Đánh giá khả năng gây chết tế bào theo chương trình của bài thuốc lá đu đủ và bạch hoa xà thiệt thảo thu thập tại tỉnh Sóc Trăng trên dòng tế bào ung thư

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> <br /> ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY CHẾT TẾ BÀO THEO CHƯƠNG TRÌNH<br /> CỦA BÀI THUỐC LÁ ĐU ĐỦ VÀ BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO THU<br /> THẬP TẠI TỈNH SÓC TRĂNG TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ<br /> Phạm Thị Bình Minh*, Khổng Lê Trường Giang**, Bùi Chí Bảo*, Trịnh Thị Diệu Thường*<br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Hiện nay, Việt Nam cũng như các quốc gia khác trên thế giới có tỉ lệ ung thư ngày càng tăng<br /> (theo WHO). Tại Việt Nam, số ca mắc mới ung thư không ngừng tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 ca<br /> năm 2010. Năm 2018, số ca ung thư mắc mới tăng lên khoảng 165.000 ca/96,5 triệu dân. Việt Nam xếp vị trí<br /> 99/185 quốc gia và vùng lãnh thổ, với tỉ lệ mắc ung thư 151,4/100 000 dân. Do đó, việc nghiên cứu để tìm kiếm<br /> phương thuốc điều trị hoặc hỗ trợ điều trị ung thư là rất cần thiết. Tại tỉnh Sóc Trăng, người dân bằng kinh<br /> nghiệm vẫn sử dụng bài thuốc kết hợp lá Đu đủ và Bạch hoa xà thiệt thảo để hỗ trợ điều trị ung thư. Lá Đu đủ có<br /> chứa quercetin, Bạch hoa xà thiệt thảo có chứa methylanthraquinon. Theo nhiều nghiên cứu, quercetin và<br /> methylanthraquinon có khả năng gây chết các tế bào ung thư thông qua cơ chế chết theo chương trình. Tuy<br /> nhiên, đến nay vẫn chưa có một nghiên cứu khoa học nào về bài thuốc này trong điều trị ung thư tại tỉnh Sóc<br /> Trăng. Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu khảo sát khả năng kháng ung thư của bài thuốc lá<br /> Đu đủ và Bạch hoa xà thiệt thảo tại Sóc Trăng.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là cao chiết nước của bài thuốc lá Đu đủ<br /> và Bạch hoa xà thiệt thảo thu thập được trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng. Dòng tế bào: Tế bào ung thư vú người<br /> MDA-MB 231 (ATCC), Tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ (được cung cấp bởi tiến sĩ Akira Nakagawa).<br /> Phương pháp dòng chảy tế bào (Flow cytometry - BD FACS Canto II).<br /> Kết quả: Sử dụng nồng độ thuốc pha loãng theo tỷ lệ 1/2 (75 µg/ml) và 1 (150 µg/ml) thì số lượng tế bào<br /> ung thư vú bị apoptosis khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Kết hợp cao chiết lá Đu đủ và Bạch hoa xà<br /> thiệt thảo pha loãng theo tỷ lệ 1/5 (30 µg/ml) và Retinoic acid (RA) cho thấy chỉ tạo cụm ngày thứ 2, ngày thứ 7<br /> và ngày thứ 10 tế bào tách ra và biệt hoá. So sánh các marker OCT4 và SOX2 giữa nhóm tế bào RA và nhóm kết<br /> hợp RA với cao chiết lá Đu đủ và Bạch hoa xà thiệt thảo cho thấy có sự giảm biểu hiện OCT4 và SOX2 có ý<br /> nghĩa thống kê.<br /> Kết luận: Đặc tính cao chiết của bài thuốc lá Đu đủ và Bạch hoa xà thiệt thảo là sử dụng nồng độ pha<br /> loãng theo tỷ lệ 1/2 (75 µg/ml) đủ gây chết apoptosis trên dòng tế bào ung thư vú. Nếu sử dụng nồng độ pha<br /> loãng theo tỷ lệ 1/5 (30 µg/ml) kết hợp với retionic acid đủ tác động đến sự biệt hóa tế bào ung thư kháng<br /> RA (tế bào SKN-DZ).<br /> Từ khoá: Lá đu đủ, Bạch hoa xà thiệt thảo, phương pháp dòng chảy tế bào, biệt hóa<br /> ABSTRACT<br /> EVALUATING ABILITY TO APOPTOSIS OF THE HERBAL FORMULAR CONSISTING OF CARICA<br /> PAPAYA L. AND HEDYOTIS DIFFUSA WILLD. IN SOC TRANG PROVINCE ON CANCER CELLS<br /> Pham Thi Binh Minh, Khong Le Truong Giang, Bui Chi Bao, Trinh Thi Dieu Thuong<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 192 – 200<br /> Objectives: Currently, Vietnam as well as other countries in the world have been increasing cancer rates<br /> (according to WHO). In Vietnam, incidence of cancer has continuously increased, from 68,000 (in 2000) to<br /> * Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Trường ĐH Công nghệ TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS.BS. Phạm Thị Bình Minh ĐT: 0386932527 Email: ptbminh@ump.edu.vn.com<br /> <br /> <br /> 192 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 126,000 (in 2010). In 2018, incidence of cancer increased to about 165,000 cases/ 96.5 million people. Vietnam<br /> ranked 99/185 countries and territories, with cancer incidence of 151.4/100,000. Therefore, research to seek<br /> treatment or support treatment for cancer is very necessary. In Soc Trang province, residents use herbal formular<br /> consisting of Carica papaya L. and Hedyotis diffusa Willd. to support cancer treatment. Carica papaya L. contains<br /> quercetin, Hedyotis diffusa Willd. contains methylanthraquinone. According to many studies, quercetin and<br /> methylanthraquinone are capable of killing cancer cells by apoptotic mechanism. However, until now, there has<br /> not been any scientific research on this herbal formular for cancer treatment in Soc Trang province. Therefore, this<br /> study was conducted with the objective of examining the cancer resistance of the herbal formular consisting of<br /> Carica papaya L. and Hedyotis diffusa Willd.<br /> Methods: The object of the study is aqueous extract of Carica papaya L. and Hedyotis diffusa Willd. in Soc<br /> Trang province. Cell lines: MDA-MB 231 human breast cancer cells (ATCC), SKN-DZ neuroblastoma cells<br /> (were supplied by Dr. Akira Nakagawa). Flow cytometry method - BD FACS Canto II.<br /> Results: Using concentrations of diluted extract at ratio 1/2 (75 µg/ml) or 1 (150 µg/ml), the number of<br /> apoptotic breast cancer cells is statistically significant different from the control lot. Combining RA with extract<br /> of Carica papaya L. and Hedyotis diffusa Willd. diluted at ratio 1/5 (30 µg/ml) formed clusters only on day 2, on<br /> day 7 and day 10 cells separate and differentiate. Comparing OCT4 and SOX2 markers between RA group and<br /> RA combination with extract of Carica papaya L. and Hedyotis diffusa Willd. group, had a statistically significant<br /> reduction of OCT4 and SOX2.<br /> Conclusion: If using the extract of Carica papaya L. and Hedyotis diffusa Willd. concentrations of diluted<br /> extract at ratio 1/2 (75 µg/ml) sufficiently lethal dose on breast cancer cell lines. If using concentrations of diluted<br /> extract at ratio 1/5 (30 µg/ml) combined with retionic acid will affect the differentiation of RA-resistant cancer<br /> cells (SKN-DZ cells).<br /> Keywords: Carica papaya L., Hedyotis diffusa willd., flow cytometry method, differentiate<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ rất cần thiết. Vai trò của các bài thuốc có nguồn<br /> gốc thảo dược có khả năng kháng ung thư, ít tác<br /> Hiện nay, Việt Nam cũng như các quốc gia<br /> dụng phụ đang được các nhà khoa học quan tâm<br /> khác trên thế giới đứng trước nhiều nguy cơ mới<br /> nghiên cứu. Tại Việt Nam nói chung và tỉnh Sóc<br /> về sức khỏe như: sự già hóa dân số, nhóm bệnh<br /> Trăng nói riêng với tinh thần “Nam dược trị<br /> do tích tuổi, bệnh không lây như thoái hóa khớp,<br /> Nam nhân”, trong dân gian lưu truyền kinh<br /> đái tháo đường týp 2, tăng huyết áp, ung thư,<br /> nghiệm sử dụng một số bài thuốc Nam có tác<br /> đột quỵ não, ngày càng tăng(1,14). Trong đó, theo<br /> dụng điều trị ung thư. Trong đó, bài thuốc lá Đu<br /> thống kê của WHO ung thư là một trong những<br /> đủ và Bạch hoa xà thiệt thảo được cho là có khả<br /> bệnh có tỉ lệ ngày càng tăng tại Việt Nam. Số ca<br /> năng kháng ung thư nhờ thành phần quercetin<br /> mắc mới ung thư tại Việt Nam không ngừng<br /> trong lá đu đủ và methylanthraquinon trong<br /> tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 năm<br /> Bạch hoa xà thiệt thảo(7,10,15). Tuy nhiên, cho đến<br /> 2010. Năm 2018, số ca mắc mới tăng lên gần<br /> nay vẫn chưa có một nghiên cứu khoa học chính<br /> 165.000 ca/96,5 triệu dân, trong đó gần 70%<br /> thức về bài thuốc Nam này tại tỉnh Sóc Trăng,<br /> trường hợp tử vong, tương đương 115.000 ca.<br /> cũng như nghiên cứu trên dược lý thực nghiệm.<br /> Việt Nam xếp vị trí 99/185 quốc gia và vùng lãnh<br /> Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục<br /> thổ với tỉ lệ mắc ung thư 151,4/100.000 dân. Tỉ lệ<br /> tiêu tìm kiếm bằng chứng có giá trị khoa học về<br /> tử vong do ung thư là 104,4/100.000 dân, xếp vị<br /> khả năng kháng ung thư của bài thuốc lá Đu đủ<br /> trí 56/185 quốc gia và vùng lãnh thổ. Do đó, việc<br /> và Bạch hoa xà thiệt thảo được thu thập tại tỉnh<br /> nghiên cứu để tìm kiếm phương thuốc điều trị<br /> Sóc Trăng.<br /> hoặc hỗ trợ điều trị đối với bệnh nhân ung thư là<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 193<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> Mục tiêu nghiên cứu (ATCC), tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ<br /> Khảo sát khả năng kháng ung thư của cao (được cung cấp bởi tiến sĩ Akira Nakagawa).<br /> chiết từ bài thuốc lá Đu đủ và Bạch hoa xà Phương pháp dòng chảy tế bào (Flow<br /> thiệt thảo. cytometry)<br /> ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Giúp phát hiện apoptosis. Flow cytometry là<br /> Đối tượng nghiên cứu kỹ thuật có khả năng đo được các đặc tính<br /> Cao chiết nước từ bài thuốc lá Đu đủ và Bạch huỳnh quang và quang học của một tế bào đơn<br /> hoa xà thiệt thảo thu thập được trên địa bàn tỉnh hoặc các hạt như vi sinh vật, nhân và nhiễm sắc<br /> Sóc Trăng. thể được chuẩn bị trong dung dịch lỏng khi<br /> chúng đi qua một nguồn sáng.<br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Quy trình thực hiện<br /> Thiết kế nghiên cứu<br /> Tế bào được cấy lên đĩa 6 giếng với mật độ<br /> Nghiên cứu thí nghiệm. Từ 1/6/2016 đến<br /> 3x105 tế bào/ml.<br /> 30/10/2016.<br /> Xử lý tế bào ở nhiều nồng độ và ủ ở tủ ủ tế<br /> Phương pháp chiết cao bào trong 24 giờ.<br /> Các dược liệu được thu hái tại Sóc Trăng, Xử lý Trypsin và thu cắn.<br /> vào tháng 10/2015, người thu hái là ông Võ Văn<br /> Đếm tế bào với mật độ 106 tế bào/ml.<br /> Thành Niệm.<br /> Lấy thế tích có 106 tế bào thêm PBS lạnh.<br /> Giai đoạn 1<br /> Cắn được phân tán trong 1 ml Binding<br /> Chiết dược liệu bằng nước cất theo nguyên<br /> buffer 1X.<br /> tắc như sau:<br /> Chuyển 100 ul dung dịch vào ống nuôi cấy 5 ml.<br /> Bộ phận dùng: Đu đủ dùng lá, Bạch hoa xà<br /> Nhuộm tế bào với hóa chất cho kiểm tra<br /> thiệt thảo dùng toàn cây.<br /> apoptosis (5 ul PE Annexin V và 5 μl 7-AAD).<br /> Sau khi thu hái, dược liệu được rửa sạch, thái<br /> Vortex tế bào và ủ trong vòng 15 phút trong<br /> nhỏ, phơi khô.<br /> bóng tối ở nhiệt độ phòng với hóa chất kiểm tra<br /> Cân dược liệu khô theo tỷ lệ lá Đu đủ: Bạch<br /> apoptosis.<br /> hoa xà thiệt thảo = 2:3, tổng khối lượng bài thuốc<br /> Thêm 400 μl Binding buffer 1X vào từng<br /> là 2 kg.<br /> ống trước khi kiểm tra với máy BD FACS<br /> Xay thô dược liệu.<br /> Canto II.<br /> Cho nước ngập mặt dược liệu.<br /> Kiểm tra quy trình và thử nghiệm bộ kit<br /> Sắc (chiết nóng) nước bằng nồi inox. Annexin V/PI bằng flow cytometry<br /> Thời gian nấu: Nấu trong 6 giờ (2 lần). Bộ kit AnexinV/PI giúp phát hiện apoptosis<br /> Giai đoạn 2 dựa trên cơ chế khi bắt đầu quá trình apoptosis<br /> Cô cao thuốc: các tế bào sẽ chuyển màng phosphatidylserine<br /> Lọc dịch chiết bằng bông gòn qua phễu. (PS) từ mặt trong của màng plasma ra bề mặt tế<br /> Cô cách thủy dịch chiết. bào. Khi ở trên bề mặt tế bào, PS có thể dễ dàng<br /> được phát hiện bằng cách nhuộm với Annexin<br /> Thu được cao thuốc nồng độ 150 µg/ml.<br /> V, một protein có ái lực cao với PS. Quy trình<br /> Giai đoạn 3<br /> nhuộm một bước chỉ mất 10 phút. Phát hiện có<br /> Bảo quản cao thuốc ở nhiệt độ 40oC. thể được phân tích bằng phương pháp dòng<br /> Dòng tế bào chảy tế bào hoặc bằng kính hiển vi huỳnh quang<br /> Tế bào ung thư vú người MDA-MB 231 (Hình 1).<br /> <br /> <br /> 194 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Chiến lược gating được sử dụng để đo lường apoptosis sử dụng Annexin V/PI kit<br /> Tế bào apoptosis sớm: là tế bào mất đối (Annex-V–/PI+). Lô sẽ lặp lại từ 3 thí nghiệm<br /> xứng màng huyết tương, phosphatidylserine kiểm soát.<br /> (PS) được chuyển từ bên trong ra bên ngoài của Như vậy, bộ kit AnexinV/PI giúp phát hiện<br /> màng plasma. apoptosis đạt chuẩn.<br /> Tế bào apoptosis trễ: là tế bào có màng tế bào Phương pháp thống kê<br /> mất nguyên vẹn. Số liệu được nhập vào MS. Excel 2010 và xử<br /> Các tế bào được phân biệt với các mảnh vụn lý bằng phần mềm thống kê SPSS 16.0, sử dụng<br /> (mảnh vỡ tế bào, màu đen) bởi các đặc tính phân<br /> phép kiểm chi bình phương để so sánh 2 tỷ lệ, sự<br /> tán về phía trước hoặc phía bên của chúng (side<br /> khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p