Đánh giá và ứng dụng mô hình ruồi giấm Drosophila melanogaster trong nghiên cứu sàng lọc cây thuốc có hoạt tính kháng ung thư

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 245­248<br />  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ĐÁNH GIÁ VÀ ỨNG DỤNG MÔ HÌNH RUỒI GIẤM Drosophila melanogaster <br /> TRONG NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CÂY THUỐC <br /> CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ<br /> <br /> Vũ Hoàng Giang, Cao Thị Thùy Trang, Nguyễn Minh Cần, <br /> Đặng Ngọc Ánh Sương, Đặng Thị Phương Thảo*<br /> Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp. Hồ Chí Minh, *thaodp@hcmus.edu.vn<br /> <br /> TÓM TẮT: Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh giá mô hình ruồi giấm Drosophila  <br /> melanogaster biểu hiện vượt mức protein YorkieS168A nhằm ứng dụng trong sàng lọc cây thuốc có <br /> hoạt tính kháng ung thư. Nhân tố phiên mã Yorkie (Yki) có vai trò trong kiểm soát kích thước mô <br /> và có liên quan đến nhiều loại ung thư. Chúng tôi nhận thấy biểu hiện vượt mức protein Yki S168A <br /> tại mô mắt ruồi giấm đã gây ra kiểu hình tăng sinh bất thường của mắt ruồi. Như  hiện tượng  <br /> thấy được trong một khối u của tế bào ung thư, các kết quả khảo sát của chúng tôi cho thấy kiểu  <br /> hình mắt bất thường của ruồi gây ra do sự tăng sinh không kiểm soát của các tế bào, thể hiện qua  <br /> các tín hiệu kháng thể  PH3 sau lằn phân sinh morphogenesis furrow.  Ngoài ra, sàng lọc ban đầu  <br /> cho thấy cao chiết ethanol 50% từ cây xạ đen ( Ehretia asperula Zoll. & Mor.) đã có tác dụng làm <br /> giảm kiểu hình mắt bất thường của mô hình này. Tất cả các kết quả trên cho thấy, mô hình ruồi <br /> giấm biểu hiện vượt mức YkiS168A có tiềm năng trong sàng lọc sơ cấp các cây thuốc có hoạt tính  <br /> kháng ung thư.<br /> Từ  khóa: Drosophila melanogaster, Ehretia asperula, kháng ung thư, nhân tố  phiên mã yorkie, <br /> xạ đen.<br /> <br /> MỞ ĐẦU chuyển vị Yki ra khỏi nhân và định vị  trong tế <br /> Mô hình ruồi giấm có nhiều ưu điểm như:  bào chất [2]. Yki kích thích sự  phiên mã các <br /> vòng   đời   ngắn,   dễ   nuôi,   ít   tốn   kém,   có   thể  gene thúc đẩy tăng trưởng và tăng sinh tế bào, <br /> triển khai  ở qui mô lớn, bộ gene đã được giải  cũng như các gene ức chế apoptosis gồm cyclin  <br /> trình tự, hơn 70% các gene gây bệnh  ở  người  E, cyclin B, DIAP1 và bantam [6]. Nghiên cứu  <br /> có độ tương đồng cao so với gene ở ruồi giấm   của Oh và cộng sự đã cho thấy đột biến S168A  <br /> [5]. Với các  ưu điểm này, mô hình ruồi giấm  gây ra kiểu hình mắt bất thường trên ruồi giấm <br /> rất thích hợp cho việc sàng lọc ban đầu các  [3].  Nhận thấy tiềm năng  ứng dụng của  mô <br /> hợp chất tiềm năng có khả  năng chữa bệnh,  hình này, chúng tôi tiến hành đánh giá việc sử <br /> đặc biệt là ung thư, giúp rút ngắn thời gian  dụng   mô   hình   ruồi   giấm  Drosophila <br /> cũng như chi phí cho phát triển các loại thuốc   melanogaster  biểu hiện vượt mức Yki S168A  cho <br /> mới.   Nhiều   gene   gây   ung   thư   và   các   con   sàng lọc các cây thuốc có hoạt tính kháng ung <br /> đường tín hiệu liên quan đến ung thư ở người  thư.<br /> đã được nghiên cứu trên mô hình ruồi giấm  VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> [1].<br /> Các dòng ruồi<br /> Con đường Hippo được phát hiện đầu tiên <br /> trên ruồi giấm, có vai trò trong việc kiểm soát  Các dòng ruồi được nuôi trên môi trường  <br /> kích thước mô thông qua việc điều hoà nhân tố  chuẩn   ở   25oC.   Dòng   ruồi   CantonS   được   sử <br /> phiên mã Yki [4]. Các sai hỏng trong con đường   dụng như dòng ruồi hoang dại. Các dòng ruồi  <br /> này dẫn đến sự phát triển quá mức của mô. Sự  mang   phức   hợp   gene   UAS­lacZ   (mã   số <br /> phosphoryl hoá Yki tại Ser168 đóng vai trò quan  107532), UAS­YkiS168A (mã số  28818) và dòng <br /> trọng,  tạo  vị  trí  gắn  cho protein 14­3­3,  giúp  ruồi mang GMR­GAL4 trên nhiễm sắc thể  X <br /> <br /> <br /> 245<br /> được lấy từ  ngân hàng ruồi Bloomington và  pháp ngâm dầm (maceration)<br /> Kyoto.  Thu nhận mẫu cây thuốc, định danh. Ngâm  <br /> Biểu hiện vượt mức protein mẫu trong dung môi ethanol 50% ở 25oC, khuấy <br /> Lai   ruồi   cái   mang  phức   hợp   gene   GMR­ đảo và thay dung môi mới mỗi ngày trong 7 <br /> GAL4 với ruồi đực mang phức hợp gene UAS­ ngày. Dịch chiết được lọc hai lần qua giấy lọc, <br /> YkiS168A. Protein YkiS168A  sẽ  được biểu hiện  ở  cô cạn dung môi  ở  45oC. Làm khô cao bằng <br /> thế  hệ  con lai F1. Nhân tố  điều hoà phiên mã  máy   đông   khô   VirTis   BenchTop   K   (SP <br /> GAL4 được biểu hiện tại mô mắt ruồi giấm   Scientific, Hoa Kỳ). Bảo quản cao trong tủ mát <br /> nhờ  promoter chuyên biệt cho mô mắt GMR,  4oC.<br /> bám lên trình tự  điều hoà phiên mã UAS giúp  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> biểu   hiện   vượt   mức   protein   mục   tiêu   (hình <br /> 1a). Biểu hiện vượt mức YkiS168A gây kiểu hình <br /> Các   phép   lai   được   thực   hiện   trên   môi  bất thường tại mô mắt ruồi giấm trưởng <br /> trường tổng hợp Formula 4­24 Instant Medium,  thành<br /> Blue (Carolina Biological Supply Company, Hoa  Sử  dụng hệ  thống biểu hiện  định hướng <br /> Kỳ). mô GAL4/UAS, trong đó Gal4 được biểu hiện <br /> Đánh giá kiểu hình mắt nhờ  hoạt động của promoter đặc hiệu mô mắt <br /> Các đánh giá được thực hiện  ở   một  ngày  GMR và sau đó Gal4 gắn trên trình tự  UAS  ở <br /> tuổi. Ghi nhận kiểu hình mắt theo hướng nhìn  thượng nguồn gene yki và gây ra sự biểu hiện <br /> từ một bên mắt và nhìn từ đỉnh đầu bằng máy  vượt mức YkiS168A tại mô mắt ruồi giấm (hình <br /> ảnh Canon PowerShot A2400IS và kính hiển vi  1a). Kết quả cho thấy, kiểu hình mắt của dòng <br /> soi nổi ZMZ600 (Nikkon, Nhật Bản).  ruồi biểu hiện vượt  mức YkiS168A  có sự  thay <br /> đổi màu sắc, tăng kích thước, tạo thành các nếp <br /> Nhuộm miễn dịch huỳnh quang nhăn trên bề  mặt và mất cấu trúc trật tự  của <br /> Thu nhận đĩa tiền phân sinh mắt của   ấu  các   mắt   đơn   cũng   như   gai   mắt   (hình   1b, <br /> trùng   bậc   ba.  Cố   định   mẫu   bằng  GMR>YkiS168A). Ruồi biểu hiện vượt mức một <br /> Paraformaldehyde   (PFA)   4%  trong  15   phút,   ở  protein ngoại lai khác là β­galactosidase tại mô <br /> 25oC.  Ủ  mẫu với kháng thể  kháng PH3 (Cell  mắt   (hình  1b,   GMR>lacZ)   và   ruồi   biểu   hiện <br /> Signaling,   Nhật   Bản)   (1:1000);   beta  Gal4 tại mô mắt (hình 1b, GMR>CS) cho kiểu  <br /> galactosidase   (Cell   Signaling,   Nhật   Bản)  hình mắt bình thường. Kết quả này khẳng định <br /> (1:500) trong 2 giờ ở 25oC. Sau đó ủ với kháng  kiểu hình mắt với kích thước to, màu sắc bất  <br /> thể   bậc   hai   có   gắn   chất   phát   huỳnh   quang   thường gây ra bởi sự  biểu hiện vượt mức   yki <br /> Alexa 488 (Invitrogen, Nhật Bản) (1:400) trong  trong mô mắt ruồi. <br /> 2 giờ   ở  25oC. Xem kết quả  dưới kính hiển vi <br /> huỳnh   quang   Olympus   BX41   (Olympus,   Hoa <br /> Kỳ).   Tín   hiệu   huỳnh   quang   được   phân   tích <br /> bằng phần mềm ImageJ, xử  lý thống kê bằng <br /> phần mềm GraphPad Prism 6.0.<br /> Đối   với   thí   nghiệm   chứng   minh   sự   biểu <br /> hiện yki trong đĩa phân sinh mắt ruồi, chúng tôi <br /> sử  dụng kháng thể  kháng V5 (một peptide tín <br /> hiệu   được   gắn   kèm   với   yki)   (cell   signaling, <br /> Nhật Bản) với tỷ  lệ  1:500. Các bước nhuộm <br /> kháng thể  bậc 2 và quan sát được thực hiện <br /> như mô tả bên trên.<br /> Thu nhận cao chiết cây thuốc bằng phương  <br /> <br /> 246<br />  phân   sinh   mắt   được   nhuộm   với   kháng   thể <br /> kháng V5 và kháng thể kháng β­galactosidase).<br /> Biểu  hiện  vượt  mức  YkiS168A  làm  tăng  tín <br /> hiệu PH3 tại đĩa tiền phân sinh mắt của ấu  <br /> trùng bậc ba<br /> Chúng   tôi   tiến   hành   nhuộm   miễn   dịch  <br /> huỳnh quang  đĩa  tiền phân sinh  mắt của   ấu <br /> trùng   bậc   ba   với   kháng   thể   kháng   PH3 <br /> (Phospho­Histone 3), dấu hiệu nhận biết giai  <br /> đoạn phân bào (M phase). Kết quả  cho thấy,  <br /> có sự tăng các tín hiệu huỳnh quang  ở sau lằn  <br /> phân sinh (MF­Morphogenesis Furrow) trên đĩa <br /> 1 mắt   của   dòng   ruồi   biểu   hiện   vượt   mức <br /> YkiS168A (hình 2, GMR>YkiS168A). Ngược lại,  ở <br /> hai   dòng   ruồi   đối   chứng   (hình   2,   GMR>CS, <br /> GMR>LacZ) các tế bào phát triển theo qui luật <br /> 2 bình thường, tế  bào  ở  sau lằn phân sinh (MF)  <br /> hầu như  ngừng phân chia và đi vào giai đoạn <br /> biệt   hóa.   Điều   này   cho   thấy,   sự   biểu   hiện <br /> vượt  mức  YkiS168A  đã gây ra các bất  thường <br /> trong điều hòa  chu kỳ  tế  bào, làm mất kiểm  <br /> 3 soát sự tăng sinh của tế bào. Chính điều này đã <br /> tạo nên kiểu hình mắt bất  thường  trên ruồi  <br /> trưởng thành.<br /> Các   kết   quả   trên   cho   thấy,   mô   hình  <br /> Hình 1. a. Hệ thống biểu hiện định hướng mô  ruồi   giấm   biểu   hiện   vượt   mức   YkiS168A  đã  <br /> GAL4/UAS.  b.  Ảnh hưởng của sự  biểu hiện  mô phỏng được đặc điểm mất kiểm soát trong <br /> vượt mức YkiS168A lên kiểu hình mắt (b1: mắt   tăng sinh của tế bào ung thư, và có triển vọng <br /> ruồi   nhìn   nghiêng   theo   chiều   thân;   b2:   mắt  để  phát triển thành mô hình sàng lọc sơ  cấp  <br /> ruồi nhìn thẳng theo chiều thân; b3: đĩa tiền  các cây thuốc tiềm năng cho hỗ trợ và điều trị <br /> ung thư.<br /> <br /> <br /> Hình 2. Sự biểu hiện vượt mức <br /> YkiS168A làm tăng tín hiệu PH3 <br /> trên đĩa tiền phân sinh mắt của <br /> ấu trùng bậc ba <br /> (****: p