intTypePromotion=3

Đánh giá và ứng dụng mô hình ruồi giấm Drosophila melanogaster trong nghiên cứu sàng lọc cây thuốc có hoạt tính kháng ung thư

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:5

0
21
lượt xem
0
download

Đánh giá và ứng dụng mô hình ruồi giấm Drosophila melanogaster trong nghiên cứu sàng lọc cây thuốc có hoạt tính kháng ung thư

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết tiến hành nghiên cứu đánh giá mô hình ruồi giấm Drosophila melanogaster biểu hiện vượt mức protein YorkieS168A nhằm ứng dụng trong sàng lọc cây thuốc có hoạt tính kháng ung thư.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Đánh giá và ứng dụng mô hình ruồi giấm Drosophila melanogaster trong nghiên cứu sàng lọc cây thuốc có hoạt tính kháng ung thư

  1. TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 245­248  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se. ĐÁNH GIÁ VÀ ỨNG DỤNG MÔ HÌNH RUỒI GIẤM Drosophila melanogaster  TRONG NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CÂY THUỐC  CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ Vũ Hoàng Giang, Cao Thị Thùy Trang, Nguyễn Minh Cần,  Đặng Ngọc Ánh Sương, Đặng Thị Phương Thảo* Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp. Hồ Chí Minh, *thaodp@hcmus.edu.vn TÓM TẮT: Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh giá mô hình ruồi giấm Drosophila   melanogaster biểu hiện vượt mức protein YorkieS168A nhằm ứng dụng trong sàng lọc cây thuốc có  hoạt tính kháng ung thư. Nhân tố phiên mã Yorkie (Yki) có vai trò trong kiểm soát kích thước mô  và có liên quan đến nhiều loại ung thư. Chúng tôi nhận thấy biểu hiện vượt mức protein Yki S168A  tại mô mắt ruồi giấm đã gây ra kiểu hình tăng sinh bất thường của mắt ruồi. Như  hiện tượng   thấy được trong một khối u của tế bào ung thư, các kết quả khảo sát của chúng tôi cho thấy kiểu   hình mắt bất thường của ruồi gây ra do sự tăng sinh không kiểm soát của các tế bào, thể hiện qua   các tín hiệu kháng thể  PH3 sau lằn phân sinh morphogenesis furrow.  Ngoài ra, sàng lọc ban đầu   cho thấy cao chiết ethanol 50% từ cây xạ đen ( Ehretia asperula Zoll. & Mor.) đã có tác dụng làm  giảm kiểu hình mắt bất thường của mô hình này. Tất cả các kết quả trên cho thấy, mô hình ruồi  giấm biểu hiện vượt mức YkiS168A có tiềm năng trong sàng lọc sơ cấp các cây thuốc có hoạt tính   kháng ung thư. Từ  khóa: Drosophila melanogaster, Ehretia asperula, kháng ung thư, nhân tố  phiên mã yorkie,  xạ đen. MỞ ĐẦU chuyển vị Yki ra khỏi nhân và định vị  trong tế  Mô hình ruồi giấm có nhiều ưu điểm như:  bào chất [2]. Yki kích thích sự  phiên mã các  vòng   đời   ngắn,   dễ   nuôi,   ít   tốn   kém,   có   thể  gene thúc đẩy tăng trưởng và tăng sinh tế bào,  triển khai  ở qui mô lớn, bộ gene đã được giải  cũng như các gene ức chế apoptosis gồm cyclin   trình tự, hơn 70% các gene gây bệnh  ở  người  E, cyclin B, DIAP1 và bantam [6]. Nghiên cứu   có độ tương đồng cao so với gene ở ruồi giấm   của Oh và cộng sự đã cho thấy đột biến S168A   [5]. Với các  ưu điểm này, mô hình ruồi giấm  gây ra kiểu hình mắt bất thường trên ruồi giấm  rất thích hợp cho việc sàng lọc ban đầu các  [3].  Nhận thấy tiềm năng  ứng dụng của  mô  hợp chất tiềm năng có khả  năng chữa bệnh,  hình này, chúng tôi tiến hành đánh giá việc sử  đặc biệt là ung thư, giúp rút ngắn thời gian  dụng   mô   hình   ruồi   giấm  Drosophila  cũng như chi phí cho phát triển các loại thuốc   melanogaster  biểu hiện vượt mức Yki S168A  cho  mới.   Nhiều   gene   gây   ung   thư   và   các   con   sàng lọc các cây thuốc có hoạt tính kháng ung  đường tín hiệu liên quan đến ung thư ở người  thư. đã được nghiên cứu trên mô hình ruồi giấm  VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU [1]. Các dòng ruồi Con đường Hippo được phát hiện đầu tiên  trên ruồi giấm, có vai trò trong việc kiểm soát  Các dòng ruồi được nuôi trên môi trường   kích thước mô thông qua việc điều hoà nhân tố  chuẩn   ở   25oC.   Dòng   ruồi   CantonS   được   sử  phiên mã Yki [4]. Các sai hỏng trong con đường   dụng như dòng ruồi hoang dại. Các dòng ruồi   này dẫn đến sự phát triển quá mức của mô. Sự  mang   phức   hợp   gene   UAS­lacZ   (mã   số  phosphoryl hoá Yki tại Ser168 đóng vai trò quan  107532), UAS­YkiS168A (mã số  28818) và dòng  trọng,  tạo  vị  trí  gắn  cho protein 14­3­3,  giúp  ruồi mang GMR­GAL4 trên nhiễm sắc thể  X  245
  2. được lấy từ  ngân hàng ruồi Bloomington và  pháp ngâm dầm (maceration) Kyoto.  Thu nhận mẫu cây thuốc, định danh. Ngâm   Biểu hiện vượt mức protein mẫu trong dung môi ethanol 50% ở 25oC, khuấy  Lai   ruồi   cái   mang  phức   hợp   gene   GMR­ đảo và thay dung môi mới mỗi ngày trong 7  GAL4 với ruồi đực mang phức hợp gene UAS­ ngày. Dịch chiết được lọc hai lần qua giấy lọc,  YkiS168A. Protein YkiS168A  sẽ  được biểu hiện  ở  cô cạn dung môi  ở  45oC. Làm khô cao bằng  thế  hệ  con lai F1. Nhân tố  điều hoà phiên mã  máy   đông   khô   VirTis   BenchTop   K   (SP  GAL4 được biểu hiện tại mô mắt ruồi giấm   Scientific, Hoa Kỳ). Bảo quản cao trong tủ mát  nhờ  promoter chuyên biệt cho mô mắt GMR,  4oC. bám lên trình tự  điều hoà phiên mã UAS giúp  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN biểu   hiện   vượt   mức   protein   mục   tiêu   (hình  1a). Biểu hiện vượt mức YkiS168A gây kiểu hình  Các   phép   lai   được   thực   hiện   trên   môi  bất thường tại mô mắt ruồi giấm trưởng  trường tổng hợp Formula 4­24 Instant Medium,  thành Blue (Carolina Biological Supply Company, Hoa  Sử  dụng hệ  thống biểu hiện  định hướng  Kỳ). mô GAL4/UAS, trong đó Gal4 được biểu hiện  Đánh giá kiểu hình mắt nhờ  hoạt động của promoter đặc hiệu mô mắt  Các đánh giá được thực hiện  ở   một  ngày  GMR và sau đó Gal4 gắn trên trình tự  UAS  ở  tuổi. Ghi nhận kiểu hình mắt theo hướng nhìn  thượng nguồn gene yki và gây ra sự biểu hiện  từ một bên mắt và nhìn từ đỉnh đầu bằng máy  vượt mức YkiS168A tại mô mắt ruồi giấm (hình  ảnh Canon PowerShot A2400IS và kính hiển vi  1a). Kết quả cho thấy, kiểu hình mắt của dòng  soi nổi ZMZ600 (Nikkon, Nhật Bản).  ruồi biểu hiện vượt  mức YkiS168A  có sự  thay  đổi màu sắc, tăng kích thước, tạo thành các nếp  Nhuộm miễn dịch huỳnh quang nhăn trên bề  mặt và mất cấu trúc trật tự  của  Thu nhận đĩa tiền phân sinh mắt của   ấu  các   mắt   đơn   cũng   như   gai   mắt   (hình   1b,  trùng   bậc   ba.  Cố   định   mẫu   bằng  GMR>YkiS168A). Ruồi biểu hiện vượt mức một  Paraformaldehyde   (PFA)   4%  trong  15   phút,   ở  protein ngoại lai khác là β­galactosidase tại mô  25oC.  Ủ  mẫu với kháng thể  kháng PH3 (Cell  mắt   (hình  1b,   GMR>lacZ)   và   ruồi   biểu   hiện  Signaling,   Nhật   Bản)   (1:1000);   beta  Gal4 tại mô mắt (hình 1b, GMR>CS) cho kiểu   galactosidase   (Cell   Signaling,   Nhật   Bản)  hình mắt bình thường. Kết quả này khẳng định  (1:500) trong 2 giờ ở 25oC. Sau đó ủ với kháng  kiểu hình mắt với kích thước to, màu sắc bất   thể   bậc   hai   có   gắn   chất   phát   huỳnh   quang   thường gây ra bởi sự  biểu hiện vượt mức   yki  Alexa 488 (Invitrogen, Nhật Bản) (1:400) trong  trong mô mắt ruồi.  2 giờ   ở  25oC. Xem kết quả  dưới kính hiển vi  huỳnh   quang   Olympus   BX41   (Olympus,   Hoa  Kỳ).   Tín   hiệu   huỳnh   quang   được   phân   tích  bằng phần mềm ImageJ, xử  lý thống kê bằng  phần mềm GraphPad Prism 6.0. Đối   với   thí   nghiệm   chứng   minh   sự   biểu  hiện yki trong đĩa phân sinh mắt ruồi, chúng tôi  sử  dụng kháng thể  kháng V5 (một peptide tín  hiệu   được   gắn   kèm   với   yki)   (cell   signaling,  Nhật Bản) với tỷ  lệ  1:500. Các bước nhuộm  kháng thể  bậc 2 và quan sát được thực hiện  như mô tả bên trên. Thu nhận cao chiết cây thuốc bằng phương   246
  3. phân   sinh   mắt   được   nhuộm   với   kháng   thể  kháng V5 và kháng thể kháng β­galactosidase). Biểu  hiện  vượt  mức  YkiS168A  làm  tăng  tín  hiệu PH3 tại đĩa tiền phân sinh mắt của ấu   trùng bậc ba Chúng   tôi   tiến   hành   nhuộm   miễn   dịch   huỳnh quang  đĩa  tiền phân sinh  mắt của   ấu  trùng   bậc   ba   với   kháng   thể   kháng   PH3  (Phospho­Histone 3), dấu hiệu nhận biết giai   đoạn phân bào (M phase). Kết quả  cho thấy,   có sự tăng các tín hiệu huỳnh quang  ở sau lằn   phân sinh (MF­Morphogenesis Furrow) trên đĩa  1 mắt   của   dòng   ruồi   biểu   hiện   vượt   mức  YkiS168A (hình 2, GMR>YkiS168A). Ngược lại,  ở  hai   dòng   ruồi   đối   chứng   (hình   2,   GMR>CS,  GMR>LacZ) các tế bào phát triển theo qui luật  2 bình thường, tế  bào  ở  sau lằn phân sinh (MF)   hầu như  ngừng phân chia và đi vào giai đoạn  biệt   hóa.   Điều   này   cho   thấy,   sự   biểu   hiện  vượt  mức  YkiS168A  đã gây ra các bất  thường  trong điều hòa  chu kỳ  tế  bào, làm mất kiểm   3 soát sự tăng sinh của tế bào. Chính điều này đã  tạo nên kiểu hình mắt bất  thường  trên ruồi   trưởng thành. Các   kết   quả   trên   cho   thấy,   mô   hình   Hình 1. a. Hệ thống biểu hiện định hướng mô  ruồi   giấm   biểu   hiện   vượt   mức   YkiS168A  đã   GAL4/UAS.  b.  Ảnh hưởng của sự  biểu hiện  mô phỏng được đặc điểm mất kiểm soát trong  vượt mức YkiS168A lên kiểu hình mắt (b1: mắt   tăng sinh của tế bào ung thư, và có triển vọng  ruồi   nhìn   nghiêng   theo   chiều   thân;   b2:   mắt  để  phát triển thành mô hình sàng lọc sơ  cấp   ruồi nhìn thẳng theo chiều thân; b3: đĩa tiền  các cây thuốc tiềm năng cho hỗ trợ và điều trị  ung thư. Hình 2. Sự biểu hiện vượt mức  YkiS168A làm tăng tín hiệu PH3  trên đĩa tiền phân sinh mắt của  ấu trùng bậc ba  (****: p
  4. Hình   3.  Ảnh   hưởng   của   cao  chiết từ  thân (a)  và lá (b)  cây  xạ   đen  lên  mô   hình  ruồi   biểu  hiện vượt mức YkiS168A Cao chiết từ thân và lá cây xạ đen làm giảm   khả năng đánh giá tác động của các nhân tố lên  kiểu   hình   bất   thường   ở   mắt   ruồi   giấm  quá   trình   phát   triển   mắt,   mô   hình   mắt   ruồi  biểu hiện vượt mức YkiS168A giấm   biểu   hiện   vượt   mức   Yki S168A  có   tiềm  năng rất lớn để  phát triển thành mô hình sàng  Xạ   đen   (Ehretiaasperula  Zoll.  &   Mor.)  lọc sơ  cấp các cây thuốc có hoạt tính kháng  thường được sử  dụng trong các bài thuốc dân  ung thư ở quy mô lớn. Bước đầu khảo sát ảnh  gian hỗ  trợ  điều trị  ung thư. Tuy nhiên, công  hưởng của cao chiết từ lá và thân cây xạ  đen  dụng của xạ  đen vẫn chưa được chứng minh  (Ehretiaasperula Zoll. & Mor.) lên mô hình này  ở mức in vivo. cho thấy, các cao chiết này đều có khả  năng  Chúng tôi bổ  sung cao chiết từ  thân và lá  phục hồi kiểu hình mắt của mô hình, cải thiện   cây xạ đen vào thức ăn và  nuôi phôi của dòng  sức sống ruồi trưởng thành.  ruồi   biểu   hiện   vượt   mức   YkiS168A  trên   môi  trường này. Kết quả quan sát mắt ruồi trưởng   thành cho thấy, với nồng độ  cao chiết xạ  đen  100 mg/ml, ruồi thử  nghiệm có màu mắt sáng  hơn, các nếp gấp trên bề mặt mắt giảm so với   ruồi không ăn cao chiết. Hiệu quả này rõ hơn  ở nồng độ 150 mg/ml (hình 3). KẾT LUẬN Mô  hình ruồi  giấm  biểu hiện  vượt   mức   Yki S168A   đã   mô   phỏng   được   đặc   điểm   mất  kiểm soát tăng sinh của các tế  bào ung thư,  gây   ra   kiểu   hình   bất   thường   trên   mắt   ruồi  trưởng thành. Với các ưu điểm về  chi phí duy  trì, khả  năng sinh sản, thời gian thí nghiệm và  248
  5. TÀI LIỆU THAM KHẢO 4. Pan D., 2007. Hippo signaling in organ size  1. Brumby   A.   M.,   Richardson   H.   E.,   2005.  control. Genes & Development, 21(8): 886­ Using   Drosophila   melanogaster   to   map  897. human   cancer   pathways.   Nature   Reviews  5. Reiter L. T., Potocki L., Chien S, Gribskov  Cancer, 5(8): 626­639. M., Bier E., 2001. A systematic analysis of  2. Oh   H.,   Irvine   K.   D.,   2008.   In   vivo  human disease­associated gene sequences in  regulation   of   Yorkie   phosphorylation   and  Drosophila   melanogaster.   Genome  localization.   Development,   135(6):   1081­ Research, 11(6): 1114­1125. 1088. 6. Zhao B.,  Tumaneng K.,  Guan K.  L.,  2011.  3. Oh H., Irvine K. D., 2009. In vivo analysis  The   Hippo   pathway   in   organ   size   control,  of Yorkie phosphorylation sites. Oncogene,  tissue regeneration and stem cell self­renewal.  28(17): 1916­1927. Nature Cell Biology, 13(8): 877­883. EVALUATE Drosophila melanogaster MODEL AND APPLY  FOR ANTI­CANCER HERB SCREENING Vu Hoang Giang, Cao Thi Thuy Trang, Nguyen Minh Can,  Dang Ngoc Anh Suong, Dang Thi Phuong Thao University of Science, Vietnam National University in Ho Chi Minh city SUMMARY In this study, we evaluate  Drosophila melanogaster  model which over­express YorkieS168A  protein in  order to apply the model for anti­cancer herb screening. Transcriptional co­activator Yorkie S168A (Yki) plays a  role in organ size control and concerns some cancer diseases. In fly model, over­expression of Yorkie S168A  protein at eye tissue causes abnormal eye phenotype. As mass of cancerous cells, the abnormal eye phenotype  is resulted by miss­control of cell proliferation as shown by anti PH3 signal after morphogenesis furrow.  Interestingly, our results also show that ethanol 50% extraction of  Ehretia  asperula  Zoll.  & Mor. reduces  abnormal eye phenotype in over­expressed Yki S168A flies. All the results show that over­expressed Yki S168A fly  model serves as a potential model for anti­cancer herb screening. Keywords: Drosophila melanogaster, Ehretia asperula, anti­cancer, transcription factor yorkie, xạ đen. Ngày nhận bài: 22­10­2014 249

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

Đồng bộ tài khoản