Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của V. cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

99
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án nhằm xác định các kháng sinh còn nhạy cảm với Vibrio cholerae nhằm giúp cơ sở y tế chọn những loại kháng sinh điều trị bệnh tả có hiệu quả trên người. Luận án là cơ sở khoa học cho việc lựa chọn chủng vi khuẩn có đột biến để sản xuất vaccine phòng bệnh tả trên người; cung cấp thông tin giúp cảnh báo về khả năng gây bệnh trên người của các chủng Vibrio spp; trong các nguồn nước, nguồn thực phẩm có nguồn gốc thủy hải sản tại tỉnh Trà Vinh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của V. cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ ĐẤU MSHV: 62031005 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 CẦN THƠ, 2015
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường tại Đại học Cần Thơ Vào……giờ…….., ngày……tháng……..năm………. Có thể tìm luận án tại: Thư viện Quốc gia Trung tâm học liệu trường Đại học Cần Thơ
Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm, tác nhân của bệnh dịch tả trên người, gây tiêu chảy cấp tính và mất nước, dịch bệnh xảy ra với các hình thức dịch địa phương và đại dịch. Thế giới đã trải qua 7 đại dịch dịch tả, từ năm 1816 đến năm 1923 đã có 6 vụ đại dịch xảy ra, những đại dịch này đều bắt đầu từ Ấn Ðộ và đều do V. cholerae O1 type sinh học cổ điển gây ra. Đại dịch thứ 7 khác với 6 đại dịch trước, đại dịch này do V. cholerae type sinh học El Tor gây ra và có nguồn gốc từ đảo Celebes của Indonesia năm 1961. Đại dịch này kéo dài nhất và có phạm vi rộng hơn 6 đại dịch trước đó, đến nay còn nhiều nước thông báo những đợt bùng phát dịch tả cũng do nguyên nhân này gây ra (Hayes, 2005). Đồng bằng sông Cửu Long, tính đến 19/8/2010 đã có 4 địa phương gồm: Bến Tre, Tiền Giang, thành phố Cần Thơ và An Giang xuất hiện bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy do vi khuẩn V. cholerae (Nguyễn Hoàng Vũ, 2011). Tỉnh Trà Vinh có vị trí địa lý với nhiều nguy cơ tiềm ẩn bệnh dịch tả vì có bờ biển kéo dài khoảng 65 km và trên địa bàn Trà Vinh có hệ thống sông chính với tổng chiều dài 578 km, trong đó có các sông lớn là sông Hậu, sông Cổ Chiên và sông Măng Thít, vì thế rất dễ cho việc lưu hành vi khuẩn tả từ sông Cổ Chiên giáp với tỉnh Bến Tre, nơi đã từng xảy ra dịch bệnh vào năm 2010. Có nhiều loại kháng sinh sử dụng điều trị bệnh tả đang đề kháng với vi khuẩn này, trong đó có V. cholerae, đây là vấn đề phức tạp trong điều trị bệnh và là mối quan tâm đối với sức khỏe cộng đồng. Nhiễm sắc thể được chứng minh là yếu tố di truyền về gene kháng kháng sinh của vi khuẩn. Việc thu nhận và lây truyền của các gene kháng kháng sinh là do các yếu tố di truyền như plasmid, integrons và transposons (Ghosh et al., 2011). Một trong những yếu tố di truyền được tích hợp và sao chép trên nhiễm sắc thể và được truyền gene kháng kháng sinh giữa các vi khuẩn cùng loài trong môi trường (Burrus et al., 2004). Xuất phát từ những vấn đề trên, nghiên cứu được thực hiện với nội dung: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của V. cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh”, từ đó giúp cơ sở y tế có chiến lược sử dụng kháng sinh đúng nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm chi phí trong điều trị bệnh, phù hợp với điều kiện kinh tế trong khu vực. 1.2 Mục tiêu: Xác định tỉ lệ nhiễm và type huyết thanh học của các chủng V. cholerae trên những mẫu phân lập được; xác định đặc tính kháng 1
kháng sinh của các chủng V. cholerae và các kiểu đột biến gene gây kháng thuốc; đánh giá quan hệ di truyền giữa các chủng phân lập với các chủng đã công bố và tính đáp ứng miễn dịch với V. cholerae ở thỏ đã được chủng vaccine đang lưu hành trên thị trường. 1.3 Ý nghĩa của luận án: Xác định các kháng sinh còn nhạy cảm với Vibrio cholerae nhằm giúp cơ sở y tế chọn những loại kháng sinh điều trị bệnh tả có hiệu quả trên người. Kết quả của luận án là cơ sở khoa học cho việc lựa chọn chủng vi khuẩn có đột biến để sản xuất vaccine phòng bệnh tả trên người; cung cấp thông tin giúp cảnh báo về khả năng gây bệnh trên người của các chủng Vibrio spp. trong các nguồn nước, nguồn thực phẩm có nguồn gốc thủy hải sản tại tỉnh Trà Vinh. 1.4 Những điểm mới của luận án Là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Đồng bằng sông Cửu Long phân lập được 6 chủng V. cholerae trên các loại mẫu thức ăn từ hải sản và mẫu từ môi trường nước sông và nước ao nuôi tôm; xác định được type huyết thanh học của V. cholerae là Ogawa và Inaba; xác định được sự tương đồng về trình tự nucleotide của các chủng V. cholerae phân lập được với trình tự nucleotide của những chủng V. cholerae ở các nước thuộc vùng Đông Nam Á; xác định được gene kháng tetracycline của V. cholerae phân lập được. Bố cục của luận án Luận án gồm 108 trang (không kể phần phụ lục), chia thành các phần như sau: Chương 1: Giới thiệu (4 trang); Chương 2: Tổng quan tài liệu (42 trang); Chương 3: Nội dung, phương tiện và phương pháp nghiên cứu (18 trang); Chương 4: Kết quả và thảo luận (43 trang); Chương 5: Kết luận và đề nghị (1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang). Luận án có 35 bảng, 40 hình. Tổng tài liệu tham khảo là 180, gồm 09 tài liệu tiếng Việt, 171 tài liệu tiếng Anh và 11 tài liệu tham khảo từ trang Web. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả Năm 1816 bệnh xuất hiện tại Châu Âu và Mỹ, đến đầu thế kỷ 20 đã có 6 đại dịch tả lan khắp thế giới. Tiếp đó, đến những năm 60 phạm vi gây bệnh của vi khuẩn tả đã được khoanh vùng và cho đến những năm gần đây bệnh chủ yếu xuất hiện ở Đông Nam Á. Năm 1961 type sinh học El Tor gây dịch tại Philippines và tạo làn sóng thứ bảy. Từ đó trở đi type vi khuẩn 2
này tiếp tục gây những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và một phần Châu Âu (Colwell, 2004). Từ năm 1991, tỉ lệ mắc bệnh tả do vi khuẩn V. cholerae O1 đã xảy ra ở Châu Mỹ La tinh (Levine, 1991; Ries et al., 1992), đến năm 1992 bệnh lại xuất hiện và lây lan nhanh chóng bởi V. cholerae O139 trong khu vực Đông Nam Châu Á (Shimada et al., 1993) và gần đây bệnh lại bùng phát ở châu Phi, do type huyết thanh non-O1, non-O139, đây cũng là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy (Sharma et al., 1998). Các nghiên cứu về sự tiến hóa phân tử chủng V. cholerae O1 ở Peru từ năm 1991-1995, Ấn Độ, và ở Thái Lan cho thấy rằng V. cholerae O1 đã trải qua những thay đổi về di truyền ở mức tương đối cao. Những thay đổi này rất quan trọng trong việc tìm hiểu về dịch tễ học và sự tiến hóa của V. cholerae (Dalsgaard et al., 1999). Tháng 12 năm 1992 một vụ dịch lớn lại xảy ra ở các nước, vi khuẩn gây bệnh được xác định là V. cholerae O139 Bengal. Về mặt di truyền, O139 Bengal hình thành từ type sinh học El Tor nhưng cấu trúc kháng nguyên của chúng cũng biến đổi. Tất cả ở mọi lứa tuổi trên người (kể cả trong vùng đã có dịch) đều có thể bị nhiễm, vi khuẩn V. cholerae O139 đã gây bệnh ít nhất 11 nước ở Đông Nam Á đến năm 2005 (Garg et al., 2003). Ở Việt Nam bệnh tả là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra tiêu chảy từ những năm 1850. Năm 1885, một đợt bùng phát dịch tả lại xảy ra và đến năm 1910-1930 bệnh tả đã được báo cáo hàng năm (Nguyen, 1962). Đến năm 1964 V. cholerae O1 type sinh học El Tor lại gây bệnh ở miền Nam Việt Nam. Trong lịch sử, phần lớn các đợt dịch bệnh tả đều xuất hiện ở các khu vực ven biển miền Trung và Nam Việt Nam. V. cholerae O1 type sinh học El Tor hiếm khi xuất hiện ở Bắc Việt Nam. Đến năm 1976, bệnh có xảy ra tại thành phố Hải Phòng và tỉnh Quảng Ninh (Dalsgaard et al., 1999). Từ năm 2007 đến năm 2008 và năm 2010, một chủng vi khuẩn V. cholerae O139 được phân lập từ 7 mẫu nước và được đặt tên là V. cholerae O139. Tuy có sự lây lan nhanh chóng của O139 trong khu vực Đông Nam Á nhưng ở Việt Nam, có rất ít thông tin về bệnh tả do O139 gây ra (Dong Tu Nguyen, 2012). 2.2 Phân loại – Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae 2.2.1 Phân loại vi khuẩn V. cholerae V. cholerae là vi khuẩn Gram âm gây bệnh tả ở người, thuộc chi Vibrio lớp Gammaproteobacteria. V. cholerae có hai type sinh học chính, đó là type sinh học cổ điển và type sinh học El Tor, và một số nhóm type huyết thanh khác. V. cholerae được phân loại căn cứ trên kháng nguyên O ở 3
phần thân và các nhóm huyết thanh, đến nay người ta đã biết có ít nhất 200 nhóm huyết thanh (Kaper et al., 1995). Trước năm 1992, nhóm O1 là nhóm huyết thanh duy nhất gây ra dịch, từ năm 1992 về sau một nhóm huyết thanh khác là O139 gây ra các đại dịch bùng phát tại Ấn Độ và Bangladesh. Hiện nay, 2 nhóm huyết thanh này là nguyên nhân gây bệnh tả lưu hành và phát thành dịch; những nhóm huyết thanh V. cholerae khác không gây thành dịch được gom chung lại thành nhóm V. cholerae non-O1 và non-O139. V. cholerae O1 còn được phân ra 3 type huyết thanh, Ogawa, Inaba và Hikojima; type thứ 3 này ít gặp, các type huyết thanh này được chia thành 3 loại kháng nguyên (KN): A, B và C. 2.2.2 Đặc điểm hình dạng của Vibrio cholerae Vi khuẩn V. cholerae còn gọi là vi khuẩn tả hay phẩy khuẩn tả, có chiều dài từ 1μm đến 3 μm và chiều ngang từ 0,5 μm đến 0,8 μm (1mm = 1.000 μm). Chúng có 1 sợi chiên mao (flagellum) ở một đầu giúp chúng di chuyển rất nhanh theo hình xoắn ốc loạng choạng. Vi khuẩn tả có 2 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên H (flagellar) và kháng nguyên O từ thân vi khuẩn (somatic O antigen). Hình 2.1: Cấu tạo vi khuẩn V. cholerae. (Korinfo, 2000) 2.2.3 Đặc tính di truyền về độc lực của Vibrio cholerae Sự xuất hiện của TCP và độc tố vi khuẩn tả được điều khiển bởi các yếu tố di truyền bao gồm toxR, tcpH, tcpP, và toxT. Tất cả những yếu tố di truyền này hợp lại thành đặc tính có độc lực của V. cholerae, đặc tính này có liên quan đến tính di động, khả năng định vị trong ruột, và sự sản xuất độc tố. Khi V. cholerae được tìm thấy trong phân của bệnh nhân, điều đó cho thấy có sự sao chép di truyền của V. cholerae rất độc và rất dễ lây lan. Quá trình tiến hóa của V. cholerae gây bệnh lý có 2 giai đoạn quan trọng: trước hết, các chủng V. cholerae tiếp nhận phage TCP và biến thành V. cholerae TCP +. Sau khi trở thành TCP+, tức là vi khuẩn có tua, tua sẽ 4
đóng vai trò thụ thể cho phage CTXΦ để cho phage chui vào vi khuẩn, và gắn DNA của nó vào nhiễm sắc thể của V. cholerae theo cơ chế phage tiềm tan (lysogenic). Bản chất của các gene CTX và TCP đều là bacteriophage từ bên ngoài được gắn vào trong nhiễm sắc thể của V. cholerae. V. cholerae vốn là vi khuẩn “hiền” nhưng khi bị các bacteriophage gây nhiễm chúng mới trở thành chủng sinh độc tố và gây bệnh lý. V. cholerae trở thành chủng sinh độc tố (toxicogenic V. cholerae) và gây bệnh khi chúng có tiêm mao giúp vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột non. Hình 2.2: Sự hình thành chủng V.cholerae có độc tố (Blake, 1994) 2.2.4 Các yếu tố về độc lực V. cholerae sử dụng hai yếu tố độc lực, độc lực từ tiêm mao/roi (TCP) và độc tố tả CTX. TCP, mã hóa cho các yếu tố gây bệnh, là một loại protein từ tiêm mao (Kirn et al, 2000), TCP cũng rất cần thiết cho sự hình thành khuẩn lạc của V. cholerae định vị trong ruột non của chuột sơ sinh (Taylor et al., 1987) và con người (Herrington et al., 1988). Khi sự hình thành khuẩn lạc trong ruột non thành công, V. cholerae sẽ tiết ra độc tố gây bệnh tả. Các độc tố kích thích các tế bào biểu mô ruột non tiết ra dịch lỏng trong lòng ruột non, từ đó có hiện tượng tiêu chảy mất nước. Do đó, sự đột biến ở roi của một số chủng V. cholerae sẽ ảnh hưởng đến yếu tố độc lực TCP, Hình sau biểu hiện sự biến đổi về roi. 5
a. Roi dài b. Không có roi c. Roi ngắn a. Chủng vi khuẩn hoang dại; b. Vi khuẩn đột biến gene; c. Vi khuẩn đột biến gene Hình 2.3: Vi khuẩn đột biến roi (Ewen, 2008) Nếu vi khuẩn mang gene đột biến sẽ dẫn đến khiếm khuyết trong việc lắp ráp roi (flagellum). Qua Hình trên, đối với loài hoang dại (Hình 2.3a) không mang gene đột biến nên chiều dài roi dễ dàng nhìn thấy qua hiển vi điện tử; Hình (2.3b) vi khuẩn mang gene flgT đột biến nên không hình thành roi; Hình (2.3c) vi khuẩn có roi ngắn hơn cũng do hiện diện gene đột biến roi fliA. Chương 3: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu Phân lập, định danh, tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. trên các loại mẫu tại tỉnh Trà Vinh; định type huyết thanh học vi khuẩn V. cholerae phân lập được; giải trình tự nucleotide vi khuẩn V. cholerae dựa trên gene 16S rDNA; xác định gene kháng kháng sinh vi khuẩn V. cholerae được tuyển chọn; thử nghiệm chủng V. cholerae phân lập được trên thỏ nhằm đánh sự đột biến của V. cholerae và khả năng đáp ứng miễn dịch đối với vaccine hiện hành. Thời gian nghiên cứu từ tháng 10/2012 – 4/2014 tại Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Đại học Cần Thơ; Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Đại học Cần Thơ; Khoa Nông nghiệp – Thuỷ sản trường Đại học Trà Vinh; mẫu gửi giải trình tự tại công ty Macgrogen Hàn Quốc. 6
3.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1.1 Hoá chất, môi trường nuôi cấy vi khuẩn Nước cất, nước muối sinh lý (NaCl 0,9%), thuốc thử Kowacs, cồn 96o, cồn 70o, muối tinh khiết, alkaline saline peptone water (ASPW) với các nồng độ từ 0-10%. Môi trường chuyên chở mẫu bệnh phẩm: Cary- Blair (India); môi trường nuôi cấy: TCBS: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muối- Sacaroza (Merck); SNA: Saline Nutrient Agar (Merck); môi trường làm kháng sinh đồ: MHA (Muller Hinton Agar), đĩa giấy tẩm kháng sinh (Nam Khoa, Tp. HCM). Môi trường và hóa chất dùng phân lập vi khuẩn: đĩa giấy oxidase, đĩa giấy ONPG, TSI agar (Saline triple sugar iron agar), ADH (Arginine Dihydrolase), Tryptophan saline (Bộ định danh vi khuẩn Gram âm: IDS 14GNR, Nam Khoa, Tp.HCM). 8 loại đĩa kháng sinh sử dụng: streptomycin (10μg), norfloxacin (10μg), ampicillin (10μg), tetracycline (30μg), azithromycin (30μg), amoxicillin-clavulanic axit (30μg), trimethoprim-sulfamethoxazole (25μg) và vancomycin (30μg); bộ thuốc nhuộm Gram: dung dịch crystal violet; lugol; cồn - aceton; safranin (Germany); kháng huyết thanh định type V. cholerae: Inaba, Ogawa và O139; (Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh). 3.2.1.2 Hoá chất, sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR Xác định vi khuẩn dựa trên đoạn gene 16S rDNA Bảng 3.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR dựa trên gene 16S rDNA. Trình tự nucleotide của mồi (5'3') Độ dài (bp) Mồi Mồi xuôi // Mồi ngược 27F AGAGTTTGATCCTGGCTC’ 1500 1492R TACGGTTACCTTGTTACGACT ctxA-F CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG 302 ctxA-R TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG O139rfb-F AGCCTCTTTATTACGGGTGG O139rfb-R GTCAAACCCGATCGTAAAGG 449 (1) Weisburg et al., (1991); (2)-(3): Alam et al., (2006) Xác định gene kháng kháng sinh 7
Hoá chất ly trích DNA: Tris-HCl, EDTA, H20; hoá chất PCR: Buffer, MgCl2, dNTPS, DMSO, Taq polymerase và các cặp mồi xác định gene kháng kháng sinh. Bảng 3.2: Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR xác định gene kháng kháng sinh. Gene Trình tự nucleotide của mồi Độ dài Nhóm được (5'3') (bp) kháng sinh kiểm tra Mồi xuôi // Mồi ngược β-Lactam TCGCCTGTGTATTATCTCCC 768 blaSHV CGCAGATAAATCACCACAATG aac(3)- GTGTGCTGCTGGTCCACAGC 286 Aminoglycosid IV AGTTGACCCAGGGCTGTCGC GTGAAACCC AACATACCCC 888 Tetracycline tetA GAAGGCAAGCAGGATGTAG AAGAATGGAGTTATCGGGAATG 931 Trimethoprim dhfrI GGGTAAAAACTGGCCTAAAATTG (Maynard et al., 2005) 3.2.1.3 Vật liệu nghiên cứu - 160 mẫu nghêu thu từ huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang; 100 mẫu huyết heo thu từ các cơ sở giết mổ heo tại Thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang và huyện Càng Long; 40 mẫu phân lấy từ bệnh nhân tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa tỉnh Trà Vinh; 150 mẫu nước thu từ sông, nước biển và các địa điểm nuôi tôm; 50 mẫu tôm thu từ huyện Duyên Hải. Tất cả các mẫu được bảo quản trong thùng trữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm để nuôi cấy, phân lập. - Vaccine tả uống (mORCVAX) điều chế từ các chủng vi khuẩn tả gồm type sinh học Cổ điển và type sinh học El Tor và chủng vi khuẩn tả O139 (Công ty TNHH MTV Vaccine và Sinh phẩm số 1, Hà Nội); 24 thỏ trắng giống New Zealand, trọng lượng 2-2,5kg/con. 3.2.1.4 Thiết bị - Dụng cụ Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, autoclave, máy lắc, buồng cấy vô trùng và kính hiển vi, cân điện tử, ống nghiệm, đĩa petri, chai, ống đong, ống hút, lam, kẹp, kéo, tăm bông vô trùng, găng tay, đèn cồn, túi nilon. 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.2.1 Phương pháp phân lập, định danh vi khuẩn * Phương pháp lấy mẫu 8
Mẫu nghêu: nghêu được thu mua tại các chợ huyện Duyên Hải và Cầu Ngang, nghêu còn tươi (25gram/con), rửa sạch chất bẩn bên ngoài, lấy phần thịt cắt nhuyễn (1gram) tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW. Mẫu huyết heo: được thu từ các cơ sở giết mổ thuộc Thành phố Trà Vinh và các huyện: Châu Thành, Duyên Hải, Cầu Ngang và Càng Long, ở mỗi cơ sở đều lấy 25 ml mẫu/lần có pha nước muối với tỉ lệ 0,5%, mẫu được chuyển về phòng thí nghiệm, sau đó hút l ml mẫu đem tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW . Mẫu nước: được thu trên bề mặt nước tại các ao nuôi tôm, nước sông, nước biển (mỗi loại 25 ml mẫu), sau đó lấy 1ml nước tăng sinh trong 9ml môi trường ASPW. Mẫu tôm: được thu từ huyện Duyên Hải, tôm còn tươi (150gram/con) tôm được rửa sạch lấy phần đầu, cắt nhuyễn 1gram mẫu, lọc lấy dịch trong và tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW. Mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy: dùng tăm bông vô trùng lấy phân của bệnh nhân tiêu chảy, bảo quản ở môi trường vận chuyển Carry-Blair, và chuyển về phòng thí nghiệm để nuôi cấy, phân lập. * Phương pháp nuôi cấy Các loại mẫu đều được nuôi tích lũy 2 lần trong môi trường ASPW. 1 ml mẫu được tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW ủ lần 1 ở 370C từ 6-8 giờ. Sau đó lấy 1 ml từ môi trường trên cho vào 9 ml môi trường ASPW ủ lần 2 ở 41,50C từ 16-18 giờ; sau đo phân lập trên môi trường chuyên biệt TCBS ở 370C/ 24 giờ: khuẩn lạc có thể có màu vàng/xanh. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trường thạch dinh dưỡng có muối (SNA), trên SNA khuẩn lạc Vibrio spp. tròn, trơn, láng, màu trắng sữa. a. Xác định V. cholerae bằng phản ứng sinh hóa (quy trình ISO/TS 21872-1:2007) Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng để phát hiện hay phân biệt các loài Vibrio được thực hiện theo quy trình ISO/TS 21872-1:2007 (E). Chọn khuẩn lạc trên SNA để thử nghiệm các phản ứng với oxidase; kiểm tra tính lên men đường glucose/lactose; khả năng sinh hơi và sinh H2S; thử phản ứng sinh Indole và sự di động. Thử tính ưa mặn của Vibrio spp. ở các nồng độ NaCl khác nhau (0%, 2%, 6%, 8% và 10%). 9
* Nhuộm Gram: Vi khuẩn Vibrio spp. thuộc nhóm Gram âm nên sau khi nhuộm Gram vi khuẩn bắt màu hồng nhạt và có hình que ngắn, sau đó xem dưới kính hiển vi điện tử. b. Xác định chủng V. cholerae bằng máy định danh tự động (Vitex 2 compact- Biomerieux - BVĐK Trung ương Cần Thơ). Nguyên lý định danh vi sinh vật là dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh hoá của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng môi trường có sẵn trong thẻ (card). Các thẻ định danh được phủ hoá chất tối đa 64 giếng, các giếng có hoá chất đặc biệt phù hợp với tính chất sinh hoá của vi sinh vật khác nhau. c. Phương pháp định type huyết thanh học Việc định type huyết thanh của V. cholerae được thực hiện bằng phản ứng ngưng kết với 4 loại kháng huyết thanh Inaba, Ogawa, O139 và kháng huyết thanh đa giá Inaba + Ogawa + O139 (Trần Linh Thước, 2009) d. Xác định vi khuẩn Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR Các gốc vi khuẩn thuần được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR, dựa trên gene 16S rRNA. Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1X ở điện thế 100V trong 90 phút và chụp bằng máy chụp hình gel Biorad UV 2000, thang chuẩn 100 bp (công ty Fermentas). 3.2.2.2 Phân tích trình tự gene 16S RNAvà thiết lập cây di truyền. Sản phẩm PCR (DNA) ký hiệu 6 trình tự của 6 chủng thuộc Vibrios: V. cholerae-Ng3, V. cholerae-O3.2, V. cholerae-O1.2, V. cholerae-81V1, V. cholerae-N8 và V. cholerae-85V1, được giải trình tự tại công ty Macrogen Inc (Hàn Quốc). Các trình tự được phân tích và đọc bằng phần mềm Bio.Edit, sau đó so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên Genbank và thiết lập cây di truyền. 3.2.2.3 Xác định sự kháng kháng sinh của vi khuẩn V. cholerae a. Xác định sự kháng kháng sinh bằng PP Kirby Bauer * Chọn 08 loại kháng sinh thường được sử dụng để điều trị bệnh ở đường ruột, đặc biệt là bệnh tả. Sau khi ủ 18 đến 24 giờ, đo đường kính vùng ức chế, kể cả đường kính khoanh giấy kháng sinh và đọc kết quả dựa vào bảng tiêu chuẩn đánh giá sự nhạy cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn đường ruột (CLSI, 2010). b. Xác định sự kháng kháng sinh của V. cholerae bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 10
Sau khi ly trích DNA, tiếp tục xác định gene kháng kháng sinh bằng kỹ thuật PCR với các trình tự cặp mồi tương ứng với gene kháng kháng sinh gồm blaSHV, aac(3)-IV, tetA và dhfrI. Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1.5% trong dung dịch đệm TBE 1X ở 100V trong 90 phút và chụp bằng máy chụp hình gel Biorad UV 2000, thang chuẩn 100 bp (công ty Fermentas). 3.2.2.4 Phân tích trình tự gene kháng kháng sinh và thiết lập cây di truyền. Sản phẩm PCR (DNA) xác định gene kháng kháng sinh sau đó được giải trình tự tại công ty Macrogen Inc (Hàn Quốc). Các trình tự được phân tích, đọc bằng phần mềm Bio.Edit, so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên Genbank và thiết lập cây di truyền. 3.2.2.5 Thử nghiệm chủng V. cholerae phân lập và đáp ứng miễn dịch trên thỏ đối với vaccine tả. Phương pháp thí nghiệm * Thử nghiệm độc lực và đáp ứng miễn dịch: 12 thỏ thí nghiệm cho uống vaccine tả với liều 1,5 ml/con, lặp lại lần 2 vào ngày thứ 14. Sau 28 ngày uống vaccine, thực hiện mổ khám; 12 thỏ không cho uống vaccine nhưng chế độ nuôi dưỡng như nhau. Tiêm các chủng vi khuẩn đã phân lập (N8, O3.2, O1.2, Ng3, 85V1 và 81V1) vào ruột thỏ không uống vaccine và thỏ đã uống vaccine như nhau, sau đó mổ khám xác định tính đáp ứng miễn dịch của các lô thí nghiệm trên. Thỏ được gây mê để phẫu thuật, ruột non được cột thành 4 đoạn, mỗi đoạn 10 cm, cách nhau 2 cm. Dùng kim tiêm 1 ml vi khuẩn (có chứa 1 x 105 - 5 x 107 CFU) vào trong lòng từng đoạn ruột, đóng xoang phúc mạc, kiểm tra chất lỏng ở các thời điểm 3, 6, 9, và 16 giờ sau khi tiêm. Các chỉ tiêu theo dõi: (i) Xác định ti lệ dịch lỏng (FA: Fluid accumulation): Tỉ lệ dịch lỏng tích tụ trong các đoạn ruột được xác định bằng số lượng dịch lỏng (ml)/chiều dài đoạn ruột của thỏ (cm). (ii) Sự bám dính vi khuẩn vào bề mặt đường ruột: Cắt từng đoạn ruột, cạo niêm mạc ruột hoặc dịch lỏng trong lòng ruột, sau đó pha loãng chất lỏng theo dãy thập phân (log 10). Kết quả được tính theo công thức: Mi (CFU/ml) = Ai x D1/v (Mi: số lượng vi khuẩn trong dung dịch ban đầu; Ai: số khuẩn lạc trung bình/đĩa; D1: độ pha loãng; v: dung tích huyền dịch /đĩa). Chuẩn bị các chuỗi pha loãng: 11
(iii) Tỉ lệ vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột non thỏ Phần trăm (%) bám dính = 100 x số vi khuẩn bề mặt ruột/ số vi khuẩn bề mặt ruột + CFU dịch lỏng (Richardson, 1991). Xử lý số liệu: Phần mềm Excel: tính các giá trị trung bình về tỉ lệ nhiễm V.cholerae và tỉ lệ kháng kháng sinh; phần mềm BioEdit: phân tích kết quả giải trình tự nucleotide; phần mềm MEGA (Treeview): vẽ cây giản đồ phả hệ; Minitab version 16.0: phân tích các giá trị FA và CFU. Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập và định danh Vibrio spp. 4.1.1 Kết quả phân lập Vibrio spp. Vi khuẩn Vibrio spp. có thể phát triển trong môi trường thạch muối-sucrose thiosulfate citrate-mật (TCBS): khuẩn lạc màu vàng hoặc màu xanh tuỳ loài. Nhìn chung khuẩn lạc thuộc các loài V.cholerae, V. vulnificus; V. fluvialis và V. alginolyticus đều có màu vàng, riêng khuẩn lạc V. paraheamolyticus có màu xanh; kích thước khuẩn lạc của từng loài cũng khác nhau (Trần Linh Thước, 2009). 4.1.2 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng phản ứng sinh hóa Quan sát đặc tính sinh hóa để phân biệt giữa các loài thuộc Vibrio spp. Hầu hết đều tạo sản phẩm oxidase và catalase, lên men đường và không sinh hơi; V. cholerae, V. paraheamolyticus, V. fluvialis và V. alginolyticus đều không lên men đường lactose, riêng V. cholerae và V. alginolyticus có khả năng oxy hóa tryptophan của vi khuẩn thành những sản phẩm biến dưỡng có gốc indole gồm indole, sketole tạo nên một phức chất có màu đỏ (Trần Linh Thước, 2009). Tất cả các loài như V. cholerae, V. vulnificus, V. fluvialis và V. alginolyticus đều âm tính với urê, riêng V. parahaemolyticus có phản ứng dương tính với urê. Vibrio spp. phát triển ở nồng độ muối thích hợp: 0-2%, 2-6%, 2-8% và từ 2-10%. 12
Bảng 4.1: Kết quả thử sinh hoá các loài thuộc Vibrio spp. Test SH Vibrio spp. V.cholerae V.paraheamolyticus V.vulnificus V.fluvialis V.alginolyticus K. lạc Vàng Xanh Vàng Xanh Vàng Oxidase (+) (+) (+) (+) (+) TSI (+) Glucose (+) (+) (+) Lactose (-) (-) (+) (-) (-) Sucrose + (-) (-) (+) (+) LDC (+) (+) (+) (-) (+) Di động (+) (+) (+) (+) (+) ONPG (+) (+) (+) (+) Indole (+) (-) (-) (-) (+) Urease (-) (+) (-) (-) (-) PAD (-) (-) (-) (-) Citrate (-) (-) (-) (-) (+) Hình dạng vi khuẩn V. cholerae dưới kính hiển điện tử với độ phóng đại 5.000 và 10.000: Hình 4.1: Vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử, độ phóng đại 5.000 và 10.000 lần Hình ảnh vi khuẩn V. cholerae chủng O3.2 qua kính hiển vi điện tử có hình hơi cong, có chiều dài từ 1 µm – 3 µm, có roi ngắn. V. cholerae sử dụng hai yếu tố độc lực từ tiêm mao/pili (TCP) và độc tố dịch tả CTX. 13
TCP cũng rất cần thiết cho sự hình thành khuẩn lạc của V. cholerae định vị trong ruột non của chuột sơ sinh (Taylor et al., 1987) và con người (Herrington et al., 1988). Vi khuẩn trong nghiên cứu này có roi ngắn, điều đó có thể do sự khiếm khuyết trong việc lắp ráp roi và có hiện diện của gene đột biến nên chiều dài roi không nhìn thấy qua kính hiển vi điện tử. 4.1.3 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR Hình 4.2: Sản phẩm khuếch đại đoạn gene 16S-27F và 1492Rbp Kết quả điện di hình trên cho thấy các sản phẩm PCR dài 1500 bp tương đương với đoạn gene 16S rRNA ở tất cả các chủng thuộc Vibrio spp. dài 1.500 bp (William et al., 1991) bao gồm các khu vực bảo tồn cao và có mặt ở hầu hết các vi khuẩn có phân nhánh nhưng có mối quan hệ gần. Đối chiếu các kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa với các sản phẩm từ PCR, nghiên cứu ghi nhận những loài thuộc Vibrio lần lượt: V. cholerae vạch từ 1-6; V. fluvialis từ 7-11; V. paraheamolyticus từ 12-19; V. vulnificus từ 20-23; V. alginolyticus từ 24-25. Cũng qua nghiên cứu này, chưa phát hiện được chủng nào thuộc Vibrios mang gene O139rfb và chủng mang gene mã hoá độc tố CTXA trên những mẫu từ môi trường nước và thức ăn có nguồn gốc thủy sản. Như vậy, qua kết quả PCR chưa phát hiện chủng nào thuộc Vibrio mang gene O139rfb và mang gene mã hoá độc tố tả CTX trên những mẫu từ môi trường nước và thức ăn có nguồn gốc thủy sản. Điều đó chứng tỏ Vibrio O139 chưa xuất hiện phổ biến tại tỉnh Trà Vinh. 14
4.1.5 Tỉ lệ hát hiện Vibrio spp. trên các loại mẫu phân lập Trên mẫu nghêu, có sự hiện diện rất đa dạng các loài thuộc Vibrio spp., vì đây là loài sinh vật sống ở vùng nước mặn, rất phù hợp cho vi khuẩn Vibrio spp. ký sinh, trong đó loài V. cholerae là 1,9 %. Trong huyết heo do có sử dụng nguồn nước từ sông để sử dụng trong quá trình giết mổ như rửa thịt, pha vào huyết (lúc chọc tiết), tỉ lệ dương tính 2% với V. cholerae tương ứng với tỉ lệ V. cholerae được phân lập từ nguồn nước sông (Bảng 4.2). Kết quả này cũng tương đương với kết quả phân lập tại thành phố Hồ Chí Minh với tỉ lệ 1,1% trên mẫu nước và 2,2% trong mẫu thực phẩm; tại Bến Tre trong mẫu nước là 5,7% (Nguyễn Hoàng Vũ, 2013), do Bến Tre là tỉnh có bệnh dịch tả xảy ra vào năm 2010. Bảng 4.2: Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên các loại mẫu Loại mẫu Loài Vibrios Số mẫu kiểm Dương tính (n = 500) tra Số mẫu Tỉ lệ (%) Nghêu (n = 160) V. cholerae 160 03 1,9 V. paraheamolyticus 160 03 1,9 V. vulniticus 160 04 2,5 V. fluvialis 160 05 3,1 V. alginolyticus 160 01 0,63 Huyết heo (n = 100) V. cholerae 100 02 2,0 V. paraheamolyticus 100 02 2,0 Nước (n = 150) + Nước sông V. cholerae 50 01 2,0 + Nước biển V. alginolyticus 50 01 2,0 + Nước ao nuôi tôm V. paraheamolyticus 50 02 4,0 Tôm (n = 50) V. paraheamolyticus 50 01 2,0 Phân (n = 40) 40 0 0,0 Tổng cộng 25 Trong 25 chủng phân lập được bao gồm 6 chủng thuộc loài V. cholerae (24%); 8 chủng thuộc loài V. paraheamolyticus (32%); 4 chủng thuộc loài V. vulnificus (16%); 5 chủng thuộc loài V. fluvialis (20%) và 2 chủng thuộc loài V. alginolyticus (8%). Kết quả từ Bảng trên cho thấy tỉ lệ phân lập V. paraheamolyticus là cao nhất (32%), chúng xuất hiện trên nghêu, trong nước sông, đặc 15
biệt ở nước ao nuôi tôm có độ mặn từ 6 - 8% và trên tôm, phù hợp với môi trường sống của chúng. Nghêu cũng là ký chủ thường xuyên của V. vulniticus; V. fluvialis và V. alginolyticus. 4.2 Kết quả định type huyết thanh Kết quả định type huyết thanh học các chủng Vibrio cholerae phân lập được bằng phản ứng ngưng kết cho thấy 100% (6/6) chủng dương tính với kháng huyết thanh đa giá (Ogawa, Inaba, O139), trong đó 50% (3/6) chủng thuộc Ogawa và 50% (3/6) chủng thuộc Inaba. 4.3 Kết quả tính tương đồng giữa các loài thuộc Vibrio trên Genbank bằng công cụ BLAST Trong nghiên cứu này, những chủng đại diện thuộc loài Vibrio spp. phân lập được gồm chủng Ng3, O3.2, O1.2, N8 và O9.1 có tỉ lệ tương đồng về trình tự nucleotide đoạn gene 16S-27F và 1492R của các chủng phân tích với các chủng khác thuộc loài V. cholerae là rất cao. Hình 4.3: Cây biễu diễn mối quan hệ di truyền dựa trên 16srDNA của các Vibrio spp. phân lập và một số chủng tham khảo Hình trên cho thấy những chủng vi khuẩn phân lập có những đặc điểm tương tự như những chủng có nguồn gốc từ môi trường, chứng tỏ những 16
chủng thuộc Vibrio spp. luôn có nguy cơ tiềm ẩn và sẽ dễ dàng gây thành dịch bệnh do tiếp nhận các gene từ các chủng có độc lực CTX. 4.4 Sự kháng kháng sinh của V. cholerae 4.4.1 Kết quả khảo sát sự kháng KS của V. cholerae bằng phương pháp Kirby Bauer (CLSI, 2010) Bảng 4.3: Sự nhạy cảm và đề kháng kháng sinh của V. cholerae Ký Số mẫu Nhạy cảm Kháng Kháng sinh hiệu kiểm tra Số mẫu % Số mẫu % Streptomycin Sm 6 3 50 3 50 Norlfoxacin Nr 6 6 10 0 0 0 Ampicillin Am 6 5 83 1 17 Tetracyclin Te 6 4 67 2 33 Azithromycin Az 6 4 67 2 33 Amoxicillin- Ac 6 5 83 1 17 clavulanic acid Trimethoprim- SXT/Bt 6 4 67 2 33 sulfamethoxazole Vancomycin Van 6 2 33 4 67 Các kết quả trên cho thấy, các chủng V. cholerae trong nghiên cứu này còn nhạy cảm cao với nhiều loại kháng sinh như norfloxacin (100%), ampicillin (83%) và amoxicillin-clavulanic acid (83%). Ngoài ra, V. cholerae kháng với vancomycin (67%), streptomycin 50%, tetracycline 33%....Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Xuân Trang và Nguyễn Ngọc Tuân (2012); Huu Dat Tran (2012). 4.4. Sự hiện diện một số gene kháng kháng sinh ở các vi khuẩn phân lập bằng kỹ thuật PCR M 1 2 900bp tetA (880bp) M: thang chuẩn 100bp, 1: V.cholerae (T1), 2: V.cholerae (T3) Hình 4.4: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen tetAF và testAR 17
Kết quả điện di hình trên, cho thấy các sản phẩm PCR dài khoảng 880bp tương ứng với đoạn gene tetA được phát hiện ở 2 chủng V. cholerae. Gene tetA có trình tự bảo tồn đặc trưng cho V. cholerae nên các sản phẩm PCR quan sát được đều thuộc chủng V. cholerae T1 và T2. Qua nghiên cứu, chưa phát hiện chủng V. cholerae mang gene kháng kháng sinh blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI. Chủng V. cholerae (T1) và chủng V. cholerae (T3) đều phân lập từ môi trường nước và chúng đều mang gene kháng tetracycline, thuộc nhóm Aminoglycosid. Như vậy một số chủng trong nghiên cứu không chứa gene kháng tetracycline (tetA), nhưng chúng có khả năng kháng với tetracycline, có thể là do sự hiện diện của các gene khác mã hóa kháng với tetracycline như blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI. Kết quả này cũng tương tự như kết quả của Dang et al,. (2006). 4.4.5 Kết quả so sánh trình tự nucleotide của chủng V. cholerae T1, T3 với chủng V. cholerae hoang dại N16961 tìm các dạng đột biến Các vị trí nucleotide được chèn vào và mất đi sẽ tương ứng với các vị trí acid amin sẽ thay đổi trong chuỗi trình tự của các chủng V. cholerae, từ đó suy luận về kiểu đột biến của chủng V. cholerae phân lập. Bảng 4.4: So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang dại N16961 với chủng V. cholerae T1 Codon Thay đổi Thay đổi Số nucleotide Kiểu đột biến Nucleotide acid amin T1 mất 14 AGT→CTG Ser→Leu 1 Sai nghĩa 51 CCT→TGA Pro →End Dịch khung 52 TGG→TCA Trp→Ser 1 Sai nghĩa 69 CGT→TAG Arg→End Dịch khung 71 GTT→TAA Val→End Dịch khung 74 A-T→TCA → Ser Thêm đoạn Vô nghĩa 105 CA - →CG - → 1 Vô nghĩa 106 - TG→-TG - → 2 Vô nghĩa 121 GCT→TAG Ala→End Dịch khung 142 GGT→TGA Gly →End Dịch khung 160 AAA→TGA Gly →End Dịch khung 161 GTA→TGA Val →End Dịch khung 164 CTT→TGA Leu →End Dịch khung 165 GAA→TGA Glu→End Dịch khung 166 TCA→TGA Ser→End Dịch khung 18