Đề tài: Định tính Vibrio cholerae

Chia sẻ: Huỳnh Như Như | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

300
lượt xem 32
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Vibrio cholerae được nhà giải phẩu người Ý Kilippo Pacini xác định gây ra bệnh tả vào năm 1854, tuy vậy khám phá của ông không được công nhận rộng rãi đến khi Robert Koch nghiên cứu độc lập sau đó ba mươi năm và công bố thông tin về bệnh cũng như phương pháp phong chống.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài: Định tính Vibrio cholerae

Định tính Vibrio cholerae 1. Tổng quan về Vibrio cholerae: Vibrio cholerae được nhà giải phẩu người Ý Kilippo Pacini xác định gây ra bệnh tả vào năm 1854, tuy vậy khám phá của ông không được công nhận rộng rãi đến khi Robert Koch nghiên cứu độc lập sau đó ba mươi năm và công bố thông tin về bệnh cũng như phương pháp phong chống. Bệnh tả hầu hết có liên quan đến thực phẩm. Một nghiên cứu bệnh chứng của Viện Vệ sinh dịch tể Trung ương cho thấy các yếu tố gây nguy cơ cao là: ăn thịt chó,mắm tôm, rau sống, rau quả... đặc biệt là một số hải sản như cá, sò, ốc, hến được bắt từ nơi ô nhiễm hay dùng tay bẩn, dụng cụ ăn uống dơ bẩn, thức ăn tiếp xúc với ruồi, nhặng, chuột, dán,.. làm lây lan mầm bệnh. Hàng năm trên thời giới có khoảng 35 triệu c mắc tả, 100.000120.000 tường hợp tử vong. Vì vậy, việc tìm hiểu quy trình, phương pháp phân tích vi khuẩn Vibrio cholerae là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng và cộng đồng, Vibrio cholerae có thể được phất hiện thông qua nhiều phương pháp truyền thống hoặc phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử khác nhau. 1.1. Tình trạng ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Vibrio cholerae Tình hình dịch tả trên thế giới Bệnh tả được nói đến từ thời Hippocrates và Sanskrit, được mô tả lần đầu tiên bởi Garcia Huerto năm 1563 và được John Snow chứng minh được vai trò lây truyền của nước nước năm 1849. Trong vòng gần 200 năm qua loài người đã trải qua 7 vụ đại dịch tả: Đại dich tả lần thứ nhất (1816 1826): Bắt đầu từ Bengal sau lan sang Ấn Độ, Trung Quốc và biển Caspian. Đại dịch tả lần thứ hai(1829 !826): Naawm1831 dịch lan sang Luân Đôn (6.536 người chết, Pái (20.000 người chết trong tổng số 650.000 dân), tổng số tử vong toàn nước Pháp là 100.000 nguwoif. Sau dịch lan sang Liên Xô, Quebec, Ontario và New York.
Đại dịch tả lần thưa ba (1852 1860): xay ra ở nhiều vùng của Liên Xô, làm hàng triệu người chết. Ở Luân Đôn làm 10.738 người tư vong. Dịch xảy ra ở Chicago làm chết 5,5% dân số. Đại dịch lần thứ tư (1863 1875): Dịch xảy ra chủ yếu là ở Châu Au và Châu Phi. Dịch xảy ra ở Luân Đôn làm 5.596 người chết. Đại dịch tả lần thứ năm (1881 1896): Năm 1892 dịhj xảy ra ở Hamburg làm 8.600 người chết. Đây là vụ dịch lớn cuối cùng ở Châu Âu. Đaih dịch tả lần thứ sáu (18991923): Dịch ở Châu Âu giảm đi do các điều kiện về vệ sinh tốt hơn nhưng dịch vẫn xảy ra nặng nề ỏ các thành phố của Liên Xô. Đại tả lần thứ bảy (1961ngững năm bảy mươi): Dịch bắt đầu ở Indonẽia năm 1963, với chủng vi khuẩn El Tor, sau lan sang Bangladesh (1973), Ấn Độ (1964), Liên Xô (1966). Từ Bắc Phi dịch lan sang Italy năm 1973, Nhật Bản và Nam Thái Bình Dương. Từ 1/1991 – 9/1994, dịch xảy ra ở Nam Mỹ, bắt đầu ở Beru với 1trieeuj người mắc và 10.000 người chết, do chủng tả O1 E1 Tor gây nên, có khác một chút so với chủng tả của đại dịch lần thứ bảy là sự tái tổ hợp giữa chủng tả coorddieent và tả El Tor. Từ đó đến nay dịch xảy ra thường xuyên ở một số nước Châu Phi, Châu Á và Mỹ La Tinh. Tả là một mối đe dọa toàn cầu về y tế công cộng và là một trong những chỉ số về phát triển xã hội. Năm 2006, só ca tả báo cáo trên thới giới tăng lên đáng kể, taawng 79% so với năm 2005 với tổng số là 236.896 được báo cáo từ 52 nước, 6.311 trường hợp tử vong. Theo tổ chức Y tế Thế giới con số này chỉ chiếm 10% tổng số ca bệnh xảy ra trên thực tế. Năm 2014 dịch tả vẫn có chuyển biến phức tạp tai Trung Mỹ và các quốc gia ở Tây va Trung Phi. 1.2. Tình hình tả ở Việt Nam Bệnh tả lần đầu tiên xuất hiện ở Việt nam năm 1850 với 2 triệu trường hợp bệnh được thông báo. Từ năm 1910 1938, hàng năm số bệnh nhân mắc tả được thông báo dao động từ 5.000 30.000 người. Bệnh tả El Tor lần đầu tiên xuất hiện ở miền Nam , bệnh tả xảy ra dưới dạng dịch lưu hành . Hàng năm có hàng trăm bệnh nhân bị bệnh tả được thông báo. Năm 1994, bệnh tả xuất hiện đầu tiên ở Tây Nguyên với 1.459
bệnh nhân. Sau năm 1975, do việc thông thương giữa hai miền Nam, Bắc, bệnh tả đã lây lan ra miền Bắc và gây ra những vụ dịch tả rải rác Hải Phong. Từ năm 1993 2004, dịch xảy ra liên tiếp cả ba miền Bắc, trung , Nam với khoang vài nghìn ca bệnh được báo cáo hàng năm. Tuy nhiên, bệnh không bùng phát thành dịch lớn, có rất ít trường hợp tư vong. Các năm 2005 2006, cả nước không ngi nhận trường hợp nào. Từ cuối năm 2007,dịch lại bùng phát ở 19 tỉnh/ thành phố phía Bắc, hang ngàn trương hợp mắc nhưng không có trường hợp tử vong. Năm 2009 đã có 930.946 ca mắc tiêu chay, trong đó có người chết,. Năm 2008 có 453 ca bệnh tả , chết, năm 2009 có 853 người mắc tả,không có người chết, năm 2009 có 479 ca mắc tả, trong đó có một người chết, năm 2010 có 606 ca bệnh tả, không có người chết, năm 2011, có ba người mắc bệnh tả, không có người chết. Cuối tháng 7/2014, tại huyện Bình Chánh (TP.HCM) đã bung phát một ổ dịch tiêu chảy cấp khiến hơn 10 người mắc phải nhập viện điều trị, trong đó có một bệnh nhi tử vong. Kết quả xét nghiệm nuôi cấy và PCR phát hiên mẫ ốc bươu dương tính V. cholerae O1 tuýp huyết thanh Inaba. Theo điều tr người bán ốc lấy ốc ở chợ đầu mối Bình Điền giáp ranh với huyeenj Bình Chánh. Việc phát hiện vi khuẩn tả trong ốc bươu vàng có ngĩa nguồn nước đã bị nhiễm vi khuẩn này, có khả năng lây lan tromng cộng đồng. 1.3. Đặc điểm của Vibrio cholerae Virio cholera (còn gọi là Kommabaccillus) sih vật gram âm hình que hai đầu không đều nhau tạo hình dấu phẩy, di động, sống kị khí tùy ý có khả năng lên men glucose nhưng không sinnh hơi, không sinh H2S. V. cholerae có phản ứng oxidase (+), ADH(), LDC(+), lên men được sucrose, có thể tăng trưởng được trong môi trường chứa 03% NaCl,không phát triển được trong môi trường chứa 6, 8, 10% muối. Vibrio choleaevaf các loài thuộc chi Vibrio Proteobacteria. Có hai chủng Vibrio cholerae chính, chủng cổ điển và chủng El Tor, và một sô nhóm huyết thanh (serogroup) khác. Vbrio cholerae thuộc họ Vibrionaceae, là vi khuẩn có hình cong như dấu phẩy, bắt màu gram âm, không có vỏ, không sinh nha bào , di dộng dược nhờ có lông, khuẩy khuẩn dễ nuôi cấy trong môi trường nghèo dinh dưỡng, pH kiềm (8,5 9) và mặn ở môi trường thích hợp như trong nước, thức ăn trong các đọng vật biển ( cá, cua, ốc,sò
biển,..).. nhất là ở nhiệt độ thấp, khuẩy khuẩn tả có thể sống được vài ngày đến 2,3 tuần. dễ bị diệt ở nhiệt độ (85oC/ 5 phút), bởi hóa chất thông thường và môi trường axit. Vibrio cholerae có mặt trong nước, sữa, thực phẩm, thủy sản, côn trung,.. sinh độc tố ruột và nội độc tố trong dường tiêu hóa. Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt hóa emzyme andenylcyclase dẫn đến tăng AMP vogf, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl và nước gây tiêu chảy cấp tính. Phẩy khuẩn tả có thể chuyển hóa trong thiên nhiên, thay đổi tính di truyền do đọt biến từ chủng không gây dịch có thể thành chủng gây dịch và kháng nhiều loại kháng sinh. Là vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên , gây dịch tả, dịch bệnh dễ phát sinh nơi nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm trùng. V. cholerae có khòagr 140 nhóm huyết thanh và được chia thành V. choleraeO1 và Vi. Cholerae noO1(V. cholerae không ngưng kết với O1 còn được gọi là chủng NAG). V.cholerae O1 được phân thành 2 typ sinh học (biotyp) dựa theo đặc điểm kiểu hình là V. cholerae classica và V. cholerae Eltor. Dựa vào đặc điểm các quyết định kháng nguyên A,BC của kháng nguyên O, V. cholerae được phân thành 3 typ huyết thanh (sero typ) sau: Serotyp Ogawa ( có quyết định kháng nguyên A,B). Serotyp Inaba ( có quyết định kháng nguyên A, C0. Serotyp Hikojima ( có ca ba quyết định kháng nguyên A, B,C). V. choleraenon O1 nhóm huyết thanh O139 là thủ phạm gây dịch tả ở Án Độ và một số nước ở Châu Á từ năm 1992 đến nay. Phẩy khuẩn tả gây bệnh nhờ độc tố tả ( choleragen). Đây là nội đọc tố có cấu trúc gồm hai đơn nguyên: đơn nguyên A ( trọng lượng phân tử là 27.000 dalton, mang độc tính cao) và đơn nguyên B có tính kháng nguyên đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác dụng kích thích tăng AMP vong ( Adenosin 3,5Cyclic môn phosphat. 2. Các phương pháp phân tích vi khuẩn Vibrio cholerae 2.1. Phương pháp truyền thống 2.1.1. Môi trường nuôi cấy
Các phương pháp truyền thống xác định các loài Vibrio trong thực phẩm theo tiêu chuaamr hiện nay (ISO) cũng đã được phổ biến, ISO/TS 218721:2007 dùng để xác định V. cholerae. Phương pháp thường dùng môi trương chứa muối với pH khoảng 8.6 như môi trường tăng sinh nước peptone kiềm ( alkaline saline peptone wate). Môi trường phân lặp thương dùng là TCBS, các khuẩn lạc của V. cholerae trên môi trường này thương có đặc điểm là tròn bóng và có màu vàng. Tuy nhiên các phát hiện gần đay cho thấy môi trường TCBS có hạn chế là không phát hiện được các chủng V. cholerae lên men saccharose chậm dẫn đến sai sót trong phát hiện . Một môi trường đặc hiệu hơn cần quan tâm là môi trường tạo màu ( chromogenic arga media) theo cơ chế enzyme như chromIDTTM Vibrio arga (bioMesrieus) hay CHROMargaTM Vibrio có thể phát hiện cả chủng lên men saccharose chậm. Nguyên tắc Một lượng mẫu xác định ( 10g hoặc 25g) được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng. Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trương phân lập dược khẳng định băng các phản ứng sinh hóa và huyết thanh học . Môi trường tăng sinh chọn lcoj cho V. cholerae là TCBS ( Thiosalphate Citrate Bile Sucrose Argar). Các vi sinh vật lên men dược surose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm axits hóa môi trương bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật không lên men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc mù xanh. 2.2. Phương pháp phân tích hiện đại 2.2.1. Phương pháp miễn dịch học – ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assays) ELISA (EnzymeLinked Immunosorben Asa) hay EIA ( Enzyme Immunosorbent) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫ xét nghiệm. kỹ thuật ELISA có thể được sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng V. harveyi trên tôm, mẫu nuwowcsvaf có thể xác định tất cả các dòng Vibrio spp. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyentawcs bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể và gồm các bước cơ bản sau: Kháng nguyên chưa biết được gắn trên một bề mặt.
Kháng thể biết trước được “rữa” qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn Enzyme. Thêm vào cơ chất (substance): enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu. Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate). Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt đĩa. Phương thức đặc hiệu (“sandwich” ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiêm tra. Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phanr ứng tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể có thể xảy ra. Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation ) kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này. Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng “rửa”. Sau bước “ rửa” cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hơn kháng nguyênkháng thể. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất ) sẽ xảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Có những phương pháp ELISA như sau: ELISA gián tiếp (inderect ELISA), Sandwich ELISA, ELISA cạnh tranh (Competive ELISA)
Phương pháp PCR (Polymer Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. Đây là phương pháp intro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa vào hoạt động của các dNTP tự do là enzyme polymerase, sau 2035 chu kì có thể nhân được khi biết rõ các trình đặc hiệu ở 2 đầu DNA cần nhân gen (đoạn khuôn) để có thể thiết kế các cặp mồi đặc hiệu. Hiện nay có thể sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đoán nhanh bệnh do Vibrio spp trong vài giờ mà không mất nhiều thời gian đê phân lập vi khuẩn. Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp này là phát hiện một DNA đặc hiệu cho Vibrio spp. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn.Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Trong một phản ứng PCR để khuếch đại một trình tự đặc biệt nào đó, ta cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự đó để thiết kế các mồi bổ sung ở hai đầu mạch bao gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene. Một khi được cung cấp hai mồi bổ sung ở hai đầu, phản ứng sẽ cho ra hàng loạt bản sao của đoạn DNA nắm giữa hai mồi đó. Các giai đoạn của PCR Một phản ứng PCR làm một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính: trong một dung dịch phanr ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao trong vòng 30 giầy 1 phút, thường là ở 94oC. Giai đoạn bắt cặp: ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này giao động trong khoảng từ 300C700C khoảng 4060 giây. Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 720C cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy
thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại thường kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút. Trong phản ứng PCR, chu kỳ ba giai đoạn sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng bản sao gấp đôi. Sự khuếch đại của phản ứng là theo cấp số nhân và theo tính toán, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu. Sau phản ứng PCR, các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy thông qua điện di sản phẩm trong agarose và quan sát dưới tia UV. Phương pháp này sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là lai phân tử. Quá trình bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy của DNA (T m) và sự tái bắt cặp của các đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong 2 mạch DNA bổ sung được cố định trên giá thể rắn và nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với một trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động của nhiệt độ và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn T m ít nhất vài độ.
Phạm vi ứng dụng Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 79051:2008 (ISO 218721:2007 dùng để phát hiện V. cholerae trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Nguyên tắc Phát hiện V. cholerae trong thực phẩm đượ c thực hiện bằng cách cân một lượng mẫu xác định và nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc. Từ đây dịch khuẩn được cấy chuyển sang môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc giống V. cholerae sẽ được thí nghiệm phản ứng sinh hóa. Môi trường và môi chất Môi trường và hóa chất Mục đích APW (Alkaline Phosphat Water) Tăng sinh chọn lọc TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose) Phân lập NA/KSA Phục hồi TSI/KIA Đĩa giấy Oxidase Khẳng Định sơ bộ Dung dịch NaCl KOH 3% Thử String test sinh hóa để khẳng định Arginine dehydrolase Ornithine Decarboxylase Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định sơ Lysine Decarboxylase bộ TW (Tryptone Water) ONPG Kowac’s Thuốc thử Indol HCL và NaOH (KOH) 10% Chỉnh pH