intTypePromotion=1

Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase trong Escherichia coli bl21(de3) từ vi khuẩn Bacillus

Chia sẻ: NI NI | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

0
40
lượt xem
0
download

Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase trong Escherichia coli bl21(de3) từ vi khuẩn Bacillus

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết tập trung vào việc nâng cao năng suất và hoạt tính keratinase thông qua nhân bản gen và biểu hiện keratinase tái tổ hợp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nhân đoạn gen mã hóa keratinase bằng phản ứng PCR từ 2 chủng vi khuẩn B. licheniformis và B. subtilis, chọn dòng trong hệ vector pET và biểu hiện trong vi khuẩn E. coli.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase trong Escherichia coli bl21(de3) từ vi khuẩn Bacillus

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57<br /> <br /> CHỌN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN KERATINASE<br /> TRONG ESCHERICHIA COLI BL21(DE3) TỪ VI KHUẨN BACILLUS<br /> Nguyễn Thu Hiền1, Hoàng Thị Thu Hiền1, Khuất Hữu Thanh2, Nguyễn Huy Hoàng1*<br /> 1<br /> <br /> Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *nhhoang@igr.ac.vn<br /> 2<br /> Trường Đại học Bách khoa Hà Nội<br /> <br /> TÓM TẮT: Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis là hai chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân lông<br /> vũ cao. Protein keratinase từ hai chủng này đã được nghiên cứu khá phổ biến, đây là nhóm enzyme thương<br /> mại, có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá trình công nghệ sinh học<br /> liên quan đến chất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệp gia cầm và công nghệ da. Mặt khác, keratin<br /> sau khi bị thủy phân có thể làm thức ăn chăn nuôi, phân bón, keo, tạo ra được các axit amin hiếm như<br /> serine, cystein và proline và góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Nhằm mục đích thu được lượng<br /> enzyme có hoạt tính cao, chúng tôi tiến hành biểu hiện gen keratinase tái tổ hợp từ B. licheniformis và<br /> B. subtilis trong Escherichia coli. Gen Ker 1 từ chủng B. licheniformis HT10 được tích hợp vào vector<br /> pET22b và gen Ker 2 từ B. subtilis Đ.nđ1.2 được tích hợp vào vector pET32a. Trong cùng điều kiện biểu<br /> hiện ở 37oC, cảm ứng IPTG nồng độ 1mM, hai protein thu được có kích thước và hoạt độ enzyme khác<br /> nhau lần lượt là 28 kDa, 23,5 U/ml và 36 kDa, 18,5 U/ml.<br /> Từ khóa: Bacillus lichenniformis, Bacillus subtilis, E. coli, biểu hiện gen, keratinase.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Keratin là thành phần chủ yếu trong lông<br /> vũ, là protein cấu trúc sợi, giàu liên kết<br /> disulfide, hydro và các đầu tương tác kị nước<br /> dẫn đến độ bền cơ học cao. Theo Lin et al.<br /> (2009) [6], keratin không hòa tan trong nước và<br /> không phân hủy bởi các enzyme phân giải<br /> protein phổ biến như trypsin, pepsin và papain.<br /> Nhưng keratin có thể bị phân hủy bởi các vi<br /> sinh vật có khả năng sinh keratinase cao.<br /> Hiện nay, keratinase được thu từ nhiều<br /> nguồn khác nhau như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn.<br /> Trong nhóm vi khuẩn có khả năng sinh<br /> keratinase, hoạt tính keratinase cao đã được ghi<br /> nhận rộng rãi đối với các chủng từ Bacillus.<br /> Keratinase có đặc tính sinh hóa rất đa dạng khi<br /> được thu từ các nguồn khác nhau. Mặc dù chỉ<br /> phân lập trong phạm vi hai chủng vi khuẩn B.<br /> licheniformis và B. subtilis nhưng cũng cho ta<br /> thấy sự đa dạng của keratinase. Đối với B.<br /> licheniformis, theo nghiên cứu của Lin et al.<br /> (1992) [7], keratinase có khối lượng phân tử 33<br /> kDa, pH tối ưu đã được xác định 7.5, nhiệt độ<br /> tối ưu là 50°C và ổn định khi bảo quản ở -20°C.<br /> Đối với chủng B. subtilis, keratinase có khối<br /> lượng phân tử là 25,4 kDa, pH tối ưu là 7,5 và<br /> nhiệt độ tối ưu là 70°C theo công bố của Gupta<br /> & Ramnani (2006) [2]. Nhiều nghiên cứu ghi<br /> <br /> nhận rằng keratinase được phân lập từ chủng<br /> B. licheniformis và B. subtilis, là thành viên của<br /> nhóm protease serine, điều này đã được đề cập<br /> đến trong công bố của Brandelli (2008) [1]. Đây<br /> là nhóm enzyme thương mại, có nhiều ứng dụng<br /> quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong<br /> các quá trình công nghệ sinh học liên quan đến<br /> chất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệp<br /> gia cầm và công nghệ da. Mặt khác keratin sau<br /> khi bị thủy phân có thể làm thức ăn chăn nuôi,<br /> phân bón, keo, tạo ra các axit amin hiếm như<br /> serine, cystein và proline, làm giảm ô nhiễm<br /> môi trường [9].<br /> Do tầm quan trọng của keratinase trong các<br /> ngành công nghiệp, keratinase đã được nghiên<br /> cứu khá nhiều. Nhưng để đáp ứng nhu cầu ngày<br /> càng tăng của keratinase trong ứng dụng công<br /> nghiệp, những nghiên cứu tập trung vào việc<br /> nâng cao năng suất và hoạt tính keratinase<br /> thông qua nhân bản gen và biểu hiện keratinase<br /> tái tổ hợp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nhân<br /> đoạn gen mã hóa keratinase bằng phản ứng PCR<br /> từ 2 chủng vi khuẩn B. licheniformis và B.<br /> subtilis, chọn dòng trong hệ vector pET và biểu<br /> hiện trong vi khuẩn E. coli.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> 51<br /> <br /> Nguyen Thu Hien, Hoang Thi Thu Hien, Khuat Huu Thanh, Nguyen Huy Hoang<br /> <br /> B. licheniformis HT10, B. subtilis Đnđ1.2<br /> (mã số FN692035.1) đã được phân lập từ vùng<br /> đất chăn nuôi và giết mổ gia cầm tại Hà Nội đã<br /> được công bố bởi Nguyễn Huy Hoàng và nnk.<br /> (2010) [4].<br /> Phương pháp<br /> Chọn dòng gen keratinase<br /> Khuếch đại đoạn gen Ker<br /> <br /> Trình tự mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn<br /> gen Ker được thiết kế bằng cách phân tích độ<br /> tương đồng nucleotide từ đoạn gen keratinase<br /> của chủng B. subtillis và B. licheniformis đã<br /> được đăng kí trên Gen Bank (bảng 1). Theo<br /> phương pháp của Nguyễn Thị Minh và nnk.<br /> (2011) [8], đoạn mồi được gắn thêm trình tự các<br /> enzyme giới hạn để khuếch đại được đoạn gen<br /> Ker từ điểm khởi đầu đến điểm kết thúc.<br /> <br /> Bảng 1. Trình tự các cặp mồi<br /> Chủng<br /> Mồi<br /> B. licheniformis ker-F1<br /> HT10 - Gen<br /> Ker1<br /> ker-R1<br /> B. subtilis<br /> Đnđ1.2 - Gen<br /> Ker2<br /> <br /> ker-F2<br /> ker-R2<br /> <br /> Trình tự mồi (chiều 5’ đến 3’)<br /> 5’-TCCATGGATGATGAGGAAAAAGAGTTTTGGC-3’<br /> Nco I<br /> 5’-TGGATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCG-3’<br /> BamHI<br /> 5’-CGTGGGATCCAAAAAATTGTGGATCAGC-3’<br /> BamHI<br /> 5’-TTATTCTCGAGCTGCTTGTACGTTGAT-3’<br /> XhoI<br /> <br /> Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể<br /> tích là 50 µl bao gồm 1X Dream Taq Buffer, 10<br /> mmol/L dNTP, 10 pmol mỗi mồi, 100 ng DNA<br /> khuôn và 2U Dream Taq polymerase. Chu trình<br /> nhiệt: 95oC: 3 phút; (95oC: 1 phút; 60oC: 1 phút;<br /> 72oC: 3 phút) 30 chu kỳ; 72oC: 10 phút, giữ mẫu<br /> ở 4oC. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra<br /> trên gel agarose 0,8% và được tinh sạch bằng bộ<br /> kit GeneJETTM Gel Extration của Fermentas.<br /> Tách dòng phân tích trình tự gen Ker<br /> Sản phẩm gen Ker được khuếch đại từ phản<br /> ứng PCR sau khi tinh sạch được gắn vào vector<br /> chọn dòng. Gen Ker1 được gắn vào vector<br /> pCR2.1 (TA cloning Kit, Invitrogen). Gen Ker2<br /> được gắn vào vector pJET1.2/blunt (CloneJET™<br /> PCR Cloning Kit-Thermo Scientific). Các phản<br /> ứng được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản<br /> xuất. Tiến hành biến nạp sản phẩm ligase vào tế<br /> bào khả biến E. coli Top10 trên đĩa môi trường<br /> LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc để chọn lựa<br /> được tế bào mang vector tái tổ hợp. Để kiểm tra<br /> kết quả của phản ứng ligase, các khuẩn lạc được<br /> chọn lọc và tách plasmid sau đó được cắt kiểm<br /> tra bằng enzyme giới hạn.<br /> Biểu hiện gen keratinase trong vi khuẩn<br /> E. coli<br /> Thiết kế vector biểu hiện trong E. coli<br /> 52<br /> <br /> Xử lý vector pCR2.1-Ker1 và vector<br /> pET22b(+) bằng 2 enzyme NcoI và BamHI.<br /> Vector pJET1.2-Ker2 và pET32a(+) được xử lý<br /> bằng 2 enzyme BamHI và XhoI. Sản phẩm cắt<br /> sau khi tinh sạch được gắn vào vector tương<br /> ứng bằng enzyme T4 ligase ở 16oC, qua đêm.<br /> Biến nạp sản phẩm ligase vào tế bào khả biến<br /> E. coli Top 10. Thu nhận các khuẩn lạc mọc<br /> được trên đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh<br /> chọn lọc ampicillin nồng độ 100 µg/ml để tách<br /> plasmid. Cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới<br /> hạn để kiểm tra kích thước của đoạn gen và<br /> vector.<br /> Biểu hiện gen Ker1 và Ker2 tái tổ hợp<br /> Plasmid mang vector tái tổ hợp pET22bKer1 và pET32c-Ker2 được biến nạp vào tế bào<br /> khả biến E. coli BL21 bằng phương pháp sốc<br /> nhiệt. Khuẩn lạc sinh trưởng được trên môi<br /> trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc<br /> ampicillin nồng độ 100 µg/ml được lựa chọn.<br /> Nuôi cấy tế bào E. coli BL21 mang vector<br /> tái tổ hợp được nuôi trong 3 ml môi trường LB<br /> có bổ sung kháng sinh chọn lọc, qua đêm, điều<br /> kiện 200 vòng/phút, 37oC. Tiếp giống với tỉ lệ<br /> 1/50 thể tích trong 50 ml môi trường LB,<br /> ampicillin. IPTG nồng độ 1mM được bổ sung<br /> vào khi OD600nm dịch nuôi đạt 0,8. Sau 4 giờ<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57<br /> <br /> nuôi cấy, tế bào được thu sinh khối bằng<br /> phương pháp ly tâm. Cặn tế bào được hòa tan<br /> trong PBS pH 7 và bị xử lý bằng phương pháp<br /> siêu âm. Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong<br /> 10 phút ở 4oC để thu lại lượng protein hòa tan,<br /> điện di trên gel polyacrylamid 12% được biến<br /> tính ở 95oC trong 10 phút.<br /> Thử hoạt tính keratinase<br /> Hoạt tính của keratinase tái tổ hợp được đo<br /> theo phương pháp của Riffel et al. (2003) và<br /> Zhang et al. (2009) [11, 17]. Chủng E. coli<br /> BL21 (DE3) được lên men trong điều kiện ở<br /> 37oC, tốc độ lắc 220 vòng/phút và cảm ứng<br /> IPTG với nồng độ cuối cùng 1 mM, dừng lên<br /> men sau 4 giờ từ khi cảm ứng. Tế bào được thu<br /> bằng ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở<br /> 4oC; sinh khối được hòa tan bằng đệm PBS,<br /> siêu âm phá vỡ tế bào ở tần số 22Hz với chu kỳ<br /> 15 giây phá, dừng 10 giây trong thời gian 2 phút<br /> ở 2-4oC. Dịch sau siêu âm được ly tâm ở 12.000<br /> vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, được sử dụng<br /> như enzyme. Phản ứng enzyme, cơ chất diễn ra<br /> trong môi trường đệm glycine/NaOH ở 60°C,<br /> 15 phút. Kết quả được đo ở bước sóng 440 nm.<br /> Trong đó, cứ 0,01 giá trị hấp thụ ánh sáng ở<br /> bước sóng 440 nm tương ứng với 1U hoạt tính<br /> enzyme.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Nhân dòng gen keratinase từ chủng B.<br /> licheniformis HT10, B. subtilis Đnđ1.2<br /> Gen Ker1 đã được nhân lên từ DNA tổng số<br /> của chủng B. licheniformis HT10. Dựa trên<br /> trình tự gen ker mã hóa cho protease serin kiềm<br /> của các B. licheniformis được đăng kí trên<br /> GenBank có kích thước khoảng 1,2 kb (hình 1).<br /> Tương tự, đoạn gen Ker 2 cũng được nhân lên<br /> từ DNA tổng số của chủng B. subtillis Đ.nđ1.2.<br /> Đoạn gen Ker2 cũng có chiều dài khoảng 1,2<br /> kb. Kết quả PCR trên gel điện di cho thấy một<br /> đoạn băng đặc hiệu đúng theo kích thước mong<br /> đợi (hình 1).<br /> Sản phẩm PCR được tinh sạch và được gắn<br /> vào vector chọn dòng, Ker1 được gắn vào<br /> vector pCR2.1, Ker2 được gắn vào vector<br /> pJET1.2. Sau đó, toàn bộ sản phẩm ligase được<br /> biến nạp vào tế bào khả biến E. coli Top10.<br /> Trong quá trình sinh trưởng của E. coli, plasmid<br /> <br /> được nhân lên với số lượng lớn. Để chọn ra<br /> đúng các plasmid mang gen Ker, các dòng tế<br /> bào E. coli tái tổ hợp được chọn lọc trên môi<br /> trường có bổ sung kháng sinh và tách chiết<br /> plasmid để kiểm tra sự có mặt của gen ker trong<br /> plasmid. Các plasmid có kích thước cao hơn so<br /> với đối chứng là vector chọn dòng không mang<br /> gen được chọn và kiểm tra tiếp bằng phản ứng<br /> cắt enzyme. Plasmid Ker1-pCR21 được xử lý<br /> bằng hai enzyme NcoI và BamHI, Ker2-pJET12<br /> được xử lý bằng hai enzyme XhoI và BamHI.<br /> Kết quả điện cho thấy có một băng có kích<br /> thước đúng bằng kích thước của vector, băng<br /> còn lại có kích thước bằng kích thước của đoạn<br /> gen được chèn vào (không đưa hình ảnh).<br /> <br /> Hình 1. Sản phẩm PCR gen keratinase<br /> M. Thang DNA chuẩn; 1. Gen Ker1 từ chủng<br /> B. licheniformis HT10; 2. Gen Ker2 từ chủng<br /> B. subtillis Đ.nđ1.2.<br /> Phân tích trình tự gen Ker1, Ker2<br /> Gen Ker1, Ker2 được tiến hành giải trình tự<br /> gen và được phân tích trên phần mềm BioEdit.<br /> Toàn bộ trình tự gen Ker1 dài 1146 bp mã hóa<br /> cho protein gồm 381 axit amin. Khi so sánh các<br /> trình tự nucleotid của gen Ker1 của chủng B.<br /> licheniformis HT10 với các trình tự của các gen<br /> keratinase khác được tách ra từ các chủng vi<br /> khuẩn B. licheniformis đăng kí trên GenBank,<br /> trình tự nucleotid của keratin từ chủng B.<br /> licheniformis HT10 có độ tương đồng cao về<br /> trình tự nucleotid (97-99%). Đặc biệt, nucleotid<br /> của gen keratinase trong nghiên cứu có độ<br /> tương đồng tới 99,56% với trình tự của gen<br /> keratinase có mã số truy cập QG339614.<br /> Đoạn gen Ker2 có chiều dài 1138 bp, mã<br /> hóa 378 axit amin. Kết quả so sánh trên Gen<br /> Bank, trình tự Ker 2 có độ tương đồng cao với<br /> 53<br /> <br /> Nguyen Thu Hien, Hoang Thi Thu Hien, Khuat Huu Thanh, Nguyen Huy Hoang<br /> <br /> nhiều gen keratinase từ các chủng B. subtilis<br /> khác được công bố. Ker2 có độ tương đồng đến<br /> 99% với gen keratinase chủng B. subtilis strain<br /> YYW-1KerC có mã số truy cập EU362730.<br /> Từ các kết quả so sánh về trình tự nucleotid<br /> và trình tự acid amin có thể thấy, gen Ker1<br /> chúng tôi phân lập được từ chủng B.<br /> licheniformis HT10 và gen Ker2 từ chủng<br /> Đ.nđ1.2 là gen mã hóa cho keratinase thuộc<br /> nhóm subtilisin.<br /> Thiết kế vector biểu hiện trong E.coli BL21<br /> (DE3)<br /> <br /> Hình 2. Cắt kiểm tra sản phẩm tái tổ hợp bằng<br /> enzyme cắt giới hạn<br /> 1. Thang DNA chuẩn; 2. Ker2-pET32 được xử<br /> lý bằng XhoI và BamHI; 3. Thang DNA chuẩn;<br /> 4. Ker1-pET22 được xử lý bằng NcoI và BamHI<br /> Gen Ker1 được thu hồi từ sản phẩm lai tách<br /> dòng Ker1- pCR2.1 bằng 2 enzyme cắt giới hạn<br /> NcoI và BamHI, sản phẩm lai Ker2-pJET12<br /> được xử lý bằng XhoI và BamHI để thu nhận<br /> gen Ker2. Gắn gen Ker1 vào vector pET22b và<br /> gen Ker2 vào pET32a tại hai vị trí cắt tương<br /> ứng để tạo vector biểu hiện trong E. coli. Phản<br /> ứng ghép nối được thực hiện ở 16oC qua đêm.<br /> Trong vector biểu hiện này, vùng nhân bản có<br /> sẵn điểm His•Tag® và S•Tag™ phục vụ cho<br /> việc nhận biết và tinh sạch các protein. Sản<br /> phẩm lai được biến nạp vào tế bào khả biến E.<br /> coli BL21(DE3) và chọn lựa những dòng tế bào<br /> có kích thước plasmid lớn hơn pET22b và<br /> pET32a. Xử lý đồng thời các dòng plasmid này<br /> với enzyme giới hạn tương ứng để chọn lựa<br /> chính xác dòng tế bào mang gen Ker1 và Ker 2<br /> (hình 2).<br /> 54<br /> <br /> Kết quả điện chứng tỏ, vector tái tổ hợp<br /> pET 22b-Ker1 và pET32a-Ker2 đã được thiết kế<br /> và biến nạp thành công vào chủng E. coli BL21<br /> (DE3).<br /> Biểu hiện gen Ker1, Ker2 trong E. coli<br /> BL21(DE3)<br /> Trong nghiên cứu biểu hiện đã sử dụng<br /> chủng chủ là E. coli BL21(DE3), đây là chủng<br /> chứa đột biến Ion protease (protease nội bào) và<br /> ompT protease (protease màng ngoài tế bào). Vì<br /> vậy, E. coli BL21(DE3) có ưu điểm là hạn chế<br /> sự phân cắt của protease đối với protein ngoại<br /> lai, giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân hủy<br /> và ổn định hơn sau khi tổng hợp. Ngoài ra,<br /> DNA hệ gen của E. coli BL21(DE3) có chứa<br /> gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, có nguồn<br /> gốc từ bacteriophage T7. Gen này được đưa vào<br /> hệ gen của chủng E. coli BL21(DE3) và đặt<br /> dưới sự điều khiển của promoter lac. T7 RNA<br /> polymerase là enzyme hoạt động mạnh, có khả<br /> năng sao chép hoàn toàn bất kỳ trình tự DNA<br /> nào đặt dưới sự kiểm soát của T7 promoter .<br /> Protein tái tổ hợp trong E. coli có thể tồn tại<br /> ở dạng thể vùi hoặc thể hòa tan. Hai trong<br /> những yếu tố quan trọng nhất trong việc biểu<br /> hiện một protein ngoại lai trong E. coli là nhiệt<br /> độ và nồng độ IPTG. Các yếu tố khác như nếp<br /> gấp nội bào protein, hoạt động protease nội<br /> sinh, tốc độ sinh trưởng của tế bào cũng có thể<br /> ảnh hưởng đến mức độ biệu hiện, điều này đã<br /> được đề cập đến trong công bố của Sambrook &<br /> Michal (1989) [13]. Theo Lin et al. (2009) [6],<br /> các vấn đề như khả năng biểu hiện thấp hoặc sự<br /> hình thành thể vùi thường gây ra bởi yếu tố kị<br /> nước được quy định bởi trình tự amino acid<br /> mang tín hiệu kỵ nước đầu N của phân tử<br /> protein mới được tổng hợp. Để đạt được mức độ<br /> biểu hiện cao nhất, các dòng tế bào mang vector<br /> tái tổ hợp hợp pET 22b-Ker1 và pET32a-Ker2<br /> được nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ, nồng độ<br /> IPTG, thời gian biểu hiện khác nhau. Qua các<br /> kết quả nghiên cứu, chủng E. coli mang gen Ker<br /> tái tổ hợp biểu hiện tốt nhất ở điều kiện 200<br /> vòng/phút, 37oC, nồng độ IPTG 1mM. Protein<br /> ngoại lại được thu hồi sau 4 giờ cảm ứng và<br /> điện di trên gel SDS 12,5% (hình 3). Vì<br /> keratinase tái tổ hợp này có thể được thể hiện<br /> trong tế bào chất của vi khuẩn E. coli theo<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57<br /> <br /> nghiên cứu của Lin et al. (2009) [6], nên chúng<br /> tôi tập trung thu hồi protein ở dạng hòa tan. Kết<br /> quả điện di cho thấy, mẫu protein được cảm ứng<br /> xuất hiện một băng đậm hơn hẳn so với mẫu<br /> không cảm ứng (hình 3). Với dòng tế bào<br /> E. coli mang vector tái tổ hợp pET22b-Ker1,<br /> khi cảm ứng IPTG, protein tái tổ hợp được tổng<br /> hợp có kích thước khoảng 28 kDa (giếng 3).<br /> Dòng tế bào E. coli mang vector pET32a-Ker2<br /> tổng hợp được protein ngoại lai có kích thước<br /> khoảng 36 kDa (giếng 6).<br /> <br /> Hình 3. Điện di protein trên<br /> gel polyacrylamide -SDS ở nồng độ 12,5%<br /> Giếng 1: Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3)<br /> [pET22b]; Giếng 2: Thang protein chuẩn (14-116<br /> kDa); Giếng 3 Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3)<br /> [pET22b-Ker1] được cảm ứng bởi 1 mM IPTG;<br /> Giếng 4: Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3)<br /> [pET22b-Ker1] không cảm ứng IPTG; Giếng 5:<br /> Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3) [pET32a Ker2] không cảm ứng IPTG; Giếng 6: Protein tổng<br /> số từ E. coli BL21(DE3) [pET32a -Ker2] được cảm<br /> ứng bởi 1 mM IPTG.<br /> <br /> Theo các nghiên cứu về biểu hiện gen<br /> keratinase của Gupta & Ramnami (2006) [2],<br /> kích thước protein tạo ra có sự khác nhau tùy<br /> theo nguồn gốc của gen và hệ vector biểu hiện.<br /> Khối lượng phân tử của keratinase khoảng 18200 kDa, ngoại trừ một enzyme đặt biệt từ một<br /> loại nấm gây bệnh. Đối với gen keratinase từ<br /> chủng B. licheniformis, đã có nhiều nghiên cứu<br /> thành công trong việc biểu hiện gen này ở cả<br /> E. coli và tế bào nấm men Pichia đã được công<br /> bố bởi Radha & Gunasekaran (2009) và Hu et<br /> al. (2013) [10, 5]. Kích thước keratinase từ<br /> chủng B. licheniformis khoảng 33 kDa. Tuy<br /> nhiên, theo Hu et al. (2013) [5] khi biểu hiện<br /> gen này với vector pET30a và pET32a trong<br /> <br /> E. coli lại có kích thước 45 kDa và 55 kDa.<br /> Trong nghiên cứu Radha & Gunasekaran (2009)<br /> [10], khi biểu hiện gen này trong nấm men<br /> P. pastoris lại có kích thước khoảng 39 kDa.<br /> Gen keratinase được phân lập từ chủng<br /> B. licheniformis HT10, khi biểu hiện với vector<br /> pET22b trong E. coli, chỉ có kích thước khoảng<br /> 28 kDa, kích thước protein thu được nhỏ hơn<br /> nhiều so với các kích thước đã được công bố.<br /> Chủng B. subtilis là một trong những chủng vi<br /> khuẩn có khả năng thủy phân lông vũ cao nhất<br /> và là nguồn nguyên liệu gen keratinase rất phổ<br /> biến trong nghiên cứu. Kích thước của protein<br /> keratinase từ chủng này cũng có sự khác nhau<br /> trong các công bố trước đây của Suh & Lee<br /> (2001) [14] là 25,4 kDa, kích thước này nhỏ<br /> hơn kích thước 32 kDa được công bố bởi Tork<br /> et al. (2013) [16], nhưng cao hơn với kích thước<br /> 22 kDa đã được công bố bởi Nguyễn Văn Hiếu<br /> và nnk. (2010) [3]. Protein từ chủng B. subtilis<br /> Đ.nđ1.2 trong nghiên cứu của chúng tôi khi biểu<br /> hiện với vector pET32a trong E. coli lại có kích<br /> thước cao hơn, khoảng 36 kDa. Vì vậy, kích<br /> thước protein keratinase tái tổ hợp có sự chênh<br /> lệch có thể do hiện tượng cắt ngắn hoặc biến đổi<br /> trong quá trình hoàn chỉnh protein trước khi ra<br /> khỏi tế bào.<br /> Hoạt tính keratinase tái tổ hợp<br /> Hoạt độ keratinase của chủng E. coli tái tổ<br /> hợp được xác định bằng phản ứng thủy phân cơ<br /> chất azokeratin, đây là một cơ chất đặc hiệu<br /> được sử dụng để đo hoạt tính của enzyme<br /> keratinase và đã được Riffel et al. (2003) và<br /> Zhang et al. (2009) [12, 17] sử dụng. Trong<br /> phương pháp này một đơn vị hoạt động của<br /> enzyme được tính bằng lượng enzyme gây ra sự<br /> thay đổi hấp thụ của 0,01 giá trị OD ở bước<br /> sóng 440nm. Dịch enzyme được thu từ dịch sau<br /> sau biểu hiện của tế bào E. coli mang gen tái tổ<br /> hợp pET22(+)-ker1 và pET32(+)-ker2 được sử<br /> dụng như enzyme (bảng 2).<br /> So với nghiên cứu của Radha &<br /> Gunasekaran (2007) [9], Tiwary & Gupta<br /> (2010) [15] kết quả hoạt độ enzyme khá cao<br /> khoảng trên 70 U/ml, kết quả của chúng tôi có<br /> sự chênh lệch khá lớn. Các nghiên cứu về<br /> keratinase cho thấy, khả năng biểu hiện của gen<br /> này có thể bị ức chế bởi Cd2+, Cu2+, Hg2+, Ni2+,<br /> 55<br /> <br />
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2