì ph kháng khu n r ng ổ ộ ử ụ và ít đ c v i con ng i. ườ ộ ớ

S L C V KHÁNG SINH Ơ ƯỢ Ề

ế ệ

ề

ử ụ ế ệ Ch ng vi n m đ ấ

ủ

Cephalosporin C g m các th h 1,2,3,4. ồ Trong đó s d ng nhi u là CPC th h ế ệ c s d ng h n ch . 1,2,3 còn th h 4 đ ế ạ ượ ử ụ c s d ng đ s n xu t ấ ể ả ượ ử ụ Acremonium CPC trong công nghi p là ệ chrysogenum (Cephalosporium acremonium).

N M M C Ố ACREMONIUM Ấ

Acremonium chrysogenum đ

ượ

c dùng ch y u đ ể

ủ ế

ấ

CHRYSOGENUM.

s n xu t CPC trên quy mô công nghi p. ệ ả Cephalosporium là m t chi thu c n m b t ộ ấ ộ toàn (Deuteromycetes).

Căn c vào đ c đi m c a sinh s n h u tính,

ấ

ả ữ ể ứ

ấ ấ ủ ộ

Emericellopis Ascomycetes).Chi này còn ấ

ặ th y đó là các n m thu c chi trong chi n m túi ( có tên khác là Peyronellula ho cặ Saturnomycetes.

N M M C Ố ACREMONIUM Ấ

CHRYSOGENUM

ặ ủ ế ủ Acremonium

ng t ng h p ho c môi tr ườ ng th ch – ạ ườ ặ ợ

ỏ ẫ ể ắ

Đ c đi m ch y u c a ể chrysogenum:  Khu n l c có hình d ng khác nhau trên môi ạ ẩ ạ tr ổ glucose – khoai tây. ẩ ạ Cephalosporium sp. Màu s c c a khu n l c ắ ủ có th là màu đ nh t, đ th m tr ng, màu tro ạ ỏ ho c màu vàng. ặ

N M M C Ố ACREMONIUM Ấ

CHRYSOGENUM

ưở

Khu n l c khá ch t, sinh tr ng nhanh ặ ẩ ạ ng th ch – glucose – khoai trên môi tr ạ ườ tây, ban đ u màu tr ng sau chuy n d n ắ ầ sang đ nh t. ỏ

ể ầ

ạ

ẩ ạ

ườ ạ ế ặ

Khu n ty khí sinh d ng nhung hay d ng ạ i thành t ng bó, ng b n l lông nhung th ừ ệ ạ có n p nhăn d ng phóng x ho c không. ạ M t sau c a khu n l c có màu vàng ẩ ạ ặ nh t.ạ

ủ

N M M C Ố ACREMONIUM Ấ

Các bào t

CHRYSOGENUM

ố ấ

ố

tr n t ử ầ ụ ạ ặ ướ ẳ ắ

ạ ầ

i thành kh i ch t l c thì tan ra. Cu ng bào nhày, khi g p n t tr n ng n, th ng, không phân nhánh, ử ầ không có vách ngăn, d ng g n tròn, hình tr ng ho c oval. ặ ứ

MÔI TR

NG NUÔI C Y Đ

C S D NG:

ƯỜ

Ấ ƯỢ Ử Ụ

ng YPS (%):

ườ

4 15 1

Thành ph n c a môi tr ầ ủ Cao n m men: ấ Tinh b t:ộ KH2PO4: MgSO4.7H2O: 0,5 15 Th ch:ạ pH = 7 (Theo USP 3,929,577 – 1975)

ng th ch – glucose – ườ ạ

300

Thành ph n môi tr ầ khoai tây (g/l): Khoai tây: Glucose: 20 15 Th ch:ạ pH = 6 – 7 (Theo môi tr ng s 30,JCM) ườ ố

CON Đ

NG SINH T NG H P CPC

ƯỜ

Ợ

Ổ

III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.

1. T o ch ng Acremonium chrysogenum h p. ổ ợ ấ

3.

ạ

ố ư ệ

ủ mang ADN tái t . Quy trình s n xu t CPC ả . T i u hóa đi u ki n lên men ch ng ề A.chrysogenum mang gen tái t ủ h p ổ ợ

Ủ Ạ

B

T O CH NG ACREMONIUM CHRYSOGENUM MANG ADN TÁI T H P Ổ Ợ

ổ khu n ty ẩ ố ừ

Acremonium chrysogenum b ng ằ t ADN ng pháp tách chi

c 1ướ : Tách ADN t ng s t c a n m ủ ấ ph ế ươ c 2ướ : Nhân dòng cefEF, cefG b ng kĩ B ằ

B

thu t PCR ậ

c 3ướ : T o ch ng ạ

chrysogenum tái t ủ Acremonium h p ổ ợ

c 4: Ki m tra các ch ng bi n n p ế ạ

B ủ ể ướ b ng kĩ thu t lai Southern ậ ằ

Phân lập, tuyển chọn

↓

Bảo quản và hoạt hóa giống

↓

Lên men sản xuất

↓

Tách chiết và tinh sạch

↓

Thu sản phẩm

QUY TRÌNH S N XU T CPC Ả Ấ

1. PHÂN L P VÀ TUY N CH N CH NG GI NG

Ọ

Ố

Ủ

Ậ

Ể

đ t, n

c, bùn.

ướ

ẫ ừ ấ

Thu nh n m u t ậ Sử dụng YPS và môi trường thạch – glucose  – khoai tây được bổ sung Cephalosporin C  (CPC) nhằm ức chế các chủng nấm và vi  khuẩn khác không có khả năng kháng lại  kháng sinh này.

Môi trường có mọc khuẩn lạc nấm mốc dạng

Cephalosporium được tách ra

Kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp cục  thạch và nghiên cứu đặc điểm sinh học của  các chủng có hoạt tính

2.BẢO QUẢN VÀ HOẠT HÓA GIỐNG

Giống được bảo quản trong glycerin vô  trùng, và có thể dung ngay trong ống  nghiệm bảo quản để nhân giống gốc  trong sản xuất CPC bằng chủng này. Để bảo quản lâu dài sử dụng phương

Gi ng đ ố

pháp đông khô là tốt nhất. ạ ắ

c khi đ a vào môi c ho t hóa trên máy l c 3-4 ngày ư ướ

ượ (28oC, 200vòng) tr ng lên men. tr ườ

3. LÊN MEN S N XU T

Ả

Ấ

ế

Ti n hành lên men theo 2 pha:  Pha đầu: nuôi thu sinh khối trong 2 – 3  ngày, nhiệt độ: 20 – 300C, pH: 6,5 – 6,8  Pha sau: lên men thu sản phẩm, nhiệt  độ: 22 – 250C, pH thường thấp hơn pha  đầu do tạo ra ở các pha đầu là các acid,  thời gian lên men từ 5 – 7 ngày, chất phá  bọt thường được sử dụng: mỡ lợn, dầu  thực vật…

4. TÁCH CHI T VÀ TINH CH S N PH M

Ế Ả

Ẩ

Ế

Ệ

Ề

T I U HÓA ĐI U KI N LÊN MEN Ố Ư CH NG A.CHRYSOGENUM MANG GEN Ủ TÁI T H P Ổ Ợ môi tr

ườ

ế ố ồ

ồ

t nh t cho quá trình nhân gi ng ch ng

ấ

ủ

ượ

ệ :casein th y phân, các mu i amoni sunphat ơ

ố

i quá trình lên men

ố ấ ắ ạ ủ ụ

t t ố ớ

ợ

ổ

ng cũng là ngu n nit

ộ ậ ươ

ơ

ồ

ị

ố

ố

ng nh : Ph i đ m b o các y u t ư ả ả ả Ngu n Carbon: ngu n glucose và r đ ng là ngu n ỉ ườ ồ cacbon t ố ố ng sinh kh i hình thành sau 96h A.chrysogenum. L trong đi u ki n nuôi c y l c đ t 8,35-8,50mg/ml. ề Ngu n Nit ồ và amoni clorua có tác d ng t sinh t ng h p CPC. Ngoài ra còn có b t đ u t có giá tr cao, acid gluctamic: 19,46%, acid aspartic: 3,89%, cystein: 1,12%, gluxit:22-35,5% , 1 s vitamin và mu i khoáng.

trong 3ngày

28

oC, t c đ l c 230vòng/phút

 (NH4)2SO4: 8 g/l  sucrose :35g/l  glucose : 5g/l Methionin : 0,5 g/l CaCO3 :5 g/l  Bean oli :10 g/l PH = 6,5. Ủ

ở

ố ộ ắ

MÔI TR NG NHÂN GI NG ƯỜ Ố

oC, t c đ l c 230vòng/phút

 + Cao ngô :100g/l  + Tinh b t :30 g/l ộ  + Dextrin : 60 g/l  + Glucose : 5 g/l  + Methionin : 6 g/l  + Urine : 3 g/l  + KH2PO4 : 9 g/l  + MgSO4 : 3 g/l  + (NH4)2SO4 : 13 g/l  + CaCO3 : 10 g/l ng : 10g/l  + Vi l ượ  + Bean oil : 20 g/l 25ở  Nuôi trong 7 ngày,

ố ộ ắ

MÔI TR NG LÊN MEN ƯỜ

Ngoài ra còn c n chú ý đ n các đi u ki n

ế ệ ề ầ

Th i gian nhân gi ng thích h p cho lên men

khác nh :ư

ợ ố ờ

CPC là 96h

Đ thông khí: do ộ

ộ ế

A.chrysogenum là sinh v t ậ ng môi tr ượ ấ ng trong ườ ể ợ

hi u khí b t bu c nên l ắ bình lên men thích h p nh t là 10% th tích bình lên men.

ượ ợ

B ng vi c các gen ệ

cefG, cefEF, vgb đ ắ

ợ ủ

ả ượ

c h p ể ủ A.chrysogenum ng c a sinh t ng h p c a CPC đã ổ

ằ nh t trong nhi m s c th c a ễ ấ mà s n l ủ tăng lên 86-116,3%. Vi c tìm th y đi u ki n lên men t ề

IV.K T LU N Ậ Ế

ố ư ệ

ệ ủ

i u cho ấ Acremonium chrysogenum mang h p cũng có vai trò r t l n trong ổ ợ ng pháp ả ấ ớ ươ ằ

ấ ch ng n m ADN tái t quy trình s n xu t CPC b ng ph ấ lên men chìm.

CPC đ

ề

ượ

ế ằ ằ

ng pháp lên ủ Acremonium

c đi u ch b ng ph ổ

ạ

ẩ

ấ

ể ả ị ữ ệ

ổ ể

ả

đó ừ

ợ

ổ

ớ

ươ men sinh t ng h p b ng ch ng ợ chrysogenum tuy nhiên ho t tính kháng khu n không cao b ng các CPC bán t ng ổ ằ h p. Đ s n xu t các CPC bán t ng h p có ợ ợ giá tr ch a b nh cao ph i chuy n hóa kháng sinh này thành “nhân” 7-ACA t bán t ng h p thành kháng sinh m i. ổ

ợ

ổ

ườ

ể ằ ng hóa h c. Quá trình đ

c mô t

qua

Quá trình sinh t ng h p CPC bán t ng h p ợ ng enzym và con ả ượ

ọ

có th b ng con đ đ ườ s đ sau: ơ ồ

K T LU N Ậ Ế