Đánh giá khả năng gây chết tế bào theo chương trình của bài thuốc cây lược vàng và bạch hoa xà thiệt thảo thu thập tại tỉnh Sóc Trăng trên dòng tế bào ung thư

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> <br /> ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY CHẾT TẾ BÀO<br /> THEO CHƯƠNG TRÌNH CỦA BÀI THUỐC CÂY LƯỢC VÀNG<br /> VÀ BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO THU THẬP TẠI TỈNH SÓC TRĂNG<br /> TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ<br /> Bùi Chí Bảo*, Phạm Thị Bình Minh*, Khổng Lê Trường Giang**, Trịnh Thị Diệu Thường*<br /> TÓM TẮT<br /> Tình hình chung và mục tiêu nghiên cứu: Theo WHO, ung thư đang là một trong những thách thức<br /> quan trọng nhất đối với sức khoẻ cộng đồng của thế kỷ 21. Tại Việt Nam, số ca mắc mới ung thư không ngừng<br /> tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 ca năm 2010. Năm 2018, số ca ung thư mắc mới tăng lên khoảng<br /> 165.000 ca/96,5 triệu dân. Tỷ lệ các loại ung thư phổ biến tại Việt Nam: ung thư gan 15,4%, ung thư phổi<br /> 14,4%, ung thư dạ dày 10,6%, ung thư vú 9,2%, ung thư trực tràng 8,9%, ung thư khác 41,4%. Do đó, việc<br /> nghiên cứu để tìm kiếm phương thuốc điều trị hoặc hỗ trợ điều trị ung thư là rất cần thiết. Tại tỉnh Sóc Trăng,<br /> người dân bằng kinh nghiệm vẫn sử dụng bài thuốc kết hợp lá cây Lược vàng và Bạch hoa xà thiệt thảo để hỗ trợ<br /> điều trị ung thư. Cây Lược vàng có chứa quercetin, Bạch hoa xà thiệt thảo có chứa methylanthraquinon. Theo<br /> nhiều nghiên cứu, quercetin và methylanthraquinon có khả năng gây chết các tế bào ung thư thông qua cơ chế<br /> chết theo chương trình. Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có một nghiên cứu khoa học nào về việc sử dụng bài thuốc<br /> này trong điều trị ung thư. Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu khảo sát khả năng kháng ung<br /> thư của bài thuốc cây Lược vàng và Bạch hoa xà thiệt thảo tại Sóc Trăng.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là cao chiết nước của bài thuốc cây Lược<br /> vàng và Bạch hoa xà thiệt thảo thu thập được trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng. Dòng tế bào: Tế bào ung thư vú người<br /> MDA-MB 231 (ATCC), Tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ (được cung cấp bởi tiến sĩ Akira Nakagawa).<br /> Phương pháp dòng chảy tế bào (Flow cytometry - BD FACS Canto II)<br /> Kết quả: Sử dụng nồng độ thuốc pha loãng theo tỷ lệ 1/2 (3,04 mg/ml) và 1 (6,08 mg/ml) thì số lượng tế bào<br /> ung thư vú chết theo chương trình khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Kết hợp cao chiết cây Lược vàng<br /> và bạch hoa xà thiệt thảo pha loãng theo tỷ lệ 1/5 (1,22 mg/ml) và Retinoic acid (RA) cho thấy chỉ tạo cụm ngày<br /> thứ 2, ngày thứ 7 và ngày thứ 10 tế bào tách ra và biệt hoá. So sánh các marker OCT4 và SOX2 giữa nhóm tế<br /> bào RA và nhóm kết hợp RA với cao chiết cây Lược vàng và Bạch hoa xà thiệt thảo cho thấy có sự giảm biểu hiện<br /> OCT4 và SOX2 có ý nghĩa thống kê.<br /> Kết luận: Đặc tính cao chiết của bài thuốc cây Lược vàng và Bạch hoa xà thiệt thảo là sử dụng nồng độ pha<br /> loãng theo tỷ lệ 1/2 (3,04 mg/ml) đủ gây chết tế bào theo cơ chế apoptosis trên dòng tế bào ung thư vú MDA-MB<br /> 231. Nếu sử dụng nồng độ pha loãng theo tỷ lệ 1/5 (1,22 mg/ml) kết hợp với retionic acid đủ tác động đến sự biệt<br /> hóa tế bào ung thư kháng RA (tế bào SKN-DZ).<br /> Từ khóa: cây lược, bạch hoa xà thiệt thảo, apoptosis, phương pháp dòng chảy tế bào, biệt hóa<br /> ABSTRACT<br /> EVALUATING ABILITY TO APOPTOSIS OF THE HERBAL FORMULA CONSISTING OF CALLISIA<br /> FRAGRANS LINDL. AND HEDYOTIS DIFFUSA WILLD. IN SOC TRANG PROVINCE ON CANCER CELLS<br /> Bui Chi Bao, Pham Thi Binh Minh, Khong Le Truong Giang, Trinh Thi Dieu Thuong<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 82 – 90<br /> <br /> *Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Trường ĐH Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS.BS. Phạm Thị Bình Minh ĐT: 0386932527 Email: ptbminh@ump.edu.vn<br /> <br /> <br /> 82 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Objectives: According to WHO, cancer is one of the most important challenges to the public health in the<br /> 21 century. In Vietnam, incidence of cancer has continuously increased, from 68,000 (in 2000) to 126,000 (in<br /> st<br /> <br /> 2010). In 2018, incidence of cancer increased to about 165,000 cases/ 96.5 million people. The rate of popular<br /> cancers in Vietnam: liver cancer 15.4%, lung cancer 14.4%, stomach cancer 10.6%, breast cancer 9.2%, rectal<br /> cancer 8.9%, other cancers 41.4%. Therefore, research to seek treatment or support treatment for cancer is very<br /> necessary. In Soc Trang province, residents use herbal formular consisting of Callisia fragrans Lindl. and<br /> Hedyotis diffusa Willd. to support cancer treatment. Callisia fragrans Lindl. contain quercetin, Hedyotis diffusa<br /> Willd. contain methylanthraquinone. According to many studies, quercetin and methylanthraquinone are capable<br /> of killing cancer cells by apoptotic mechanism. However, there has not been any scientific research on the use of<br /> this herbal formular for cancer treatment. Therefore, this study was conducted with the objective of examining the<br /> cancer resistance of the herbal formular including Callisia fragrans Lindl. and Hedyotis diffusa Willd.<br /> Materials and Methods: The object of the study is aqueous extract of Callisia fragrans Lindl. and Hedyotis<br /> diffusa Willd. in Soc Trang province. Cell lines: MDA-MB 231 human breast cancer cells (ATCC), SKN-DZ<br /> neuroblastoma cells (supplied by Dr. Akira Nakagawa). Flow cytometry method - BD FACS Canto II.<br /> Result: Using concentrations of diluted extract at ratio 1/2 (3.04 mg/ml) or 1 (6.08 mg/ml), the number of<br /> apoptotic breast cancer cells is statistically significant different from the control lot. Combining RA with extract<br /> of Callisia fragrans Lindl. and Hedyotis diffusa Willd. diluted at ratio 1/5 (1.22 mg/ml) formed clusters only day<br /> 2, on day 7 and day 10 cells separate and differentiate. Comparing OCT4 and SOX2 markers between RA group<br /> and RA combination with extract of Callisia fragrans Lindl. and Hedyotis diffusa Willd. group, had a statistically<br /> significant reduction of OCT4 and SOX2.<br /> Conclusion: If using the extract of Callisia fragrans Lindl. and Hedyotis diffusa Willd. concentrations of<br /> diluted extract at ratio 1/2 (3.04 mg/ml) sufficiently lethal dose on breast cancer cell lines MDA-MB 231. If using<br /> concentrations of diluted extract at ratio 1/5 (1.22 mg/ml) combined with retionic acid will affect the<br /> differentiation of RA-resistant cancer cells (SKN-DZ cells).<br /> Key words: callisia fragrans lindl., hedyotis diffusa ưilld., apoptosis, flow cytometry method, differentiate<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ của các bài thuốc có nguồn gốc thảo dược có khả<br /> năng kháng ung thư, ít tác dụng phụ được nhiều<br /> Theo WHO, ung thư đang là một trong<br /> nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Tại Việt<br /> những thách thức quan trọng nhất đối với sức<br /> Nam nói chung và tỉnh Sóc Trăng nói riêng,<br /> khoẻ cộng đồng của thế kỷ 21(1,12). Tại Việt Nam<br /> trong dân gian lưu truyền kinh nghiệm sử dụng<br /> tỉ lệ ung thư ngày càng tăng. Số ca mắc mới ung<br /> một số bài thuốc Nam có tác dụng điều trị ung<br /> thư tại không ngừng tăng, từ 68.000 ca năm 2000<br /> thư như bài thuốc kết hợp lá cây Lược vàng và<br /> lên 126.000 năm 2010. Năm 2018, số ca mắc mới<br /> Bạch hoa xà thiệt thảo. Cây Lược vàng có chứa<br /> tăng lên gần 165.000 ca/96,5 triệu dân, trong đó<br /> quercetin, Bạch hoa xà thiệt thảo có chứa<br /> gần 70% trường hợp tử vong, tương đương<br /> methylanthraquinon. Theo nhiều nghiên cứu,<br /> 115.000 ca. Việt Nam xếp vị trí 99/185 quốc gia<br /> quercetin và methylanthraquinon có khả năng<br /> và vùng lãnh thổ với tỉ lệ mắc ung thư<br /> gây chết các tế bào ung thư thông qua cơ chế<br /> 151,4/100.000 dân. Tỷ lệ các loại ung thư phổ<br /> chết theo chương trình(4,8,9). Tuy nhiên, cho đến<br /> biến tại Việt Nam: ung thư gan 15,4%, ung thư<br /> nay vẫn chưa có một nghiên cứu khoa học chính<br /> phổi 14,4%, ung thư dạ dày 10,6%, ung thư vú<br /> thức về bài thuốc Nam này tại tỉnh Sóc Trăng,<br /> 9,2%, ung thư trực tràng 8,9%, ung thư khác<br /> cũng như nghiên cứu trên dược lý thực nghiệm.<br /> 41,4%. Do đó, việc nghiên cứu để tìm kiếm<br /> Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục<br /> phương thuốc điều trị hoặc hỗ trợ điều trị đối<br /> tiêu tìm kiếm bằng chứng có giá trị khoa học về<br /> với bệnh nhân ung thư là rất cần thiết. Vai trò<br /> khả năng kháng ung thư của bài thuốc cây lược<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 83<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> vàng và bạch hoa xà thiệt thảo được thu thập tại (ATCC), tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ<br /> tỉnh Sóc Trăng. (được cung cấp bởi tiến sĩ Akira Nakagawa).<br /> Mục tiêu nghiên cứu Phương pháp dòng chảy tế bào (Flow<br /> Khảo sát khả năng kháng ung thư của cao cytometry - BD FACS Canto II)<br /> chiết từ bài thuốc cây lược vàng và bạch hoa xà Mục đích phương pháp<br /> thiệt thảo. Flow cytometry là kỹ thuật có khả năng đo<br /> ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU được các đặc tính huỳnh quang và quang học<br /> Đối tượng nghiên cứu của một tế bào đơn hoặc các hạt như vi sinh<br /> Cao chiết nước từ bài thuốc cây lược vàng và vật, nhân và nhiễm sắc thể được chuẩn bị<br /> bạch hoa xà thiệt thảo thu thập được trên địa trong dung dịch lỏng khi chúng đi qua một<br /> bàn tỉnh Sóc Trăng. nguồn sáng.<br /> <br /> Phương pháp chiết cao Quy trình thực hiện<br /> Các dược liệu được thu hái tại Sóc Trăng, Tế bào được cấy lên đĩa 6 giếng với mật độ<br /> vào tháng 10/2015, người thu hái là ông Võ Văn 3x105 tế bào/ml.<br /> Thành Niệm. Xử lý tế bào ở nhiều nồng độ và ủ ở tủ ủ tế<br /> bào trong 24 giờ.<br /> Giai đoạn 1<br /> Xử lý Trypsin và thu cắn.<br /> Chiết dược liệu bằng nước cất theo nguyên<br /> tắc như sau: Đếm tế bào với mật độ 106 tế bào/ml.<br /> Bộ phận dùng: Lược vàng dùng toàn cây, Lấy thể tích có 106 tế bào thêm PBS lạnh.<br /> Bạch hoa xà thiệt thảo dùng toàn cây. Cắn được phân tán trong 1 ml Binding<br /> Sau khi thu hái, dược liệu được rửa sạch, thái buffer 1X.<br /> nhỏ, phơi khô. Chuyển 100 ul dung dịch vào ống nuôi cấy<br /> Cân dược liệu khô theo tỷ lệ Lược vàng: 5 ml.<br /> Bạch hoa xà thiệt thảo = 2:3, tổng khối lượng bài Nhuộm tế bào với hóa chất cho kiểm tra<br /> thuốc là 2 kg. apoptosis (5 ul PE Annexin V và 5 μl 7-AAD).<br /> Xay thô dược liệu. Vortex tế bào và ủ trong vòng 15 phút<br /> Cho nước ngập mặt dược liệu. trong bóng tối ở nhiệt độ phòng với hóa chất<br /> kiểm tra apoptosis.<br /> Sắc (chiết nóng) nước bằng nồi inox.<br /> Thêm 400 μl Binding buffer 1X vào từng ống<br /> Thời gian nấu: nấu trong 6 giờ (2 lần).<br /> trước khi kiểm tra với máy BD FACS Canto II.<br /> Giai đoạn 2<br /> Kiểm tra quy trình và thử nghiệm bộ kit<br /> Cô cao thuốc:<br /> Annexin V/PI bằng flow cytometry<br /> Lọc dịch chiết bằng bông gòn qua phễu.<br /> Bộ kit AnexinV/PI giúp phát hiện apoptosis<br /> Cô cách thủy dịch chiết. dựa trên cơ chế khi bắt đầu quá trình apoptosis<br /> Thu được cao thuốc nồng độ 6,08 mg/ml. các tế bào sẽ chuyển màng phosphatidylserine<br /> Giai đoạn 3 (PS) từ mặt trong của màng plasma ra bề mặt tế<br /> Bảo quản cao thuốc ở nhiệt độ 40C. bào. Khi ở trên bề mặt tế bào, PS có thể dễ dàng<br /> được phát hiện bằng cách nhuộm với Annexin<br /> Thiết kế nghiên cứu<br /> V, một protein có ái lực cao với PS. Quy trình<br /> Nghiên cứu thí nghiệm.<br /> nhuộm một bước chỉ mất 10 phút. Phát hiện có<br /> Dòng tế bào thể được phân tích bằng phương pháp dòng<br /> Tế bào ung thư vú người MDA-MB 231 chảy tế bào hoặc bằng kính hiển vi huỳnh<br /> <br /> <br /> 84 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> quang. Bộ kit này có thể phân biệt chết tế bào nhiên hay hoại tử (necrosis).<br /> theo chu trình apoptosis và chết tế bào ngẫu<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Chiến lược gating được sử dụng để đo lường apoptosis sử dụng Annexin V / PI kit<br /> Các tế bào được phân biệt với các mảnh vụn apoptosis đạt chuẩn.<br /> (mảnh vỡ tế bào, màu đen) bởi các đặc tính phân Phương pháp thống kê<br /> tán về phía trước hoặc phía bên của chúng (side Số liệu được nhập vào MS. Excel 2010 và xử<br /> scatter) và mối liên hệ tương đối của chúng với lý bằng phần mềm thống kê SPSS 16.0.<br /> nhuộm Annexin V-APC và Propidium iodide<br /> Sử dụng phép kiểm chi bình phương để so<br /> (PI) (thể hiện ở cột phải và cột dưới). Các tế bào<br /> sánh 2 tỷ lệ, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi<br /> còn sống (Annex-V – /PI–), các tế bào đang ở giai<br /> p