Chương 2: KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Chia sẻ: Tulip_12 Tulip_12 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:208

Thêm vào BST

Báo xấu

222
lượt xem 63
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

.ƯU ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT Gồm 05 điểm nổi bật: - Nhân nhanh các giống cây: hệ số nhân giống cao. - Cây giống sau khi nuôi cấy có sự đồng nhất về mặt di truyền. - Loại sạch bệnh cây, đảm bảo các cây giống khỏe mạnh, có sức tăng trưởng nhanh. - Chủ động nguồn giống cây trồng cho sản

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Chương 2: KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Chương 2: KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
KHÁI NIỆM Nuôi cấy mô (tissue culture) là một nhánh của sinh học, trong đó, mô hay tế bào được nuôi cấy nhân tạo trong một môi trường có kiểm soát. Nhaân gioáng in vitro thực vật hay vi nhaân gioáng thực vật (micropropagation) laø phöông thöùc nuoâi caáy tế bào, cơ quan thực vật trong oáng nghieäm, bình nuôi cấy, ôû ñieàu kieän voâ truøng, nhằm mục đích nhaân nhanh giống, mang laïi hieäu quaû kinh teá cao.
ƯU ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT Gồm 05 điểm nổi bật: - Nhân nhanh các giống cây: hệ số nhân giống cao. - Cây giống sau khi nuôi cấy có sự đồng nhất về mặt di truyền. - Loại sạch bệnh cây, đảm bảo các cây giống khỏe mạnh, có sức tăng trưởng nhanh. - Chủ động nguồn giống cây trồng cho sản xuất. - Trẻ hóa vật liệu giống.
NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT Gồm 03 điểm nổi bật: - Hạn chế về chủng loại sản phẩm. - Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. - Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: đặc biệt là các biến dị di truyền.
Các yếu tố đảm bảo sự thành công trong nuôi cấy mô thực vật là gì? 2.1 Bảo đảm điều kiện vô trùng 2.2 Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách 2.3 Chọn mô cấy thích hợp, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy
2.1 BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG
Ý NGHĨA CỦA VÔ TRÙNG TRONG VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, là môi trường thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm chắc chắn phải loại bỏ.
Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy, đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu: - Vô trùng mô cấy. - Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy. - Trong thao tác nuôi cấy cần tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường.
VÔ TRÙNG MÔ CẤY Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, diệt khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập trên bề mặt mô cấy.
Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt nấm, diệt khuẩn có thể dùng để xử lý mô cấy: Tác nhân vô trùng Nồng độ (%)Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Hypochlorite canxi 5 – 30 Rất tốt Hypochlorite natri 2 Hydroperoxid (H2O2) 10 – 12 5 – 15 Tốt Nước Brom 1–2 2 – 10 Rất tốt 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình HgCl2 Chất kháng sinh 4 – 50 (mg/l) 30 – 60 Khá tốt
Lưu ý: Trong quá trình xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn. Với các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trước khi xử lý cần rửa sạch bằng xà phòng và nước máy. Sau khi xử lý xong, mô cấy được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng và loại bỏ những phần bị hoại tử trước khi đặt mô cấy lên môi trường.
Quy trình khử trùng mẫu thực sinh: Mẫu thực sinh Rửa kĩ bằng xà phòng và nước máy Cho vào bình tam giác Ngâm trong cồn 700C (khoảng 30 giây) Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần Tiếp tục ngâm trong dung dịch diệt khuẩn (khoảng 15 - 20 phút) với 05 giọt Tween 80 Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm hoại tử (trắng) Đặt lên môi trường nuôi cấy
VÔ TRÙNG DỤNG CỤ THỦY TINH, MÔI TRƯỜNG VÀ NÚT ĐẬY Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy của chai lọ hay dụng cụ thủy tinh được vô trùng bằng cách hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm trong thời gian 15 – 20 phút.
oC oF Taùc ñoäng ñeán vi sinh vaät 121 250 Nhieät hôi nöôùc tieâu dieät hoaøn toaøn vi sinh vaät vaø baøo töû (15 – 20 phuùt) 116 240 Nhieät hôi nöôùc tieâu dieät hoaøn toaøn vi sinh vaät vaø baøo töû (30 – 40 phuùt) 110 230 Nhieät hôi nöôùc tieâu dieät hoaøn toaøn vi sinh vaät vaø baøo töû (60 – 80 phuùt) Nhieät ñoä soâi cuûa nöôùc coù khaû naêng tieâu dieät teá baøo dinh döôõng nhöng 100 212 khoâng tieâu dieät ñöôïc baøo töû 82 – 93 179 – 200 Tieâu dieät hoaøn toaøn teá baøo ñang phaùt trieån vi khuaån, naám men, naám moác 62 – 82 151 – 180 Caùc vi sinh vaät öa nhieät vaãn phaùt trieån ñöôïc Pasteur hoùa, tieâu dieät phaàn lôùn vi sinh vaät gaây beänh trong söõa, nöôùc quaû, 60 – 77 140 – 171 tröø baøo töû cuûa chuùng 16 – 38 61 – 100 Caùc loaøi naám men, naám sôïi, vi khuaån phaùt trieån maïnh 10 – 16 50 – 61 Caùc loaøi öa laïnh phaùt trieån maïnh 0 32 Caùc loaøi vi sinh vaät ngöøng phaùt trieån – 18 0 Vi khuaån ôû traïng thaùi cheát – 251 – 420 Raát nhieàu loaøi vi sinh vaät khoâng bò cheát trong hydrogen loûng
KỸ THUẬT CẤY VÔ TRÙNG Buoàng caáy: laø buoàng coù dieän tích nhỏ, coù hai lôùp cöûa. Buoàng caáy caàn laùt gaïch traùng men, töôøng sôn coù theå lau röûa được. Tröôùc mỗi lần söû duïng, buoàng caáy caàn ñöôïc xöû lyù vô trùng sơ bộ. Caùc duïng cuï mang vaøo buoàng caáy ñeàu cần phaûi ñöôïc khöû truøng: aùo choàng, muõ, khaåu trang, dao keùo, keïp, giaáy boïc, boâng, oáng nghieäm, v.v... Tuû caáy: laø loaïi tuû coù thieát bò thoåi khoâng khí voâ truøng vaøo vị trí thao taùc caáy.
KỸ THUẬT CẤY VÔ TRÙNG • Vô trùng dụng cụ trong nuôi cấy • Rữa tay bằng xà phòng và nước trước khi cấy • Lau cồn mặt bàn tủ cấy vô trùng • Dùng ngọn lửa đèn cồn để vô trùng pince, dao cấy, kéo,... • Tránh quơ tay ngang qua các dụng cụ vô trùng trong tủ cấy. • Đậy các dụng cụ và môi trường vô trùng sau mỗi thao tác • Hạn chế nói chuyện trong phòng cấy.
2.2 CHỌN ĐÚNG MÔI TRƯỜNG VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG ĐÚNG CÁCH
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Thành phần của môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường sử dụng cũng khác nhau. Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy.
PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Trong nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät coù haøng traêm loaïi moâi tröôøng khaùc nhau. Tuy nhieân coù theå chia chuùng thaønh 3 nhoùm: - Moâi tröôøng ngheøo dinh döôõng: ñieån hình laø moâi tröôøng Knop, moâi tröôøng Knudson C; - Moâi tröôøng trung bình: ñieån hình laø moâi tröôøng moâi tröôøng White; moâi tröôønng B5 cuûa Gamborg; - Moâi tröôøng giaøu dinh döôõng: ñieån hình laø moâi tröôøng Murashige – Skoog (moâi tröôøng MS).