Cấu trúc siêu vi của tế bào gốc trung mô não giữa chuột cống trắng nuôi cấy

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> CẤU TRÚC SIÊU VI CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ NÃO GIỮA<br /> CHUỘT CỐNG TRẮNG NUÔI CẤY<br /> Nguyễn Thanh Hoa*; Nguyễn Thị Bình*<br /> Nguyễn Phúc Hoàn*; Nguyễn Mạnh Hà*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá cấu trúc siêu vi của tế bào gốc (TBG) trung mô não giữa chuột cống<br /> trắng trước và sau nuôi cấy. Đối tượng và phương pháp: phẫu tích lấy mô sàn não giữa phôi<br /> chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi, tạo thành dịch treo tế bào (TB) và nuôi cấy trong môi<br /> 0<br /> trường DMEM/F12 có bổ sung các yếu tố tăng trưởng, kháng sinh và kháng nấm trong tủ 37 C<br /> và 5% CO2. Sau 6 - 8 ngày nuôi cấy, các TB tăng sinh nhanh phủ kín phiến nuôi cấy. Làm tiêu<br /> bản hiển vi điện tử và quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét và xuyên. Kết quả: các nơ ron có<br /> cấu trúc siêu vi điển hình với đầy đủ bào quan trong bào tương. Các nhánh của nơ ron dài và<br /> tạo liên kết synap với các nơ ron khác. Kết luận: nuôi cấy làm tăng sinh và trưởng thành các TB<br /> của mô sàn não giữa.<br /> * Từ khóa: Sàn não giữa; Nuôi cấy tăng sinh; Biệt hoá; Cấu trúc siêu vi.<br /> <br /> Ultrastructure of Rat Embryonic Ventral Mesencephalic Precursor<br /> Cells in Culture<br /> Summary<br /> Objectives: To investigate ultrastructure of rat ventral mesencephalic precursor cells before<br /> and after culture. Subjects and methods: Dissected the ventral mesencephalon of rat embryos<br /> on day 12.5 - 13.5, then created cell suspension and expansion cultured in DMEM/F12 medium<br /> supplemented with growth factors, antibiotics, antifungal. After 6 - 8 days of culture, precursor<br /> cells proliferated quickly to completely cover culture disk. Samples were prepared and observed<br /> under the scanning and transmission electronmicroscope. Results: Neurons contained particular<br /> ultrastrutures with many organelles, elongated processes and synaptic contact with another<br /> neurons. Conclusion: Ventral midbrain precursor cells cultures were proliferative and differentiated<br /> into neurons after 6 - 8 days.<br /> * Keywords: Vetral mesencephalon; Proliferation; Differentiation; Ultrastruture.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Parkinson là một bệnh thoái hóa thần<br /> kinh phổ biến thứ hai sau bệnh Alzheimer,<br /> đặc trưng bởi sự thoái hóa các TB thần<br /> kinh tiết dopamin trên con đường thể vân -<br /> <br /> liềm đen ở não. Bệnh Parkinson có nhiều<br /> phương pháp điều trị. Hiện nay, việc ứng<br /> dụng công nghệ TBG vào điều trị là một<br /> phương pháp mang lại nhiều triển vọng<br /> mới cho bệnh Parkinson. Phương pháp<br /> này có nhiều ưu điểm vượt trội vì không chỉ<br /> 213<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> * Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Bình (nguyenthibinh_mp@yahoo.com.vn)<br /> Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/08/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017<br /> <br /> cải thiện được các triệu chứng lâm sàng<br /> của bệnh, mà còn làm ngừng tiến triển bệnh.<br /> Các TBG ngoại bì thần kinh bào thai khi<br /> ghép vào thể vân sẽ biệt hóa thành TB<br /> sản xuất dopamin, tạo ra các synap với<br /> TB thần kinh của người bệnh [3]. Các nơ<br /> ron tiết dopamin chỉ chiếm khoảng 1% tổng<br /> số nơ ron trong n o, nhưng đóng vai trò<br /> quan trọng trong nhiều chức năng của não<br /> như vận động tự chủ, giải phóng hormon<br /> thần kinh nội tiết, nhận thức, điều khiển<br /> hành vi cảm xúc, stress và trí nhớ. Khi số<br /> lượng các TB thần kinh này bị giảm sút sẽ<br /> dẫn đến nhiều rối loạn thần kinh nghiêm<br /> trọng, nổi bật nhất là bệnh Parkinson [4].<br /> Ở người, số lượng TB thần kinh tiết dopamin<br /> rất ít, chỉ khoảng 400.000.<br /> Ở động vật có vú, các TB tiết dopamin<br /> được phân chia thành 9 nhóm, nằm rải<br /> rác từ não giữa tới hành khứu. Theo<br /> Nguyễn Thanh Hoa và CS (2015), sàn<br /> não giữa phôi chuột cống trắng là nơi tập<br /> trung nhiều TB tiết dopamin [2]. Mỗi lần<br /> ghép để điều trị Parkinson cần tới 40.000<br /> TBG ngoại bì thần kinh não giữa và để có<br /> được số lượng TB này cần tới 4 não giữa<br /> phôi [5, 6]. Vì vậy, nuôi cấy để tăng sinh<br /> số lượng nơ ron nói chung và số lượng<br /> nơ ron tiết dopamin là cần thiết. Các TB<br /> của sàn não giữa sẽ thay đổi thế nào sau<br /> khi nuôi cấy in vitro?. Để trả lời câu hỏi này,<br /> chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm:<br /> - Nghiên cứu cấu trúc siêu vi của mô<br /> sàn não giữa phôi chuột cống trắng.<br /> - Nghiên cứu cấu trúc siêu vi của TB<br /> sàn não giữa phôi chuột cống trắng sau<br /> nuôi cấy in vitro.<br /> <br /> 180<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> - 10 mẫu mô sàn não giữa phôi chuột<br /> cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi.<br /> - 10 mẫu TBG trung mô sàn não giữa phôi<br /> chuột cống trắng sau nuôi cấy 6 - 8 ngày.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> - Tạo phôi chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi<br /> (20 phôi).<br /> - Phẫu tích lấy sàn não giữa (20 mảnh).<br /> - Dùng Dispase II , trypsin - EDTA và lực<br /> cơ học để tạo dịch treo TB (10 mẫu).<br /> - Nuôi cấy trong môi trường cơ bản:<br /> DMEM/F12 có bổ sung thêm các yếu tố<br /> tăng trưởng, kháng sinh, kháng nấm.<br /> - Cấy TBG ngoại bì thần kinh não giữa<br /> phôi chuột với mật độ 1,5 x 104 cm2 trên<br /> giếng nuôi cấy hoặc trong chai flask, trong<br /> tủ ấm 370C, 5% CO2.<br /> - Thay môi trường mỗi 2 ngày/lần, đồng<br /> thời đánh giá sự phát triển của TB bằng<br /> kính hiển vi soi nổi.<br /> - Các mảnh mô sàn não giữa và mẫu TB<br /> nuôi cấy được làm tiêu bản hiển vi điện tử:<br /> + Cố định bằng glutarandehyt 2,5%/<br /> cacodylate 0,1 M, pH 7,2 - 7,4 qua đêm<br /> ở 40C.<br /> + Rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate<br /> 0,1 M (15 phút/lần x 3 lần).<br /> + Cố định axít osmic 1%/cacodylate<br /> 0,1 M trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.<br /> + Rửa mẫu bằng cacodylate 0,1 M<br /> 15 phút x 3 lần.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> + Kính hiển vi điện tử xuyên: khử nước,<br /> đúc block, cắt lát mỏng 30 - 40 nm, nhuộm<br /> bằng uranyl acetate trong 10 phút và citrate<br /> chì trong 5 phút.<br /> + Kính hiển vi điện tử quét: khử nước, phủ<br /> vàng.<br /> <br /> - Chỉ tiêu nghiên cứu: hình thái siêu cấu<br /> trúc của TB và bào quan trước và sau nuôi<br /> cấy.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Cấu trúc siêu vi sàn não giữa phôi chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi.<br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> C<br /> <br /> D<br /> <br /> Hình 1: Sàn não giữa phôi chuột cống trắng 12,5 -13,5 ngày tuổi.<br /> (Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), đám glycogen (Gl), bộ golgi (Gol), nhân TB (Nu))<br /> Các TB nằm sát nhau dạng biểu mô (hình 1A). Tỷ lệ nhân/bào tương của TB cao.<br /> Trong bào tương của TB, số lượng bào quan và chất vùi tăng r rệt: lưới nội bào có<br /> hạt dài, lòng rộng, mặt ngoài ít ribosom bám; ty thể nhiều và đa dạng; bộ golgi điển<br /> hình; glycogen tập trung thành những đám khá lớn (hình 1B, C). Một số TB có hình<br /> thái của TBG với nhân lớn, trong bào tương ít bào quan (hình 1D).<br /> <br /> 215<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> Hình 2: Các nhánh bào tương của nơ ron sàn n o giữa phôi chuột cống trắng<br /> 12,5 - 13,5 ngày tuổi.<br /> (Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), nhánh bào tương (*))<br /> Các TB biệt hóa thành nơ ron có nhánh bào tương. Trong các nhánh có nhiều tơ<br /> thần kinh và một số bào quan như lưới nội bào có hạt và ty thể. Một số nhánh bào<br /> tương có phần tận cùng phình to và tiếp xúc với TB khác. Tuy nhiên, chưa quan sát<br /> thấy hình ảnh tạo synap giữa các TB (hình 2A, B, C).<br /> 2. Siêu cấu trúc của TB sàn não giữa chuột cống trắng sau nuôi cấy 6 - 8 ngày.<br /> <br /> 216<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> Hình 3: TB mô sàn não giữa nuôi cấy 6 ngày.<br /> (A: liên kết giữa các nơ ron; B: các nhánh bào tương (*); C: nón tăng trưởng (*);<br /> D: synap giữa các nơ ron; E: bào tương của nơ ron; F: nguyên bào thần kinh;<br /> Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), nhân TB (Nu))<br /> Các nơ ron liên kết với nhau chằng chịt nguyên bào thần kinh đệm nằm ở lớp áo.<br /> (hình 3A). Nhánh bào tương của nơ ron Các TBG ngoại bì thần kinh ở não giữa<br /> rất nhiều và rất dài (hình 3B). Đầu của các bắt đầu phát triển, tăng sinh và biệt hóa<br /> nhánh phình to, tiếp xúc với nơ ron khác bằng sự xuất hiện TB thần kinh xuyên<br /> (hình 3C). Nhiều chỗ đ hình thành các tâm. Nhiều nghiên cứu cho thấy: chính<br /> synap với cấu trúc điển hình (hình 3D). những TB này biệt hóa thành nơ ron tiết<br /> dopamin sau này [7, 8, 9]. Ở thời điểm<br /> Trong bào tương, lưới nội bào có hạt<br /> phôi 12,5 - 13,5 ngày tuổi, trong sàn não<br /> phát triển, thành có nhiều ribosom bám<br /> giữa các TB đứng sát nhau. Trong bào<br /> (hình 3E). Một số TB còn giữ tính gốc với<br /> tương TB, bào quan như lưới nội bào,<br /> biểu hiện nhân to, bào tương ít bào quan ty thể, bộ golgi phát triển. Xen giữa các<br /> (hình 3F).<br /> TB có nhánh bào tương trong có xơ thần<br /> kinh. Theo Sturrock R.R (1982), đây là những<br /> BÀN LUẬN<br /> nhánh bào tương của TB thần kinh đệm<br /> Trong quá trình phát triển phôi thai, khi hoặc là một giai đoạn phát triển sợi trục<br /> máng thần kinh mới khép thành ống thần của nơ ron [10]. Có những nhánh bào<br /> kinh là biểu mô gồm một hàng TB gọi là tương có đầu tận cùng phình to và tiếp<br /> biểu mô thần kinh. Ở não giữa, thành não xúc với nhánh hoặc thân TB khác. Đây<br /> dày lên do tăng sinh mạnh các TB biểu chính là hình ảnh của nón tăng trưởng.<br /> mô làm thành ống có dạng biểu mô trụ Điều này chứng tỏ, ở sàn não giữa phôi<br /> giả tầng, gồm 2 loại TB là nguyên bào chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi các TB đ<br /> xốp và nguyên bào thần kinh. Các nguyên di cư. Tuy nhiên, khi quan sát dưới kính<br /> bào thần kinh sẽ di cư ra vùng ngoại vi hiển vi điện tử, chúng tôi chưa thấy tạo<br /> của thành ống thần kinh. Sự di cư, biệt synap giữa các TB trong thành não giữa,<br /> hóa của những TB này chia thành ống như vậy quá trình biệt hóa thành các nơ ron<br /> thành 3 lớp: lớp nội tủy, lớp áo và lớp chưa kết thúc.<br /> màn rìa. Những nguyên bào thần kinh và<br /> 217<br /> <br />