Định lượng phyllanthin trong diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus L.) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng sử dụng detector huỳnh quang

TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018<br /> <br /> ĐỊNH LƢỢNG PHYLLANTHIN TRONG DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG<br /> (Phyllanthus amarus L.) BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG<br /> SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG<br /> Trần Thu Huyền*; Chử Đức Thành*; Vũ Tuấn Anh*<br /> Bùi Thị Bích Vân*; Chử Văn Mến*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng phyllanthin trong dược liệu<br /> Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) sử dụng<br /> detector huỳnh quang. Phương pháp: định lượng phyllanthin bằng UPLC kết hợp detector<br /> huỳnh quang sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH.<br /> Kết quả: điều kiện sắc ký gồm: cột C18 (1,6 µm, 2,1 x 50 mm), hệ dung môi acetonitril:nước với<br /> tỷ lệ 55:45 (v/v), tốc độ dòng 0,3 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 2 µl; bước sóng kích thích và phát<br /> xạ huỳnh quang 230 và 340 nm; phương pháp được thẩm định với các tiêu chí: tính tương<br /> thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác. Các tiêu chí đều đáp<br /> ứng yêu cầu của phương pháp định lượng theo quy định. Áp dụng phương pháp phân tích trên<br /> mẫu dược liệu Diệp hạ châu đắng xác định được hàm lượng phyllanthin đạt 0,63%. Kết luận:<br /> đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng phyllanthin trong Diệp hạ châu đắng<br /> bằng UPLC kết hợp detector huỳnh quang.<br /> * Từ khóa: Diệp hạ châu đắng; Phyllanthin; Sắc ký lỏng siêu hiệu năng; Huỳnh quang.<br /> <br /> Quantitative Analysis of Phyllanthin in Phyllanthus Amarus L. using<br /> Ultra-performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector<br /> Summary<br /> Objectives: To develop and validate a method for quantitative analysis of phyllanthin in<br /> Phyllanthus amarus using ultra-performance liquid chromatography (UPLC) with fluorescence<br /> detector (UPLC-FD). Methods: Quantitative analysis of phyllanthin using UPLC-FD with<br /> reversed phase C18 column; the validation of method was in accordance with ICH guideline.<br /> Results: The chromatographic condition was developed including C18 column (1.6µm, 2.1 x 50 mm),<br /> solvent system including acetonitrile:water with ratio of 55:45 (v/v), flow rate of 0.3 mL/min,<br /> injection volume of 2 µL; the excitation and emission wavelengths are 230 and 340 nm ,<br /> respectively; the method was validated with system suitability, specificity, linear range, precision<br /> and accuracy. All the parameters were met ICH guideline for method validation. The validated<br /> method was then applied for quantitation of phyllanthin in Phyllanthus amarus samples ,<br /> the mean content of phyllanthin was 0.63% on dry basis. Conclusion: The quantitative analysis<br /> method of phyllanthin in Phyllanthus amarus using UPLC-FD has been developed and validated.<br /> * Keywords: Phyllanthus amarus; Phyllanthin; Ultra-performance liquid chromatography;<br /> Fluorescence detection.<br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 27/12/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 31/01/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 05/03/2018<br /> <br /> 26<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Diệp hạ châu đắng, còn gọi là Chó đẻ<br /> răng cưa, Chó đẻ thân xanh, là dược liệu<br /> được trồng, mọc hoang và được sử dụng<br /> khá phổ biến ở Việt Nam với công dụng<br /> như: thông tiểu, chữa viêm họng, các bệnh<br /> gan do virut B [1, 2]. Thành phần hóa học<br /> của Diệp hạ châu đắng gồm có lignan<br /> (phyllanthin, hypophyllanthin) [3] và flavonoid.<br /> Phyllanthin là một thành phần chính trong<br /> cây Diệp hạ châu đắng có nhiều tác dụng<br /> như: bảo vệ tế bào gan và ức chế virut<br /> viêm gan B [4], chống oxy hóa, làm giảm<br /> lượng axít uric trong chứng tăng uric máu,<br /> chống viêm [7]. Lữ Thị Kim Chi và<br /> Nguyễn Ngọc Vinh đã phân lập và sử<br /> dụng phyllanthin làm chất chuẩn đánh<br /> dấu cho dược liệu này [4].<br /> Có nhiều nghiên cứu định lượng<br /> phyllanthin trong Diệp hạ châu đắng bằng<br /> sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp detector<br /> UV và PDA [3, 6, 7, 8]. Tuy nhiên, các<br /> phương pháp này cho giới hạn phát hiện<br /> cao và thời gian phân tích mẫu kéo dài.<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành<br /> xây dựng phương pháp định lượng phyllanthin<br /> trong Diệp hạ châu đắng sử dụng UPLC<br /> với detector huỳnh quang giúp rút ngắn<br /> thời gian và tăng độ nhạy phân tích.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Hóa chất và thiết bị.<br /> * Hóa chất và nguyên liệu:<br /> - Chất chuẩn phyllanthin (độ tinh khiết<br /> ≥ 95%) đạt tiêu chuẩn USP (Hãng Sigma<br /> Aldrich, Mỹ). Acetonitril, methanol (Hãng<br /> Merck, Đức). Nước cất đạt tiêu chuẩn<br /> phân tích HPLC. Các hóa chất, dung môi<br /> khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.<br /> <br /> - Diệp hạ châu đắng được thu hái tại<br /> khu vực Ba Vì (Hà Nội) vào tháng 5 - 2017.<br /> Mẫu được lưu trữ, xử lý và bảo quản tại<br /> Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự,<br /> Học viện Quân y.<br /> * Thiết bị:<br /> - Hệ thống máy UPLC UPLC ACQUITY<br /> H-Class (Hãng Waters, Mỹ) kết hợp detector<br /> huỳnh quang FLR ACQUITY (Hãng Waters,<br /> Mỹ). Cột sắc ký CORTECS UPLC® BEH C18<br /> (1,6 µm, 2,1 x 50 mm) (Hãng Waters, Mỹ).<br /> - Cân phân tích MS 205 DU (Hãng<br /> Mettler Toledo, Thụy Sỹ). Tủ sấy UN110<br /> (Hãng Memmert, Đức). Bể siêu âm S-450H<br /> (Hãng Elma, Đức). Các dụng cụ phân tích<br /> khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Điều kiện sắc ký:<br /> Hệ thống phân tích UPLC cao ACQUITY<br /> UPLC H-Class với buồng tiêm mẫu tự động,<br /> có 4 kênh dung môi, detector huỳnh quang.<br /> Thực hiện phân tích trên cột CORTECS<br /> UPLC® BEH C18 (1,6 µm, 2,1 x 50 mm),<br /> nhiệt độ kiểm soát 300C. Pha động bao<br /> gồm dung môi A (nước) và dung môi B<br /> (acetonitrile) được sử dụng theo chương<br /> trình rửa giải đẳng dòng, tốc độ rửa giải<br /> 0,3 ml/phút. Theo dõi sắc đồ ở các bước<br /> sóng 230 và 340 nm trong toàn bộ thí nghiệm,<br /> xử lý bằng phần mềm Empower 3.0.<br /> * Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử:<br /> Chuẩn bị dung dịch chuẩn: hòa tan<br /> phyllanthin chuẩn trong methanol được<br /> dung dịch chuẩn gốc 1,0 mg/ml. Chuẩn bị<br /> dung dịch chuẩn làm việc bằng cách pha<br /> loãng dung dịch chuẩn gốc tới nồng độ<br /> thích hợp của chất chuẩn trong methanol.<br /> Chuẩn bị mẫu thử [8]: cân chính xác<br /> 200 mg dược liệu, tiến hành chiết siêu âm<br /> với 5 x 15 ml methanol trong 30 phút ở<br /> 27<br /> <br /> TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018<br /> nhiệt độ 450C, gộp dịch chiết. Mẫu dịch<br /> chiết được pha loãng 20 lần, lọc qua màng<br /> 0,45 µm, phân tích sắc ký.<br /> <br /> nhiễu nền thấp thể hiện qua sắc ký đồ<br /> của mẫu chuẩn phyllanthin và mẫu thử<br /> Diệp hạ châu đắng.<br /> <br /> Thẩm định phương pháp phân tích: theo<br /> hướng dẫn của ICH với các tiêu chí về<br /> tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng,<br /> độ lặp lại, giới hạn phát hiện [5].<br /> <br /> Bảng 1: Kết quả khảo sát hệ pha động<br /> rửa giải phyllanthin.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> <br /> Độ phân giải<br /> (Rs)<br /> <br /> Hệ số bất<br /> đối (T)<br /> <br /> CAN:nước 45:55<br /> <br /> 1,81 ± 0,16<br /> <br /> 1,25 ± 0,02<br /> <br /> 1. Kết quả khảo sát lựa chọn điều<br /> kiện sắc ký.<br /> <br /> CAN:nước 55:45<br /> <br /> 2,23 ± 0,11<br /> <br /> 1,04 ± 0,01<br /> <br /> CAN:nước 65:35<br /> <br /> 1,92 ± 0,09<br /> <br /> 1,16 ± 0,03<br /> <br /> Tiến hành xử lý mẫu và khảo sát điều<br /> kiện sắc ký theo phương pháp nghiên cứu,<br /> thu thập sắc đồ và phân tích kết quả.<br /> <br /> CAN:nước 75:25<br /> <br /> 1,78 ± 0,12<br /> <br /> 1,11 ± 0,02<br /> <br /> 80.00<br /> <br /> Phyllanthin<br /> <br /> a<br /> <br /> 70.00<br /> <br /> 3.152<br /> <br /> 60.00<br /> <br /> 50.00<br /> <br /> EU<br /> <br /> 40.00<br /> <br /> 30.00<br /> <br /> Hệ pha động<br /> <br /> Thành phần rửa giải pha động được<br /> khảo sát cho thấy với hệ dung môi ACN<br /> và nước (tỷ lệ 55:45) cho hệ số rửa giải cao<br /> và hệ số bất đối thấp của píc phyllanthin<br /> trên sắc đồ.<br /> 2. Kết quả thẩm định phƣơng pháp.<br /> * Tính thích hợp của hệ thống sắc ký:<br /> <br /> 20.00<br /> <br /> 10.00<br /> <br /> 0.00<br /> <br /> 0.00<br /> <br /> 0.50<br /> <br /> 1.00<br /> <br /> 1.50<br /> <br /> 2.00<br /> <br /> 2.50<br /> <br /> 3.00<br /> Minutes<br /> <br /> 3.50<br /> <br /> 4.00<br /> <br /> 4.50<br /> <br /> 5.00<br /> <br /> 5.50<br /> <br /> 6.00<br /> <br /> 50.00<br /> <br /> 45.00<br /> <br /> b<br /> Phyllanthin<br /> <br /> 40.00<br /> <br /> 35.00<br /> <br /> 30.00<br /> <br /> Bảng 2: Kết quả khảo sát tính thích hợp<br /> của hệ thống.<br /> <br /> 3.153<br /> <br /> EU<br /> <br /> 25.00<br /> <br /> 20.00<br /> <br /> 15.00<br /> <br /> 10.00<br /> <br /> Thời<br /> Mẫu Diệp hạ<br /> Diện tích<br /> gian lƣu<br /> châu đắng<br /> píc (µV.s)<br /> (phút)<br /> <br /> 5.00<br /> <br /> 0.00<br /> <br /> -5.00<br /> 0.00<br /> <br /> 0.50<br /> <br /> 1.00<br /> <br /> 1.50<br /> <br /> 2.00<br /> <br /> 2.50<br /> <br /> 3.00<br /> Minutes<br /> <br /> 3.50<br /> <br /> 4.00<br /> <br /> 4.50<br /> <br /> 5.00<br /> <br /> 5.50<br /> <br /> Số đĩa lý Hệ số<br /> thuyết bất đối<br /> (n)<br /> (T)<br /> <br /> 6.00<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của chuẩn phyllanthin<br /> 1.000 ng/ml (a) và mẫu Diệp hạ châu đắng (b).<br /> Lựa chọn điều kiện sắc ký UPLC-FLD<br /> để định lượng phyllanthin bao gồm: cột sắc<br /> ký CORTECS UPLC® BEH C18 (1,6 µm,<br /> 2,1 x 50 mm), hệ dung môi rửa giải<br /> acetonitrile:nước 55:45 (v/v), tốc độ dòng<br /> 0,3 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 2 µl; bước<br /> sóng kích thích và phát xạ huỳnh quang<br /> 230 nm và 340 nm. Với phương pháp xử<br /> lý mẫu và điều kiện sắc ký đã lựa chọn,<br /> sắc ký đồ thu được cho các píc tách rõ ràng,<br /> 28<br /> <br /> Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống<br /> sắc ký, pha mẫu chuẩn theo chỉ dẫn, tiêm<br /> 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống UPLC, tiến<br /> hành sắc ký với điều kiện đã chọn.<br /> <br /> 1<br /> <br /> 3,152<br /> <br /> 282.034<br /> <br /> 3.757<br /> <br /> 1,10<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3,154<br /> <br /> 283.654<br /> <br /> 3.760<br /> <br /> 1,06<br /> <br /> 3<br /> <br /> 3,156<br /> <br /> 282.069<br /> <br /> 3.752<br /> <br /> 1,04<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3,154<br /> <br /> 281.696<br /> <br /> 3.745<br /> <br /> 1,09<br /> <br /> 5<br /> <br /> 3,151<br /> <br /> 282.145<br /> <br /> 3.761<br /> <br /> 1,12<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,154<br /> <br /> 281.369<br /> <br /> 3.749<br /> <br /> 1,11<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> 3,153<br /> <br /> 282.161<br /> <br /> 3.754<br /> <br /> 1,09<br /> <br /> SD<br /> <br /> 0,00<br /> <br /> 787<br /> <br /> 6<br /> <br /> 0,03<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 0,06<br /> <br /> 0,28<br /> <br /> 0,17<br /> <br /> 2,83<br /> <br /> Các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và<br /> hệ thống UPLC sử dụng là phù hợp và<br /> đảm bảo tính ổn định của phép phân tích<br /> định lượng phyllanthin.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018<br /> * Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng:<br /> Một dãy gồm 6 dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau, thay đổi từ 10 - 1.000 ng/ml<br /> đối với phyllanthin, tiến hành sắc ký như điều kiện đã mô tả.<br /> <br /> y = 2669X + 9886<br /> R2 = 0.9991<br /> <br /> Hình 2: Đường chuẩn của phyllanthin.<br /> Để xác định giới hạn phát hiện, tiến hành pha loãng mẫu chuẩn liên tục. Giá trị giới<br /> hạn phát hiện được xác định tại nồng độ có tỷ lệ giá trị tín hiệu/nhiễu nền là 3/1 và giới<br /> hạn định lượng được xác định tại nồng độ có tỷ lệ tín hiệu/nhiễu nền là 10/1.<br /> Bảng 3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hiện phát hiện, giới hạn định lượng.<br /> <br /> Thông số<br /> <br /> Phyllanthin<br /> <br /> Khoảng tuyến tính<br /> (ng/ml)<br /> <br /> Phƣơng trình<br /> tuyến tính<br /> <br /> 10 - 1.000<br /> <br /> Y = 2.669X + 9.886<br /> <br /> Giới hạn<br /> Giới hạn định<br /> Hệ số<br /> phát<br /> hiện<br /> LOD<br /> lƣợng LOQ<br /> 2<br /> tƣơng quan (R )<br /> (ng/ml)<br /> (ng/ml)<br /> 0,9991<br /> <br /> 2,1<br /> <br /> 7,0<br /> <br /> Kết quả khảo sát cho thấy, với khoảng nồng độ phyllanthin từ 10 - 1.000 ng/ml, có sự<br /> tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc chuẩn tương ứng.<br /> Từ phương trình tuyến tính của phyllanthin cho phép xác định giới hạn phát hiện và<br /> giới hạn định lượng hoạt chất này lần lượt là 2,1 và 7,0 ng/ml.<br /> * Độ đúng và độ lặp lại:<br /> Độ đúng: tiến hành phân tích 6 mẫu thử độc lập với chất chuẩn thêm vào tương<br /> ứng với nồng độ 700 ng/ml. Tính lượng thu hồi theo công thức: tỷ lệ thu hồi (%) =<br /> (lượng chất phân tích tìm lại x 100)/lượng chất chuẩn thêm vào.<br /> Độ lặp lại: định lượng 6 mẫu thử độc lập lặp lại trong cùng ngày. Xác định giá trị độ<br /> lệch chuẩn tương đối (RSD).<br /> 29<br /> <br /> TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018<br /> Bảng 4: Kết quả xác định độ đúng.<br /> STT<br /> <br /> Chuẩn thêm vào (ng/ml)<br /> <br /> Chuẩn tìm lại (ng/ml)<br /> <br /> Tỷ lệ chuẩn tìm lại (%)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 700,0<br /> <br /> 720,3<br /> <br /> 102,9<br /> <br /> 2<br /> <br /> 700,0<br /> <br /> 691,6<br /> <br /> 98,8<br /> <br /> 3<br /> <br /> 700,0<br /> <br /> 693,0<br /> <br /> 99,0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 700,0<br /> <br /> 693,7<br /> <br /> 99,1<br /> <br /> 5<br /> <br /> 700,0<br /> <br /> 714,7<br /> <br /> 102,1<br /> <br /> 6<br /> <br /> 700,0<br /> <br /> 690,9<br /> <br /> 98,7<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> 100,1<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 1,88<br /> <br /> Bảng 5: Kết quả xác định độ lặp lại.<br /> Khối lƣợng cân (g)<br /> <br /> Diện tích píc (µV.s)<br /> <br /> Hàm lƣợng (%)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1,0025<br /> <br /> 1.813.565<br /> <br /> 0,67<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1,0102<br /> <br /> 1.702.565<br /> <br /> 0,63<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1,0062<br /> <br /> 1.697.543<br /> <br /> 0,63<br /> <br /> 4<br /> <br /> 1,0029<br /> <br /> 1.805.463<br /> <br /> 0,67<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,0095<br /> <br /> 1.703.254<br /> <br /> 0,63<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1,0074<br /> <br /> 1.693.551<br /> <br /> 0,63<br /> <br /> Lần<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> 0,64<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 3,60<br /> <br /> Kết quả xác định độ đúng và độ lặp lại cho thấy phương pháp có độ đúng và độ lặp<br /> lại tốt với các giá trị RSD tương ứng 1,88% và 3,60%.<br /> * Áp dụng định lượng phyllanthin trong mẫu dược liệu Diệp hạ châu đắng:<br /> Dược liệu Diệp hạ châu đắng được định lượng phyllanthin theo quy trình đã xây<br /> dựng và thẩm định ở trên. Tiến hành phân tích mẫu lặp lại 10 lần. Kết quả cho thấy,<br /> hàm lượng trung bình của phyllanthin là 0,63% trong dược liệu khô. Hàm lượng hoạt<br /> chất chính trong các mẫu Diệp hạ châu đắng không biến động nhiều trong các mẫu.<br /> Bảng 6: Kết quả phân tích hàm lượng hoạt chất trong các mẫu Diệp hạ châu đắng.<br /> Khối lƣợng cân (g)<br /> <br /> Hàm lƣợng phyllanthin trong mẫu<br /> Diệp hạ châu đắng (%)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1,0021<br /> <br /> 0,69<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1,0054<br /> <br /> 0,65<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0,9652<br /> <br /> 0,65<br /> <br /> 4<br /> <br /> 1,0123<br /> <br /> 0,68<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,0356<br /> <br /> 0,60<br /> <br /> Mẫu<br /> <br /> 30<br /> <br />