Đề tài: " Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) tại Sóc Trăng"

Chia sẻ: Nhu Chau | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:44

Thêm vào BST

Báo xấu

311
lượt xem 84
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung đề tài phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn trong ao nuôi tôm sú thâm canh. Khảo sát các đặc điểm sinh học của vi khuẩn theo phương pháp truyền thống. Nhận diện dòng vi khuẩn chuẩn Bacillus subtilis S19 bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài: " Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) tại Sóc Trăng"

TRƯ NG I H C C N THƠ KHOA THU S N LÊ M PHƯƠNG PHÂN L P VI KHU N Bacillus subtilis TRONG AO NUÔI TÔM SÚ (Penaeus monodon) T I SÓC TRĂNG Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LU N VĂN T T NGHI P IH C NGÀNH B NH H C TH Y S N C n Thơ, 2008
TRƯ NG I H C C N THƠ KHOA THU S N LÊ M PHƯƠNG PHÂN L P VI KHU N Bacillus subtilis TRONG AO NUÔI TÔM SÚ (Penaeus monodon) T I SÓC TRĂNG Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LU N VĂN T T NGHI P IH C NGÀNH B NH H C TH Y S N CÁN B HƯ NG D N PH M TH TUY T NGÂN C n Thơ, 2008
DANH M C HÌNH Hình Trang -2 Hình 4.1: Khu n l c sau 24 gi pha loãng 10 21 Hình 4.2: Khu n l c thu n trên TSA sau 24 gi 21 Hình 4.3: Vi khu n gram dương 22 Hình 4.4: Bào t sau 28 gi 22 Hình 4.5: Các bào t t do sau 36 gi 22 Hình 4.6: Th y phân Starch 24 Hình 4.7: Thu phân Casein 24 Hình 4.8: Thu phân Gelatin 24 Hình 4.9: Ph n ng V-P dương tính 25 Hình 4.10: T o Nitrite t Nitrate dương tính 25 Hình 4.11: Methyl red dương tính 25 Hình 4.12: Vi khu n phát tri n các n g mu i Trung tâm Học liệu7%, 10% Thơ @ Tài liệu học tập 26 nghiên cứu 2%, 5%, ĐH Cần và Hình 4.13: Xylose (+), Arabinose (+), Mannitol (+), Glucose (+), Sucrose (-) 26 Hình 4.14: K t qu ch y i n di ADN dòng chu n Bacillus subtilis 27
M CL C Ph n I: GI I THI U----------------------------------------------------------------- 1 Ph n II: LƯ C KH O TÀI LI U------------------------------------------------------ 3 2.1 ng d ng c a vi sinh v t i v i i s ng con ngư i ------------------------ 3 2.2 Các v n phát sinh trong ao nuôi tôm thâm canh----------------------------- 4 2.3 Probiotic trong thu s n------------------------------------------------------------ 6 2.3.1 Khái ni m và ng d ng c a probiotic----------------------------------------- 6 2.3.2 Cơ ch tác d ng c a probiotic-------------------------------------------------- 7 2.4 c i m sinh h c c a Bacillus subtilis------------------------------------------ 8 2.4.1 V trí phân lo i------------------------------------------------------------------- 8 2.4.2 Quá trình hình thành bào t ---------------------------------------------------- 9 2.4.3 Vai trò c a Bacillus subtilis -------------------------------------------------- 10 2.5 Các c tính sinh lý, sinh hóa c a vi khu n------------------------------------- 11 2.6 Phương pháp PCR ------------------------------------------------------------------ 12 Ph n III: V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U ---------------------- 14 3.1 a i m và th i gian th c hi n-------------------------------------------------- 14 3.2 Môi trư ng, hóa ch t và thi t b -------------------------------------------------- 14 3.3 Phương pháp thu và phân tích m u ---------------------------------------------- 15 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên 3.3.1 Thu m u--------------------------------------------------------------------------- 15 cứu 3.3.2 Phân tích m u--------------------------------------------------------------------- 15 3.4 Phân l p vi khu n------------------------------------------------------------------- 15 3.5 Xác nh các ch tiêu hình thái, sinh lý, sinh hoá vi khu n------------------- 15 3.6 Phương pháp PCR------------------------------------------------------------------ 17 3.6.1 Ly trích ADN---------------------------------------------------------------------17 3.6.2 Qui trình ch y PCR--------------------------------------------------------------18 3.6.3 Ch y i n di và c k t qu ---------------------------------------------------- 18 PH N IV: K T QU VÀ TH O LU N-------------------------------------------- 19 4.1 K t qu phân l p vi khu n---------------------------------------------------------- 19 4.2 K t qu v hình thái, sinh lý, sinh hoá vi khu n--------------------------------- 19 4.3 K t qu PCR dòng chu n----------------------------------------------------------- 26 PH N V: K T LU N VÀ XU T------------------------------------------------28 5.1 K t lu n------------------------------------------------------------------------------- 28 5.1 xu t-------------------------------------------------------------------------------- 28 TÀI LI U THAM KH O--------------------------------------------------------------- 29
L IC MT Xin chân thành c m ơn quý th y cô Khoa Thu s n – Trư ng i h c C n Thơ. c bi t là các th y cô thu c b môn Sinh h c và B nh h c Th y s n ã truy n t ki n th c, nh ng kinh nghi m quý báu trong su t quá trình em h c t p và nghiên c u t i trư ng. Xin bày t lòng bi t ơn sâu s c n cô Ph m Th Tuy t Ngân ã t n tình hư ng d n và giúp em r t nhi u trong quá trình th c hi n tài t t nghi p. ng th i xin g i l i cám ơn n cô c v n Nguy n Th Thu H ng cùng gia ình và các b n l p B nh h c Th y s n K30 ã ng viên và h tr cho em trong th i gian h c t p cũng như th c hi n tài t t nghi p. Sinh viên th c hi n Lê M Phương Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
TÓM T T Bacillus subtilis là vi khu n có l i, có vai trò quan tr ng trong nhi u lĩnh v c c a i s ng. Ph n l n các s n ph m men vi sinh bán trên th trư ng u có thành ph n là B. subtilis. tài ư c th c hi n nh m phân l p và xác nh c tính sinh hoá vi khu n phân l p nh danh vi khu n B. subtilis trong ao nuôi tôm sú thâm canh. Thu m u bùn t i 4 ao nuôi tôm thâm canh t i Sóc Trăng v i nh p thu 2 tu n/l n và phân tích t i phòng thí nghi m. K t qu phân l p ư c 39 ch ng vi khu n thu c gi ng Bacillus, trong ó có 8 ch ng cho k t qu các c tính sinh hoá g n gi ng v i Bacillus subtilis. Tám ch ng vi khu n này s ư c tr l i và ti p t c nh danh theo phương pháp PCR. Tuy nhiên do th i gian có h n tài ch th c hi n n vi c xác nh ch ng vi khu n chu n B. subtilis S19 (b ng phương pháp PCR) s d ng làm i ch ng dương. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Ph n I: GI I THI U Trong nh ng năm g n ây, thu s n ã tr thành ngành kinh t mũi nh n c a nư c ta. S n lư ng thu s n không ch áp ng ư c nhu c u th c ph m trong nư c mà còn xu t kh u sang th trư ng các nư c như Nh t, Nga, M , Úc,… Năm 2007, xu t kh u thu s n nư c ta t 3,7 t USD, vư t 2,78% so v i k ho ch, tăng 10,45% so v i năm 2006 (B Nông Nghi p và Phát Tri n Nông Thôn, 2007). Trong ó tôm Sú (Penaeus monodon) là m t trong nh ng s n ph m xu t kh u ch l c, chi m 39,9% t ng s n ph m thu s n xu t kh u. Tuy nhiên tăng năng xu t và l i nhu n, ngư i nuôi ã không ng ng tăng m t gi ng th , s d ng thu c, hoá ch t trong phòng và tr b nh chưa h p lý, thi u sót trong qu n lý môi trư ng… V n trên không ch làm xáo tr n s cân b ng sinh h c c a h sinh thái trong ao nuôi mà còn t o i u ki n cho d ch b nh bùng phát nh hư ng n s c kho v t nuôi, ng th i gây ô nhi m môi trư ng. Trư c tình hình trên, xu hư ng chung c a th gi i là “phòng b nh hơn ch a Trungnh”. Hi n nay nhi ĐH Cần Thơb@ v ng liệu học tập và nghiên cứu b tâm Học liệu u mô hình nuôi n Tài ư c xu t và áp d ng như nuôi tôm thân thi n môi trư ng, nuôi sinh thái, nuôi an toàn sinh h c… G n ây các nhà khoa h c ang t p trung nghiên c u vi c t n d ng các vi sinh v t h u ích t o các ch ph m sinh h c (như: Bio-remediation, Bio-control, Probiotics) thông qua cơ ch tác ng c a chúng như: s n xu t các h p ch t c ch ho c vi sinh v t gây h i, c nh tranh v dinh dư ng, nơi cư trú, ti t enzym phân hu h p ch t h u cơ giúp c i thi n môi trư ng ao nuôi, h tr quá trình tiêu hoá cho i tư ng nuôi… M t trong các nhóm vi khu n ư c nghiên c u nhi u nh t là Bacillus. H u h t các loài Bacillus không c h i i v i ng v t k c ngư i. Nó có vai trò quan tr ng vì kh năng s n sinh nhi u s n ph m bi n dư ng th c p như kháng sinh, thu c tr sâu sinh h c, hoá ch t và enzym (trích d n b i Olmos, 2005). tài “Phân l p vi khu n Bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) t i Sóc Trăng” ư c th c hi n v i m c tiêu và n i dung: M c tiêu Phân l p và xác nh các c tính sinh hóa c a Bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú thâm canh. T ó làm cơ s cho các nghiên c u ti p theo. 1
N i dung Phân l p vi khu n Bacillus subtilis t m u bùn trong ao nuôi tôm sú thâm canh. Kh o sát các c i m sinh h c c a vi khu n theo phương pháp truy n th ng. Nh n di n dòng vi khu n chu n Bacillus subtilis S19 b ng k thu t PCR (Polymerase Chain Reaction). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2
Ph n II: LƯ C KH O TÀI LI U 2.1 ng d ng vi sinh v t iv i i s ng con ngư i Vi c nghiên c u vi sinh v t phát tri n r t nhanh ã d n n vi c hình thành các lĩnh v c khác nhau: vi khu n h c (Bacteriology); n m h c (Mycology); t o h c (Phicology); virus h c (Virology),…Chúng ư c ng d ng nhi u trong các lĩnh v c như: y h c, thú y, công nghi p, nông nghi p, môi trư ng,…(Nguy n Xuân Thành và ctv, 2005). a s vi sinh v t trong t nhiên là có l i, do ó c n nghiên c u vai trò to l n v nhi u m t c a các nhóm vi sinh v t trong t nhiên và trong công nghi p. Trên cơ s ó tìm ki m các phương pháp nh m khai thác y nh t nh ng tác ng tích c c c a vi sinh v t và ngăn ch n m t cách hi u qu nh t các tác ng có h i c a chúng. nh hư ng nghiên c u v các lĩnh v c c a công nghi p vi sinh v t nh m t o ra nhi u ch ph m vi sinh v t h u ích ng d ng trong s n xu t nông nghi p, công nghi p, ph c v c l c cho ho t ng s ng c a con ngư i (Nguy n Xuân Thành và ctv, 2005). Trung tâmvHọc liệu ĐHvi c khép kín @ Tài n hoàn các v t ch t và gi cân cứu Vi sinh t tham gia vào Cần Thơ vòng tu liệu học tập và nghiên b ng sinh thái trong t nhiên. M t s ch ng vi sinh v t ti t ra ch t kháng sinh, vitamin, ch t kích thích sinh trư ng, ho c trong t bào ch a tinh th di t côn trùng áp d ng trong công ngh s n xu t ch t kháng sinh, vitamin, thu c b o v th c v t,… Ngoài ra, vi sinh v t còn phân hu các ch t c h i, các ph th i nông nghi p, công nghi p, làm s ch môi trư ng,…(Nguy n Kh c Thái Sơn, 2007) Trong y h c, công ngh vi sinh ã góp ph n trong vi c tìm ki m nhi u lo i dư c ph m quan tr ng, ch n oán và i u tr nhi u lo i b nh hi m nghèo cho ngư i, gia súc, gia c m. c bi t trong quá trình tìm ki m các bi n pháp, thu c phòng tr các lo i b nh truy n nhi m, công ngh vi sinh ã t o ra vacxin t vi sinh v t như: vacxin t o t riboxom c a t ng loài vi khu n gây b nh, có ưu i m ít c và tính mi n d ch cao ho c vacxin ư c t o t các m nh c a v virus gây b nh. Ngoài ra vacxin còn ư c ch t o t vi khu n ho c n m men tái t h p có mang gen mã hoá vi c t ng h p protein c a kháng nguyên gây b nh (Nguy n Xuân Thành và ctv, 2005). Công ngh vi sinh còn ư c ng d ng s n xu t men tiêu hóa cho con ngư i. H u h t các men tiêu hóa hi n nay dùng cho con ngư i trên th trư ng u có ch a các vi sinh v t thu c nhóm Bacillus 3
subtilis như: Biosubtilic, Bidisubtilic, Antibio, Biofidin, Biobaby,…(Nguy n Kh c Thái Sơn, 2007). Vi sinh v t còn có vai trò trong vi c t o ra ngu n năng lư ng cho con ngư i như lên men nguyên li u r ti n như r ư ng s n xu t c n ch y xe thay xăng. Nh quá trình lên men y m khí c a vi sinh v t ã chuy n hoá v t ch t h u cơ t o Biogas làm khí t. c bi t, vi sinh v t có vai trò r t l n trong vi c b o v môi trư ng, tham gia tích c c trong vi c x lý ph th i nông nghi p, công nghi p, rác th i sinh ho t, nư c th i,…làm s ch môi trư ng. Trong t nhiên, nh ho t ng s ng c a vi sinh v t nên m t lư ng l n các ch t h u cơ b khoáng hoá. Các h p ch t h u cơ ư c chuy n hoá qua hàng lo t các ph n ng hoá h c, xúc tác m i ph n ng là m t enzyme (Nguy n Xuân Thành, 2005). Trong chuy n hoá các h p ch t trong t nhiên có nhi u lo i vi sinh v t cùng tham gia, s n ph m chuy n hoá c a vi sinh v t này l i là cơ ch t cho vi sinh v t khác, ho t ng c a chúng di n ra ph c t p và có m i liên h ch t ch v i nhau. S phân hu các ch t h u cơ di n ra v i t c khác nhau ph thu c vào thành ph n, s lư ng và i u ki n môi trư ng. Thành ph n ch y u c a h p ch t h u cơ trong nư c và bùn ao nuôi tôm bao g m: protein, lipit, Trung tâm Học kitin. Các vi khu Thơ kh năng liệu học protein thư ng g p cứu hydratcacbon, liệu ĐH Cần n có @ Tài phân hu tập và nghiên thu c chi Pseudomonas, Clostridium, Bacillus. Chúng phân gi i protein thành polypeptit, axit amin, NH3. Nhóm vi sinh v t phân hu các hydratcacbon bao g m chi Bacillus, Aspegilus streptomyces, Streptocococus, Clostrium,… Trong quá trình này các hydratcacbon (tinh b t, xenluloza, pectin, hemixenluloza,…) ư c phân gi i thành nh ng ph n nh hơn, t o ra các s n ph m c a quá trình trao i ch t như các khí (NH3, CO2), axit formic, axit acetic, axit propinic, axit béo, axit lactic, các ch t khoáng và sinh kh i m i c a vi sinh v t (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm). M t trong nh ng c i m quan tr ng c a vi sinh v t là chúng sinh trư ng nhanh. Khi nuôi c y trong môi trư ng thích h p ch sau 24 gi t m t t bào vi sinh v t có th thu ư c m t sinh kh i l n. Hơn n a chúng có th nuôi c y d dàng trên các cơ ch t r ti n, không t n nhi u di n tích và vi c s n xu t không ph thu c vào s thay i c a th i ti t (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm). 4
2.2 Các v n phát sinh trong nuôi tôm thâm canh Trong nuôi tôm thâm canh, vi c làm s ch và duy trì ao nuôi s ch v n còn nhi u khó khăn, khi n cho nh ng ngư i nuôi tôm g p r t nhi u r i ro. Tình tr ng nhi m b n n ng c a ao nuôi tôm m c dù ã ư c kh c ph c b ng gi i pháp thay nư c s ch thư ng xuyên hay nư c ã ư c x lý, song ph n bùn ao nơi các ch t th i tích t trong quá trình nuôi là môi trư ng lý tư ng cho các vi trùng và ký sinh trùng gây b nh phát tri n. M i năm áy ao nuôi tôm thâm canh hình thành m t l p bùn dày 10-15 cm, tương ương 30-50 t n/ha ch t khô giàu h u cơ (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm). Bùn có thành ph n ch y u là ch t h u cơ, bao g m sinh kh i vi sinh v t và xác ng th c v t thu sinh. Khi phân hu t nhiên s làm c n ki t lư ng oxy hoà tan và sinh ra các ch t c h i i v i tôm như NH3, H2S, CH4…(http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm). T ó làm phát sinh b nh và gây thi t h i l n. Theo Moriarty (1998), b nh do vi khu n gây ra x y ra t t c các giai an phát tri n c a tôm và s bùng phát b nh gây thi t h i kinh t l n. Theo trình bày c a Ngân hàng th gi i thi t h i kinh t do b nh gây ra trong nuôi th y s n kho ng 3 t ô la (Ludin, 1996; trích d n b i Vaseeharan et al., 2002). ki m soát và qu n lý m m b nh ngư i nuôi ã s d ng thu c, hóa ch t b a Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu bãi d n n hi n tư ng ch n l c và phát tán các gen kháng thu c gi a các ch ng vi khu n nh plasmid ho c th th c khu n (Moriarty, 1999). i u này có nguy cơ gây nguy hi m cho ngư i và các ng v t khác. Ngoài vi c s d ng kháng sinh, ngư i nuôi còn s d ng các ch t t y u gi t m m b nh. Các ch t như formaline, chlorin có th ngăn c n s bùng phát b nh, nhưng lâu dài s t o ra các v n môi trư ng ti m tàng (Rosenthal, 1980). Vi c s d ng chlorine kích thích s phát tri n nhi u gen kháng thu c kháng sinh vi khu n (Murray et al. 1981; trích d n b i Moriarty, 1999). Bên c nh các v n v môi trư ng, th c ăn cho tôm cũng là y u t quan tr ng. Do th c ăn chi m chi phí t nh t trong nuôi th y s n, s lư ng và ch t lư ng th c ăn là nhân t u tiên nh hư ng n s tăng trư ng c a tôm (Olmos, 2005). Th c ăn cho tôm ch a hàm lư ng protein cao (trên 35%), do ó khi th c ăn không ư c tôm tiêu th ho c các ch t th i bài ti t t tôm s phóng thích lư ng l n các h p ch t ch a nitơ vào môi trư ng nư c gây các v n v môi trư ng và d ch b nh. gi i quy t v n ch t th i l ng t trong ao, v n ki m soát b nh sao cho có hi u qu và an toàn, ng th i gi m chi phí v th c ăn cho tôm; các nhà 5
khoa h c hư ng t i vi c t n d ng các vi sinh v t có l i mà g n ây ư c bi t như ch ph m vi sinh (probiotics). 2.3 Probiotic trong th y s n 2.3.1 Khái ni m và ng d ng Probiotic M t th i gian dài trư c khi phát hi n ra Probiotic, vi khu n chưa ư c xem như ngu n th c ăn cho sinh v t khác. Sau ó nh ng nghiên c u th c hành cho th y nh ng k t qu ã góp ph n c i thi n s c kh e con ngư i. Vào nh ng năm u th k 20, Metchnikoff ã c y vi khu n lên men acid lactic vào ư ng tiêu hóa c a ngư i v i m c ích kh ng ch h at ng c a vi khu n khác. Khái ni m m i v Probiotic ã ư c hình thành. Yasuda and Taga (1980), công b s d ng vi khu n như ngu n th c ăn và là nhân t sinh h c trong phòng tr b nh cá. Vi khu n ư c ngh u tiên là Vibrio alginolyticus, s d ng như m t vi sinh v t h u ích trong các tr i gi ng Ecuado t 1992 giúp gi m th i gian ngh c a tr i t 21 ngày xu ng còn 7 ngày (Ph m Th Tuy t Ngân, 2006). Probiotics hi n nay thư ng xuyên ư c s d ng giúp tăng s kháng b nh cho tôm và như m t ch t thay th kháng sinh (Rengpipat et al., 1998). Probiotics là vi sinh v t ho c s n ph m c a chúng có l i cho s c kho c a v t Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ch . Chúng ư c phát tri n trong nuôi tr ng thu s n như là phương ti n ki m soát b nh, kích thích s thèm ăn, c i ti n ch t dinh dư ng b ng cách t o ra vitamin, gi i c các thành ph n trong th c ăn và phân hu các ch t không ư c tiêu hoá (Irianto and Austin, 2002). Theo Fuller (1987), probiotic là s n ph m ư c nuôi ho c b sung th c ăn vi khu n s ng có l i cho v t ch b ng cách c i thi n s cân b ng vi khu n ư ng ru t. Theo Gram et al. (1999), ngh probiotic là ch t b sung vi khu n s ng, tác d ng có l i i v i ng v t ch b ng cách c i thi n s cân b ng vi khu n c a nó, nh nghĩa này không g n li n v i th c ăn. Hơn n a, Salminen et al. (1999), cho r ng probiotic như các thành ph n c a t bào vi khu n (nhưng không c n thi t ph i s ng) có nh hư ng t t n s c kho v t ch . T t nhiên probiotic ph i không gây h i n v t ch (Salminen, 1999). Chúng ch u ư c nh hư ng c a nhi t , n ng mu i khác nhau (Fuller, 1987). Ngày nay, Probiotic ã ư c s d ng trong th c ăn nhân t o (Robertson et al., 2000), th c ăn tươi s ng như Artemia, Rotifers (Gatesoupe, 1991) và s d ng trong môi trư ng nư c (Austin, 1995). Hơn 50 năm qua, các nhà khoa h c ã t p trung nghiên c u v probiotics c i ti n các th c ph m có l i, góp ph n tăng s c kho cho con ngư i và ng v t (Rengpipat et al., 1998). Các loài vi sinh v t thư ng ư c dùng t o 6
Probiotics bao g m Lactobacillus spp., Saccharomyces sp., Bacillus spp. (trích d n b i Irianto and Austin, 2003). Austin (1995), nghiên c u s d ng probiotic (Vibrio alginolyticus) trên cá H i, k t qu cho th y probiotic có th làm gi m b nh gây ra b i Aeromonas salmonicids, Vibrio anguillarium và Vibrio ordalii. M t nghiên c u khác khi ngâm tôm Sú (PL30) 10 ngày v i Vibrio harveyi có s d ng probiotic (Bacillus S11) cho th y s tăng trư ng và t l s ng c a tôm là 100% cao hơn nhi u so v i nhóm i ch ng (không s d ng probiotic) 26% (Rengpipat et al., 1998). Bên c nh ó tác gi còn cho r ng Bacillus S11 có th thay th c Vibrio spp., m t s loài vi khu n khác trong ru t tôm và trong môi trư ng nư c. Theo Hasting and Nealson (1981) Bacillus S11 có th t o ra m t s ch t kháng khu n ho c m t vài s n ph m chưa ư c bi t có th tiêu di t V. harveyi D331. Theo Moriarty (1998), m m b nh do vi khu n Vibrio spp. ã ư c xem là m t trong nh ng nguyên nhân làm tôm ch t hàng lo t. Tuy nhiên, các ly trích t bào t do Bacillus subtilis BT23 cho th y có hi u qu cao trong vi c ch ng l i s tăng trư ng c a Vibrio harveyi phân l p t tôm sú b nh en mang, t l ch t c a tôm gi m 90% (Vaseeharan and Ramasamy, 2002). Nghiên c u này cho th y m m b nh Vibrio b ki m soát b i Bacillus trong i u ki n phòng thí nghi m Trung tâm Học tliệu ĐHmCần Thơ @khác c a Vaseeharan vàal. (2004), cứu và ngoài th c . Theo t nghiên c u Tài liệu học tập et nghiên probiotic giúp kháng ư c vi khu n Listonella anguillarum xu t hi n trong nư c, bùn áy ao nuôi và trong các cơ quan c a tôm sú. Tác gi cho bi t trên mang, cơ, d dày và gan t y c a tôm sú trong ao nuôi có s d ng probiotic, s lư ng vi khu n Listonella anguillarum th p hơn so v i ao i ch ng. K t qu này ch ng minh các s n ph m bài ti t c a Bacillus trong th c ăn và ru t tôm c ch s phát tri n c a L. anguillarum trong cơ th tôm ng th i giúp tăng cư ng s tăng trư ng, nâng cao t l s ng c a tôm sú (Vaseeharan et al., 2004). K t qu này cũng trùng v i nghiên c u c a Moriarty (1998), sau khi s d ng probiotic (ch a ch ng Bacillus spp.) t l s ng c a tôm sú tăng, h n ch ư c m m b nh vi khu n phát sáng Vibrio spp. trong nư c và bùn áy ao. 2.3.2 Cơ ch tác d ng c a Probiotic Nhóm vi sinh v t d dư ng ho i sinh như m t s loài thu c nhóm Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium,…) làm s ch môi trư ng nh kh năng sinh các enzyme (protease, amylase, xenlulase, kitinase, lipase) phân h y các h p ch t h u cơ và ki m soát s phát tri n quá m c c a các vi sinh v t gây b nh do cơ ch c nh tranh ngu n dinh dư ng, gi cho môi trư ng luôn tr ng thái cân b ng sinh h c (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm) 7
Các loài thu c gi ng Bacillus, Pseudomonas, Clostridium (B. mesentericus, B. mycoides, B. subtilis, P. flourescenc, C. sporogenes,…) tham gia vào quá trình amôn hóa protein, gi vai trò quan tr ng trong vi c chuy n nitơ t d ng khó h p thu sang d ng mu i amôn d ư c th c v t th y sinh h p thu và giúp làm s ch các th y v c (Ph m Th Tuy t Ngân, 2006). Nhóm vi sinh v t Enterococcus faecium, Streptomyces cinnamoensis, B. subtilis, Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Pediococcus acidilatici,... c bi t là nhóm vi khu n lên men acid lactic, có vai trò ki m soát các sinh v t gây b nh cho tôm, cá trong môi trư ng nh kh năng sinh các ch t c ch như acid lactic, bacterioxin. Bên c nh ó chúng cũng ư c dùng làm th c ăn cho tôm, cá, giúp cân b ng h vi sinh v t ư ng ru t, ngăn c n s xâm nh p c a các vi sinh v t có h i và tăng kh năng phòng ng a m t s b nh ư ng ru t. ng th i còn có tác d ng h tr tiêu hóa, h p thu th c ăn, giúp v t nuôi kh e m nh và phát tri n nhanh (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm). Theo Olmos (2005), trong th c ăn nuôi tôm, probiotic có th giúp phân h y t t c các thành ph n protein vì các enzyme ư c t o ra b i vi khu n có th b sung các ho t tính c a protease giúp tăng kh năng tiêu hóa th c ăn cho tôm. Hơn n a, enzyme t probiotic ch u ư c kho ng pH r ng hơn enzyme c a tôm, Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu do ó quá trình tiêu hóa có th di n ra trong th i gian dài giúp tôm h p thu ch t dinh dư ng t t hơn. 2.4 c i m sinh h c Bacillus subtilis 2.4.1 V trí phân lo i Gi i Bacteria Ngành Firmicutes L p Bacilli B Bacillates H Bacillaceae Gi ng Bacillus Loài Bacillus subtilis (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin) Năm 1872, Ferdinand Cohn (cùng th i Robert Koch), ã phát hi n và t tên là B. subtilis. B. subtilis là tr c khu n Gram dương, di ng, có kích thư c 2-3x 0,7-0,8 µm, n i bào t trung tâm có kích thư c 1,5-1,8 x 0,8 µm. i u ki n o 100 C, bào t B. subtilis ch u ư c 180 phút, có tính n nh cao v i nhi t th p và s khô c n, tác ng c a hóa ch t, tia b c x . B. subtilis hình thành bào 8
t khi môi trư ng bi n i t ng t, cũng như s ng th i gian dài dư i nh ng i u ki n b t l i như khan hi m ch t dinh dư ng (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin). Tuy nhiên, B. subtilis cũng có th ph n ng v i s thi u dinh dư ng b ng cách di chuy n cơ th t các i u ki n nghèo dinh dư ng n nơi t t hơn nh vào các lông roi (Mirel et al., 2000). 2.4.2 Quá trình hình thành bào t Bacillus subtilis Khi môi trư ng b thay i t ng t ho c do thi u th c ăn, các loài thu c gi ng Bacillus và Clostridia khác nhau t o ra m t lo i t bào ng ng ho t ng t m th i g i là n i bào t , có th ch ng l i các t n công l n có th phá h y thành t bào (Driks, 1999). N i bào t c a vi khu n ư c sinh ra không ph i sinh sôi n y n mà ch u ng ư c v i i u ki n b t l i. ó là lo i t bào tr ng thái ngh mà trong chúng các quá trình s ng b c ch r t m nh (Nguy n Lân Dũng, 1983). Cách ây 100 năm, m t nghiên c u c a Koch v bào t c a B. anthracis có th s ng sót i u ki n un sôi, ã t o c m h ng cho các nhà khoa h c nghiên c u v bào t v i m c ích khám phá ra như th nào lo i t bào ngưng ho t ng c bi t có th ch u nhi t và các i u ki n gây s c khác. Theo Driks (1999), bào t có kh năng ch u nhi t là nh l p áo bào t . Áo bào t là m t c u trúc g m nhi u l p bao quanh bào t ư c c u thành b i Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu hơn 25 lo i polypeptid liên k t chéo ch t ch v i nhau. Tuy nhiên l p áo bào t cũng cho phép bào t h i sinh khi i u ki n môi trư ng thích h p. Bào t có th chuy n i thành t bào phát tri n thông qua m t quá trình g i là s n y m m. Trong quá trình hình thành n i bào t , vi khu n cũng t o ra các ch t kháng sinh. Nhi u loài hình thành bào t có th phân h y m t cách hi u qu các polymer sinh h c (protein, starch, pectin,…), óng vai trò quan tr ng trong các chu trình sinh h c Nitơ và Carbon (http://www.textbookofbacteriology.net/Bacillus.html). Quá trình hình thành bào t c a vi khu n c n kho ng 8 gi hoàn thành (Driks, 1999). Trong quá trình hình thành bào t , nhi m s c th nhân ôi thành các b n sao riêng bi t. Cu i cùng ch có m t b n sao nhi m s c th n m trong bào t , sau ó thành hai t bào, các ph n còn l i b h y i và bào t ư c phóng thích. Theo Nguy n Lân Dũng (1983), ph n l n vi khu n trong t bào ch có th có m t bào t . Khi g p i u ki n thu n l i bào t s n y m m và m i bào t ch cho ra m t t bào dinh dư ng. Trong t t c các loài, không ph i t t c các t bào u hình thành bào t dù trong b t kỳ i u ki n nào. Chưa có thông tin gi i thích t i sao m t vài t bào 9
trong môi trư ng nuôi hình thành bào t và m t s khác thì không. Tuy nhiên có s ch p nh n r ng s hình thành bào t b t u sau pha tăng trư ng nhanh và trong su t pha tĩnh (Banwart, 2000). 2.4.3 Vai trò c a Bacillus subtilis B. subtilis t o protease ki m (subtilisin) v i lư ng l n, có c tính b n v ng, ho t ng t t v i nhi t và pH cao nên chúng ư c ng d ng nhi u ngành công nghi p khác nhau. Subtibilin ch y u ư c s d ng trong các ngành công nghi p các ch t t y r a và c trong y dư c h c. Ngoài ra subtibilin còn s d ng trong x lý phim X quang ã qua s d ng nh m thu h i b c, làm nư c m m cá, làm th c ăn gia xúc, x lý ch t th i t ng v t giáp xác, x lý rác th i trong lò m gia c m. Trong nh ng năm g n ây t t c các protease b sung vào ch t t y dùng trên th trư ng u là protease ư c s n su t t các ch ng Bacillus, mà ch y u là B. subtilis. Năm 1971, ánh d u bư c m u quan tr ng cho nh ng nghiên c u v protease ki m Bacillus. Horikoshi là ngư i u tiên công b thu nh n và Markland tìm hi u c u trúc cơ b n, tính ch t lý hóa c a protease ki m t Bacillus (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin). Năm 1972, ngư i ta ã nghiên c u và ưa vào s n xu t trên quy mô l n các protease ki m m t Trung tâm Bacillus. ĐH Cần 80, nh@ Tài liệu học tập và nghiên cứu vài loài Học liệu n th p k Thơ ng nghiên c u v protease ki m c a Bacillus ti p t c m r ng và ã t o ra hàng lo t các s n ph m trên th trư ng thương m i, vi khu n Bacillus tr thành “m t th gi i vi sinh v t m i” theo quan i m công nghi p (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin). G n ây ngư i ta ã thành công trong nhân dòng phân t , gi i trình t nucleotide và bi u hi n gen mã hóa protease ki m t nhi u loài Bacillus. Nhi u ch ng ư c s d ng bi u hi n gen mã hóa subtilisin, trong ó ch ng Bacillus ư c s d ng nhi u nh t vì ã ư c nghiên c u tương i y v c tính sinh lý, sinh hóa và di truy n v i toàn b genon ã ư c xác nh (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin). .Ngoài nh ng s n ph m hóa ch t, m t s công ty cũng s d ng B. subtilis như tác nhân sinh h c ki m soát ch h i. B. subtilis (QST 713) có hi u qu áng k ch ng nhi u lo i vi khu n và b nh n m. QST 713 ho t ng b ng cách chi m b m t lá cây, c nh tranh v i các m m b nh chi m không gian và các ch t dinh dư ng, nh ó ngăn c n m m b nh b ng con ư ng v t lý. Nó cũng s n sinh ra các ch t chuy n hóa lipopeptit có tác ng k t h p phá h y các ng và màng c a m m b nh (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin). 10
Qu nghiên c u trà USPAI t i Valparai, n ã kh o sát ti m năng c a các vi khu n ch ng các m m b nh gây r i lá trà. Nhi u dòng vi khu n B. subtilis ã ư c xác nh là có kh năng ch ng m m bào t c a m m b nh. Hi n nay các nhà nghiên c u ang ti n hành các thí nghi m nâng cao hi u qu th c a c a nh ng dòng vi khu n ch n l c (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin) B. subtilis là m t trong nh ng vi khu n có ti m năng nh t, thu n l i trong vi c c i thi n s c kh e và kích thích h mi n d ch. Theo các nghiên c u lâm sàng trong báo cáo khoa h c v thu c “S kích thích mi n d ch b i Bacillus subtilis” c a nhà vi sinh v t h c J. Harmann, các thành ph n c a thành t bào vi khu n B. subtilis có th ho t hóa g n như t t c các h th ng phòng th mi n d ch c a con ngư i, bao g m s ho t hóa ít nh t 3 kháng th chuyên bi t (IgM, IgG, IgA) ch ng l i hi u qu nhi u virus, n m, m m b nh vi khu n gây h i thư ng xâm nh p và gây nhi m vào cơ th ngư i (http://www.upwardquest.com/bacillus-subtilis.html/). Theo m t nghiên c u c a Gong et al. (2006), ch ng B. subtilis PY-1 phân l p t bó m ch c a cây bông có kh năng kháng m nh nhi u m m b nh n m trên cây tr ng c bi t là n m Fusarium oxysporum gây ra thi t h i kinh t l n trong nhi u mùa v . Theo tác gi , các ch t kháng sinh t o ra b i ch ng B. subtilis PY-1 n nh các i u Trung n pH Học tính và ki Cần Thơ @ v i nhi t học tập nvàây các nhà cứu ki tâm trung liệu ĐH m, không nh y Tài liệu cao. G nghiên khoa h c s d ng các vi sinh v t này như là m t phương pháp b o v sinh h c, ki m soát m m b nh và thay th các thu c di t sinh v t (methyl bromide) có nguy cơ gây ra thi t h i môi trư ng nghiêm tr ng (http://www.upwardquest.com/bacillus-subtilis.html/). 2.5 Các c tính sinh lý và sinh hóa c a vi khu n T ng các ph n ng x y ra trong t bào có liên quan n quá trình trao i ch t và các ph n ng hóa h c riêng ư c t o nên b ng s xúc tác b i các ph n ng protein g i là enzyme. Ph n l n các enzyme trong t bào có ch c năng phân c t các nguyên li u th c ăn (s d hóa) và t ng h p thành các thành ph n c a t bào (s ng hóa). Tuy nhiên vi khu n không th th c hi n s th c bào do thành t bào c ng. Vì th chúng bài ti t ra các ngo i enzyme có ch c năng bên ngoài t bào phân c t các i phân t như: protein, tinh b t,… thành các amino acid, monosaccharide,… Sau ó ư c v n chuy n vào t bào. i n hình c a các ngo i enzyme c a vi khu n là: protease, amylase, lypase,… M c ích u tiên c a quá trình trao i ch t là t o ra năng lư ng c n cho s t ng h p sinh h c và tăng trư ng c a t bào. Vi khu n có th t ư c các nhu c u năng lư ng b ng hai phương th c trao i ch t khác nhau ó là quá trình 11
hô h p và quá trình lên men. Trong quá trình hô h p các phân t h u cơ ư c phân h y m t cách hoàn toàn thành carbondioxide (CO2) và nư c. Ngư c l i, s lên men là s phân c t các phân t h u cơ thành các alcohol, aldehyde, acid và các khí như: CO2, hydrogen. Trong quá trình này các phân t h u cơ trong con ư ng trao i ch t gi nhi m v như ch t nh n electron cu i cùng và tr thành s n ph m cu i cùng trong con ư ng lên men. Nhi u loài vi khu n có kh năng phát tri n b ng hai quá trình hô h p và lên men. S n ph m cu i cùng c a quá trình lên men có th ư c s d ng như m t ch tiêu nh danh vi khu n (Brown, 2005). Khi vi khu n hi u khí phát tri n b ng quá trình hô h p, chúng t o ra hydrogen peroxide (H2O2) như m t s n ph m kh O2 thành nư c. H2O2 có tính ph n ng cao s gây t n h i n các enzyme, nucleic acid, các phân t nh trong t bào. tránh thi t h i này, các sinh v t hi u khí t o ra enzyme catalase chuy n H2O2 thành O2 vô h i. catalase 2H2O2 2H2O + O2↑ Các vi khu n k khí b t bu c thi u enzyme này vì th chúng không th x lý v i H2O2 t o ra trong môi trư ng hi u khí. S hi n di n c a catalase là m t cách phân bi t các vi khu n này v i vi khu n hi u khí. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2.6 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Th gi i khoa h c c n có m t h th ng phân lo i d a trên các d u hi u có các sinh v t s ng. Trong nh ng năm 1980, nhà khoa h c Carl Woese ưa ra m t ngh m i ó là i th ng n trung tâm c a ngu n g c tính a d ng. Ông ngh trình t deoxyribonucleic acid (ADN) c a vài gen thông thư ng có th ư c s d ng xác nh m i quan h c a các sinh v t khác nhau. i n hình Woese nh t m t gen mã hóa 1 phân t RNA tìm th y trong ribosome (rRNA). Ribosome (ph c h p protein-RNA) tìm th y trong t t c prokaryote và eukaryote. M c dù có s khác nhau v kích c gi a ribosome c a prokaryote và eukaryote, nhưng trình t c a phân t rRNA thì r t gi ng nhau ( ó là vùng có tính b o t n cao). i u này cho phép các trình t nucleic ư c ánh d u và so sánh. Woese ch n 16S rRNA (prokaryote) ho c 18S rRNA (eukaryote). Phân t này l n ch a các thông tin cho so sánh di truy n và nh cho gen gi i trình t m t cách d dàng (trích d n b i Salyers and Whitt, 2001). PCR ư c Kary Mullis phát minh năm 1985, là m t k thu t ph bi n trong sinh h c phân t nh m khu ch i m t o n ADN lên n 106 l n ho c nhi u hơn (Marlowe et al., 2005) mà không c n s d ng các sinh v t s ng như E. coli hay n m men. Theo Marlowe et al. (2005), PCR th c ch t là m t ph n ng 12
enzyme ơn gi n, s d ng enzyme ADN-polymerase sao chép trình t ADN mong mu n l p l i 25-30 chu kỳ. Trong m i chu kỳ trình t ADN ư c nhân ôi, k t qu lư ng ADN tăng theo hàm s mũ. Theo gi thi t, 25 chu kỳ t o ra s khu ch i là 225, nhưng trong th c t ch t ư c tương ương 106 l n lư ng ADN ban u. Theo tác gi ây là do hi u qu c a s khu ch i không hoàn h o. Ngày nay PCR ư c s d ng trong các nghiên c u sinh h c và y h c ph c v nhi u m c ích khác nhau như phát hi n các b nh di truy n; nh n d ng, ch n oán các b nh nhi m trùng; tách dòng gen; xác nh huy t th ng. PCR cũng ư c dùng phân tích ti n hóa, phân tích s a d ng di truy n m c ADN trong và gi a các qu n th . Trong th y s n, PCR là m t công c h u hi u cho vi c phát hi n m m b nh vi khu n (Vibrio) ho c virus (WSSV, YHV,…), ký sinh trùng và n m trên ng v t th y s n ( ng Th Hoàng Oanh, 2007). M t chu kỳ thông thư ng c a PCR g m 3 bư c (bi n tính ADN, g n m i, và kéo dài ADN). Ph n l n các ph n ng PCR, giai o n bi n tính ư c chu n hóa t i nhi t 94oC trong 1,5 phút, vì nhi t này m b o s bi n tính hoàn toàn c a các phân t ADN (Marlowe et al., 2005). Giai o n g n m i x y ra t i nhi t th p hơn (thông thư ng kho ng 50-70oC trong 1 phút), m c nhi t giai o n này ph thu c vào nhi t nóng ch y c a m i s d ng. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Bư c cu i c a PCR là kéo dài m ch ADN, giai o n kéo dài thư ng x y ra trong 1 phút t i 72oC. Thành ph n quan tr ng c a giai o n này là enzyme Taq polymerase thu t vi khu n ch u nhi t Thermus aquaticus. Enzyme này phù h p v i PCR do nó n nh v i nhi t (có th trên 98oC) và có th tái s d ng cho nhi u chu kỳ (Marlowe et al., 2005). 13
Ph n III: V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 3.1 a i m và th i gian th c hi n a i m: Thu m u t i các ao nuôi tôm thâm canh p Tân Tĩnh, xã Vĩnh Hi p, huy n Vĩnh Châu, t nh Sóc Trăng. Phân tích m u t i phòng thí nghi m Khoa Thu S n, trư ng i H c C n Thơ. Th i gian: T tháng 3 – tháng 7 năm 2008. 3.2 Môi trư ng, hóa ch t và thi t b Môi trư ng nuôi: Tripticase soya agar (TSA), Luria-Bertani (LB), Tripticase Soya Broth (TSB) Môi trư ng và hóa ch t xác nh các c tính sinh lý sinh hóa vi khu n: Môi trư ng: MR-broth, Nitrate broth, Trypton, Casein, Gelatin, Starch, Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB), Simmon’s citrate agar,… Hóa ch t nhu m: Crystal violet, iodine, c n 96%, safranin, malachite green 5% Hóa ch t pha thu c th : alpha naphthol, KOH, sulphanilic acid, acid acetic, Trung tâm Học liệu ĐH 2 , HgCl2, HCl Tài c, phenol red, methyl nghiên cứu alpha naphthylamine, H2O Cần Thơ @ m liệu học tập và red Hóa ch t khác: NaCl, K2HPO4, KH2PO4, các lo i ư ng (glucose, arabinose, xylose, sucrose, mannitol), urê,… Hóa ch t trong phương pháp PCR Hóa ch t ly trích ADN : Na3PO4, Tris-HCl (10mM, pH 9), Lysozyme, CH3COONH4, Chloroform, TE (pH 8, Tris 10 mM, EDTA 1 mM), isopropanol,… Hóa ch t trong ph n ng PCR: nư c c t 2 l n, MgCl2 (1,5 mM), buffer Hóa ch t trong i n di: dung d ch TAE 1X, agarose, ethidium bromide Thi t b và d ng c N i h p ti t trùng, t m, t s y, t l nh, vortex, cân phân tích, kính hi n vi, micropipet, èn c n, que c y, que tán, ĩa petri, ng nghi m,… Máy ly tâm, máy chu kỳ nhi t, b i n di, bàn c UV, máy ch p gel. 14