Đề Tài: Thu nhận Enzym Papain để ứng dụng vào phản ứng thủy phân Protein trong bánh dầu đậu phộng.

Chia sẻ: Pham Ngoc Linhdan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:92

Thêm vào BST

Báo xấu

307
lượt xem 112
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong phạm vi luận văn này, chúng tôi sẽ tiến hành thu nhận enzyme papain cs trong nhựa đu đủ và ứng dụng tính chất thủy phân protein của enzyme papain để làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng đã được ép lấy dầu. Chúng tôi chọn enzyme papain vì đây là enyme có hoạt tính protease cao, hiện diện nhiều trong nhựa trái đu đủ, một loại cây được trồng rất phổ biến ở nước ta. ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề Tài: Thu nhận Enzym Papain để ứng dụng vào phản ứng thủy phân Protein trong bánh dầu đậu phộng.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ: 604427 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. TRẦN KIM QUI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2009
LỜI CẢM ƠN   Để hoàn thành chƣơng trình cao học và luận văn này, em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô khoa Hóa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. Trƣớc hết, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô khoa Hóa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM, đặc biệt là những thầy cô đã tận tình dạy bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Trần Kim Qui, TS. Lê Việt Tiến đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành luận văn này. Nhân đây, em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên cứu sinh đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn anh Hồ Anh Vũ, anh luôn động viên và đồng hành cùng em trong suốt thời gian học tập cũng nhƣ thời gian em thực hiện luận văn này. Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình đã cho con có đƣợc thành quả nhƣ ngày hôm nay. Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn. Tp.HCM – Ngày 12 tháng 09 năm 2009
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chương 1 TỔNG QUAN ...................................................................................2 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN ......................................................2 1.1.1 Cysteine protease .................................................................................2 1.1.2 Papain ....................................................................................................2 1.1.2.1 Nguồn gốc .......................................................................................2 1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ. ..........................................................3 1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ. ............................................4 1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ .................................................................................................4 1.1.2.2 Tính chất của papain .....................................................................5 1.1.2.2.1 Tính chất vật lý .........................................................................5 1.1.2.2.2 Tính chất hóa học .....................................................................5 a) Cấu tạo hóa học ...........................................................................5 b) Cấu trúc không gian .....................................................................6 c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain .............................................7 d) Phản ứng của papain ...................................................................7 e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain ................9 1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain .................................................10 1.1.2.3.1 Trong y học: .......................................................................10 1.1.2.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm: ..........................................10 1.1.2.3.3 Trong các ngành công nghiệp khác: ..................................10 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ................10 1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ...........................12 1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân ............................................................12 1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân ............................................13 1.3.3 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân: .............................14 1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân ...............................................14 1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân: ......................................15 1.3.5.1 Ƣu điểm: ...........................................................................................15 1.3.5.2 Nhƣợc điểm: .....................................................................................15 1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ....................15 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................17 2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ........................................................................17 2.1.1. Hóa chất .................................................................................................17 2.1.2. Thiết bị ...................................................................................................18 2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN ...................................................................18 2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái.................................................18 2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết ............................................19
2.2.2.1 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9. ................................................20 2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate .................................20 2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl .....................................................20 2.2.2.4 Kết tinh..............................................................................................20 2.2.2.5 Tái kết tinh ........................................................................................21 2.2.2.6 Đông khô chân không. .....................................................................21 2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry .............................22 2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson ........................23 2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl ............................24 2.2.5.1 Nguyên tắc: ......................................................................................24 2.2.5.2 Cách tính: .........................................................................................24 2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen) ..........25 2.2.6.1 Nguyên tắc........................................................................................25 2.2.6.2 Tiến hành .........................................................................................25 2.2.6.3 Cách tính ..........................................................................................26 2.2.7 Xác định đạm amoniac ..........................................................................26 2.2.7.1 Nguyên tắc........................................................................................26 2.2.7.2 Tiến hành .........................................................................................27 2.2.7.3 Cách tính ..........................................................................................27 2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng với xúc tác papain thô. ........................................................................27 2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo: ....................................................................27 2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng .................................................27 2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân ........................................................................28 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................30 3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ ...........................................30 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI .....................................30 3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ .......31 3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN .......33 3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE ........34 3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ. ..........................................................................................................35 3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ ...........................................................................................................37 3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN ..................................39 3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN. ...........................................................................................41 3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PAPAIN. ............................................................................................44 3.10.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH ...............................................................44 3.10.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ .......................................................45
3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. .........................................46 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. .........................................................................49 3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian............................................................................50 3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so với cơ chất theo thời gian............................................................................57 3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so với cơ chất ....................................................................................................65 3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so với cơ chất ....................................................................................................72 KẾT LUẬN ..............................................................................................................80 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................81 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain ..........................................................................5 Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng ....................................................10 Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng ......................................11 Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo ...................................11 Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng .................................................11 Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. .....30 Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ .....................................................30 Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm ......................................33 Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm ........................................34 Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. .................36 Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế .......................38 Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian ..............................40 Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian ..................................42 Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH .........................................44 Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ ......45 Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất. ...........................................................................................................47 Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất. ...........................................................................................................47 Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất. ...........................................................................................................47 Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48 Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51 Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51 Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....52 Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....53 Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25%.....53 Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....54
3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. .........................................46 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. .........................................................................49 3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian............................................................................50 3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so với cơ chất theo thời gian............................................................................57 3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so với cơ chất ....................................................................................................65 3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so với cơ chất ....................................................................................................72 KẾT LUẬN ..............................................................................................................80 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................81 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain ..........................................................................5 Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng ....................................................10 Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng ......................................11 Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo ...................................11 Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng .................................................11 Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. .....30 Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ .....................................................30 Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm ......................................33 Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm ........................................34 Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. .................36 Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế .......................38 Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian ..............................40 Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian ..................................42 Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH .........................................44 Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ ......45 Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất. ...........................................................................................................47 Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất. ...........................................................................................................47 Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất. ...........................................................................................................47 Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48 Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51 Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51 Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....52 Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....53 Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25%.....53 Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....54
Bảng 3.21. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....55 Bảng 3.22. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....56 Bảng 3.23. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....56 Bảng 3.24. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....58 Bảng 3.25. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....59 Bảng 3.26. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....59 Bảng 3.27. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....60 Bảng 3.28. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....61 Bảng 3.29. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....61 Bảng 3.30. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....62 Bảng 3.31. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....63 Bảng 3.32. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....63 Bảng 3.33. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....65 Bảng 3.34. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....66 Bảng 3.35. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....66 Bảng 3.36. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....68 Bảng 3.37. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....68 Bảng 3.38. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....69 Bảng 3.39. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....70 Bảng 3.40. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....70 Bảng 3.41. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....71 Bảng 3.42. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....72 Bảng 3.43. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....73 Bảng 3.44. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....74 Bảng 3.45. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....75 Bảng 3.46. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....75 Bảng 3.47. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....76 Bảng 3.48. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....77 Bảng 3.49. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....77 Bảng 3.50. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....78 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1. Các loại hoa và trái của cây đu đủ. .............................................................3 Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain ............................................................................6 Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain ..............................................................7 Hình 1.4. Phản ứng hóa học của papain ......................................................................8 Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng thủy phân.........................................................................13 Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ ...................................................................................19 Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đông khô.........................................21 Hình 3.1a. Điện di đồ của nhựa khô ở trái non sơ chế bằng dung môi etanol .........31 Hình 3.1 b. Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ nhựa đu đủ đông khô. ............................................................................................................................32
Hình 3.2. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ albumin. .....................................................................................................................33 Hình 3.3. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ tyrosin. .......................................................................................................................34 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lượng protein sau mỗi giai đoạn tinh chế. .36 Hình 3.5. Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn tinh chế. ................39 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng protein theo thời gian .............40 Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian .............................42 Hình 3.8 Hoạt tính của protein P(UI/ml) trong nhựa khô biến đổi theo pH .............44 Hình 3.9:Hoạt tính của protein trong nhựa khô theo nhiệt độ ..................................46 Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian phản ứng. ...................................................................................................................48 Hình 3.11. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25%. .............................................................................................52 Hình 3.12. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25%. .............................................................................................55 Hình 3.13. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25%. .............................................................................................57 Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50%. .............................................................................................60 Hình 3.15. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50%. .............................................................................................62 Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50%. .............................................................................................64 Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75%. .............................................................................................67 Tại pH 7.0, hiệu suất phản ứng ở mỗi nhiệt độ khác nhau được trình bày trong bảng 3.36 – 3.38. ................................................................................................................67 Hình 3.18. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75%. .............................................................................................69 Hình 3.19. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75%. .............................................................................................71 Hình 3.20. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00%. .............................................................................................74 Hình 3.21. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00%. .............................................................................................76 Hình 3.22. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00%. .............................................................................................78 Hình 3.23 Kết quả điện di của dung dịch sau phản ứng ở các hàm lượng xúc tác khác nhau...................................................................................................................79
1 MỞ ĐẦU Hiện nay vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm và ô nhiễm môi trường đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Trong quá trình sản xuất nước chấm có hàm lượng đạm cao, người ta thường dùng các phương pháp thủy phân protein tạo thành các dung dịch amino acid. Có 3 phương pháp tiến hành phản ứng thủy phân protein: Phương pháp hóa học: thủy phân protein với xúc tác acid, thời gian tiến hành phản ứng là 24 giờ. Nhược điểm của phương pháp này là tạo thành sản phẩm phụ 3- MCPD, một chất độc gây ung thư. Phương pháp dùng men vi sinh: sử dụng chủng nấm Aspergillus oryzae để xúc tác phản ứng thủy phân protein. Nhược điểm của phương pháp này là thời gian thực hiện phản ứng khá dài khoảng từ 6 – 8 tháng. Phương pháp hóa sinh: sử dụng xúc tác là các enzyme protease có nguồn gốc động thực vật làm xúc tác. Phương pháp này có thời gian phản ứng ngắn và không tạo sản phẩm phụ có khả năng gây ung thư. Các phản ứng sử dụng xúc tác enzyme được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực này vì chúng không những cho hiệu suất cao mà thời gian thực hiện phản ứng cũng ngắn hơn so với phản ứng được tiến hành theo phương pháp cổ điển. Hơn nữa các enzyme thường được phân bố rất rộng rãi trong tất cả các mô, cơ quan động vật và thực vật, tế bào vi sinh vật nên tương đối dễ tìm. Trong phạm vi luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành thu nhận enzyme papain có trong nhựa đu đủ và ứng dụng tính chất thủy phân protein của enzyme papain để làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng đã được ép lấy dầu. Chúng tôi chọn enzyme papain vì đây là enzyme có hoạt tính protease cao, hiện diện nhiều trong nhựa trái đu đủ, một loại cây được trồng rất phổ biến ở nước ta. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
2 TỔNG QUAN Chương 1 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 1.1.1 Cysteine protease [8, 9, 19, 34, 43] Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 21-30 kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, ester thiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động. Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. hai loại cysteine proteases là exopeptidase (cathepsin X, Có carboxypeptidase B) và endopeptidases (bromelain, ficain, cathepsin...). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopeptidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide. 1.1.2 Papain 1.1.2.1 Nguồn gốc[2,17, 19, 32 ] Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894). Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
3 1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ.[7, 8, 41] B: hoa lưỡng tính C: hoa đực A: hoa cái D: trái của cây cái E: trái lưỡng tính F: cây đực Hình 2.1. Các loại hoa và trái của cây đu đủ. Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricaceae Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn to àn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
4 1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ.[7, 26, 33] Chi Carica L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống lai tự nhiên của loài C. peltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á. Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi. 1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ [8,41, 45] 1. Nhựa đu đủ có thể gây viêm da. 2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵ amip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp- xe gan. 3. Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng. 4. Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Người dân vùng Ca -ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó. 5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu. 6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm). Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibiotic activity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria). Nó còn được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa. Trong công nghiệp, papain được dùng để LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
5 tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn. Khoảng 1 ,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain. 1.1.2.2 Tính chất của papain[8] 1.1.2.2.1 Tính chất vật lý Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain Tính chất vật lý Giá trị Điểm đẳng điện pI = 8.75 Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04 Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10.27 ± 0.13 Phân tử lượng 20,700 -66.7o Độ triền quang [] 20 D Độ xoắn 17% Vòng hiệu ứng cotton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724 Trị số ma sát f/fo 1.16 Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt. 1.1.2.2.2 Tính chất hóa học[8, 34] a) Cấu tạo hóa học Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
6 b) Cấu trúc không gian Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn  chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử. Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 57OC. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
7 c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys. Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau. Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys. Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser. Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain d) Phản ứng của papain [21, 22, 23, 35] Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
8 R' NH2 R' Cys25 S 25 Cys S C O H N NH NH R 159 His159 C O His HN S - acyl hoùa N R H2O R'NH2 Lieân keát vôùi chaát neàn RCO-NHR' H H O Cys25 S C O 25 Cys S NH R His159 NH N His159 HN Thuûy phaân RCOOH OH Cys25 S C O NH R His159 HN Ñeà acyl hoùa Papain Papain S-S-CH3 + R- SH SH + R-S-S-CH3 Khoâng hoaït ñoäng Hoaït ñoäng NH2+ NH2+ C NH2 Cl C NH2 NH2 Cl NH NH (CH2)3 Papain SH (CH2)3 C OH3 + HNHC C C HNHC NO2 C O O O O NO2 Khoâng maøu Coù maøu Hình 1.4. Phản ứng hóa học của papain LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
9 e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain[8, 6, 38]  Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.5oC và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>100oC) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch. Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 100oC thì cấu trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn. Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ papain. Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng . Trong khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy hóa. Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 37oC. Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%.  pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12. Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau. Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5. Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn định, có thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút.  Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50%. Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain. Các chất gây biến tính mạnh LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
10 như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain. 1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain[7, 8, 25, 29, 46] 1.1.2.3.1 Trong y học: Papain được dùng làm thuốc chống giun sán, ăn không tiêu, chống biếng ăn,… papain còn dùng làm thuốc rửa ráy tai, dùng trong phẫu thuật. Papain có tác dụng lên hệ mạch dùng trị bệnh bạch cầu, viêm họng… 1.1.2.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm: Papain được dùng để làm mềm thịt, dùng để thủy phân gan cá ngừ làm thuốc bổ. Papain còn được dùng trong sản xuất bia vì nó giúp tiêu hóa các protein còn hòa tan trong bia. 1.1.2.3.3 Trong các ngành công nghiệp khác: Papain được dùng làm mềm da trong ngành công nghiệp thuộc da, dùng tẩy các vết máu trên quần áo. Trong công nghiệp mỹ phẩm, papain được dùng để tẩy các vết nám, tàn nhang trên da. 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG Đậu phộng có hàm lượng lipid cao nên thường được dùng để ép dầu. Đậu phộng sau khi ép lấy dầu được gọi là bánh dầu phộng. Theo tài liệu công bố, trung bình trong hạt đậu phộng có thành phần như bảng 1.2: Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng Thành phần Hàm lượng (%) 20 – 34 Protein 40 – 60 Lipid 6.0 – 22 Hydrat carbon 2.0 – 4.5 Xenlulo 1.8 – 4.6 Tro Trong protein của đậu phộng thì glubumin có hàm lượng cao nhất chiếm khoảng 97%, ngoài ra còn có một số hàm lượng không đáng kể albumin, prolamin, glutein. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
11 Trong lipid của đậu phộng có hai loại acid béo no và không no với hàm lượng tính theo phần trăm như bảng 1.3: Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng Tên acid béo Không no (%) No (%) 50 – 70 Oleic 6 - 11 13 – 26 2–6 Linoleic 13 – 26 5–7 Linolenoic Bánh đậu phộng đã tách dầu có thành phần theo bảng 1.4: Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo Thành phần Hàm lượng (%) Protein 48 Acid amin 12.7 Hydrat carbon 26.5 Lipid 8.0 Tro 4.8 Hàm lượng acid amin bao gồm các acid amin cơ bản theo bảng 1.5 : Bảng 1.5. Thành phần acid amin trong đậu phộng Tên cấu tử Hàm lượng (%) Tryptophan 0.5 Leucin 3.5 Isoleucin 1.5 Valin 1.65 Threonin 0.75 Lysin 1.5 Methionin 0.6 Phenylalanin 2.7 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
12 1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân[13, 14, 15] Phản ứng thủy phân là phản ứng phân hủy các chất có sự tham gia của nước. Phản ứng thủy phân là phản ứng quan trọng trong các ngành công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm. Người ta ứng dụng phản ứng thủy phân trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất ra hàng loạt sản phẩm mới khác xa với tính chất của nguyên liệu ban đầu về tính cảm quan, về tính dinh dưỡng của sản phẩm. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp phản ứng thủy phân có hại cho các sản phẩm thực phẩm trong quá trình bảo quản. Phương trình tổng quát của phản ứng thủy phân Enzym R1OH + R2H R1R2 + H2O + - (H , HO ) Các tác nhân làm xúc tác cho phản ứng thủy phân thường là các acid, base hay các enzyme hydrolase trong đó đặc biệt được ứng dụng rộng rãi là các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật và thực vật. Trong phản ứng thủy phân có sự tham gia của một lượng nước rất lớn do đó tốc độ của phản ứng thủy phân chỉ tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất. Như vậy, phản ứng thủy phân xúc tác bởi enzyme là phản ứng đơn phân có thứ bậc 1. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM