Định típ phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA: Human Leukocyte Antigen) Locus B bằng phương pháp giải trình tự gen kết hợp với tạo dòng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> ĐỊNH TÍP PHỨC HỢP KHÁNG NGUYÊN BẠCH CẦU NGƯỜI (HLA:<br /> HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN) LOCUS B<br /> BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN KẾT HỢP VỚI TẠO DÒNG<br /> Mai Phương Thảo*, Lê Gia Hoàng Linh**, Nguyễn Thế Vinh**, Hoàng Anh Vũ**, Đỗ Đức Minh**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA: human leukocyte antigen) là phức hợp các<br /> protein màng tế bào đóng vai trò quan trọng trong điều hòa miễn dịch. Định típ HLA rất cần thiết cho việc ghép<br /> tạng cũng như ghép tế bào gốc. Giải trình tự Sanger là một công cụ giúp định típ HLA chính xác, độ phân giải<br /> cao và đang được thực hiện trên toàn thế giới.<br /> Đối tượng và phương pháp: Có 20 đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu được định típ HLA locus<br /> B bằng phương pháp giải trình tự Sanger kết hợp với tạo dòng.<br /> Kết quả: Chúng tôi phát hiện 3 trường hợp mang alen HLA-B đồng hợp tử và 17 trường hợp dị hợp tử. Các<br /> alen HLA-B được xác định bao gồm 07:02, 07:05, 13:01, 15:01, 15:02, 15:12, 15:25, 15:27, 15:35, 18:02, 27:06,<br /> 35:05, 38:02, 40:01, 44:03, 46:01, 55:02, 56:01, 57:01, 58:01.<br /> Kết luận: Kỹ thuật giải trình tự Sanger là một kỹ thuật định típ HLA chính xác và tiết kiệm chi phí.<br /> Từ khóa: phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA), giải trình tự thế hệ mới, phản ứng PCR, giải<br /> trình tự Sanger, tạo dòng<br /> ABSTRACT<br /> HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN LOCUS B (HLA-B) TYPING<br /> BY SANGER SEQUENCING AND CLONING<br /> Mai Phuong Thao, Le Gia Hoang Linh, Nguyen The Vinh, Hoang Anh Vu, Do Duc Minh<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 219 – 225<br /> Objectives: Human leukocyte antigen, a cell-surface protein complex, is responsible for the regulation of the<br /> immune system. HLA typing is neccesary step in stem cell and organ transplantation. Sanger sequencing is an<br /> accurate tool that can provide high resolution typing and has been applied worldwide.<br /> Methods: HLA-B 20 objects participated in the study were sequenced and cloned if nessesary.<br /> Results: HLA-B was found homozygous in 3 cases and heterozygous in 17 cases. Identified alleles were<br /> 07:02, 07:05, 13:01, 15:01, 15:02, 15:12, 15:25, 15:27, 15:35, 18:02, 27:06, 35:05, 38:02, 40:01, 44:03, 46:01,<br /> 55:02, 56:01, 57:01, 58:01.<br /> Conclusion: HLA typing by Sanger sequencing and cloning is accurate and cost-saving.<br /> Keywords: human leukocyte antigen (HLA), next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction<br /> (PCR), sanger sequencing, cloning<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ hệ thống các protein trên bề mặt hầu hết các tế<br /> bào trong cơ thể, được mã hóa từ locus các gen<br /> Hệ thống phức hợp kháng nguyên bạch<br /> nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6,<br /> cầu người (HLA: Human leukocyte antigen) là<br /> chúng đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng<br /> <br /> *Bộ môn Sinh lý-Sinh lý bệnh-Miễn dịch – Khoa Y – ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> **Trung tâm Y sinh học phân tử - ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: TS.BS. Đỗ Đức Minh ĐT: 0932999989 Email: ducminh@ump.edu.vn<br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Nhi Khoa BV. Nhi Đồng 1 219<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> miễn dịch, giúp hệ thống miễn dịch trong cơ hiếm, mới.<br /> thể phân biệt được các tế bào trong cơ thể và Ngày càng có nhiều các alen HLA mới được<br /> các tế bào ngoại lai để từ đó có thể tấn công các phát hiện, do đó các bộ kit này cần được cập<br /> tế bào lạ xâm nhập(4). nhật liên tục.<br /> Các gen mã hóa cho hệ thống HLA được<br /> Trong khi đó, trên thế giới, việc định típ<br /> chia thành 3 lớp chính, trong đó chủ yếu là lớp I<br /> HLA dựa chủ yếu vào phương pháp xác định<br /> (HLA-A, HLA-B và HLA-C) và lớp II (HLA-<br /> trình tự nucleotid bằng phương pháp Sanger<br /> DRB1 và HLA-DQB1) tham gia vào quá trình<br /> tương tác giữa mảnh ghép và kí chủ. Trên mỗi hoặc giải trình tự thế hệ mới (SBT: sequence-<br /> phân tử HLA đều có vùng nhận diện, cấu trúc based typing) với độ phân giải có thể chấp nhận<br /> protein của vùng nhận diện này thường khác trên lâm sàng là 4 chữ số, đây được xem là<br /> biệt giữa các cá thể và đây là cơ sở để định típ phương pháp chính xác và đáng tin cậy nhất<br /> HLA. Vùng nhận diện này được mã hóa từ exon hiện nay và là tiêu chuẩn vàng trong việc xác<br /> 2, 3 của các gen HLA lớp I và exon 2 của gen định HLA ở các trung tâm cấy ghép lớn(6).<br /> HLA lớp 2. Do đó, thông qua nghiên cứu này, chúng tôi<br /> Kỹ thuật định típ HLA hiện tại ở Việt Nam muốn tiến hành nghiên cứu áp dụng quy trình<br /> vẫn dùng hai phương pháp khuếch đại DNA xác định phức hợp HLA, mà đầu tiên là locus<br /> bằng chuỗi mồi đặc hiệu (SSP-PCR: sequence-<br /> HLA-B, bằng phương pháp giải trình tự với độ<br /> specific primer polymerase chain reaction và<br /> phân giải 4 chữ số nhằm khắc phục các nhược<br /> SSO-PCR: sequence-specific oligonucleotide<br /> điểm của phương pháp PCR truyền thống.<br /> polymerase chain reaction). Hai kỹ thuật này có<br /> nguyên lý tương tự nhau và đã được phát minh ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU<br /> vào khoảng 20 năm trước. Trong phản ứng SSP- Đối tượng nghiên cứu<br /> PCR, các bộ mồi (primer) được thiết kế sẵn để Chúng tôi tiến hành định típ HLA locus B<br /> nhận diện các vùng đa hình ở các locus HLA, các cho 20 người có nguồn gốc Kinh tình nguyện<br /> típ HLA sau đó sẽ được xác định bằng cách điện tham gia nghiên cứu.<br /> di sản phẩm PCR trên thạch agarose, phương Phương pháp nghiên cứu<br /> pháp này chỉ cho độ phân giải của HLA ở mức 2<br /> chữ số. Phương pháp SSO-PCR hiện đại hơn, có<br /> Thiết kế nghiên cứu<br /> độ phân giải cao hơn đạt mức 4 chữ số, cũng Cắt ngang mô tả hàng loạt ca.<br /> dựa trên nền tảng thực hiện phản ứng PCR bằng Tách chiết DNA bộ gene<br /> bộ mồi được thiết kế sẵn, nhưng sau đó sản Tiến hành lấy 2 ml máu tĩnh mạch, cho vào<br /> phẩm PCR sẽ không được phân tích trên thạch ống chống đông có EDTA, lắc đều nhẹ nhàng.<br /> agarose mà sẽ được chuyển lên một màng lai, tại Genomic DNA của các tế bào bạch cầu trong<br /> đó một bộ các phân tử đầu dò oligonucleotide có máu toàn phần được tách chiết trong vòng 24<br /> gắn chất chỉ thị sẽ được lai với sản phẩm PCR và giờ bằng bộ kit GeneJetTM whole blood genomic<br /> sau đó típ HLA sẽ được xác định dựa vào các DNA purification (Thermo Scientific, Mỹ) theo<br /> chất chỉ thị gắn trên các đầu dò. Các kỹ thuật hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.<br /> định típ HLA này còn nhiều nhược điểm: Phản ứng PCR khuếch đại và giải trình tự gen<br /> Độ phân giải thấp (2-4 chữ số). mục tiêu<br /> Tốn thời gian (một lần phản ứng SSO-PCR Cặp mồi được thiết kế và tổng hợp (IDT,<br /> chỉ xác định được 1 locus HLA). Mỹ) dựa trên trình tự DNA của gen HLA-B<br /> Không phát hiện hoặc dễ nhầm lẫn trong các mang mã số NG_023187 trong kho dữ liệu của<br /> trường hợp bệnh nhân mang các alen HLA NCBI và tham khảo từ tác giả Lazaro(3) (Bảng 1).<br /> <br /> <br /> 220 Hội Nghị Khoa Học Nhi Khoa BV. Nhi Đồng 1<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bảng 1. Cặp mồi được sử dụng để khuếch đại trình Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50<br /> tự exon 2, 3 và vùng lân cận của gen HLA-B cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả giải<br /> Tên mồi<br /> Đoạn gen<br /> Trình tự chuỗi (5’-3’)<br /> Tm<br /> 0<br /> trình tự DNA được phân tích bằng phần mềm<br /> khuếch đại ( C)<br /> CLC Main Workbench.<br /> 5UT-F GACTCAGAATCTCCTCAG Exon 2, 3 và 61,5<br /> ACGCCGA vùng lân cận Thực hiện chuyển gen<br /> Bin3M13- GGCCATCCCCGGCGACC (1073 bp) 64,5<br /> Các mẫu sau khi giải trình tự được so với<br /> R TAT<br /> trình tự chuẩn từ kho dữ liệu của NCBI Blast<br /> Thiết lập điều kiện cho các PCR khuếch đại tương<br /> server, hla.org và IMGT Blast của EBI để xác<br /> ứng với bộ mồi<br /> định alen HLA-B của các đối tượng tham gia<br /> Mỗi tube PCR có thể tích 15µl chứa các nghiên cứu. Với các mẫu có các alen HLA-B dị<br /> thành phần: 1,5µl PCR buffer 10X; 1,5µl dNTP hợp tử khó xác định, chúng tôi sử dụng phương<br /> 2,5mM, 0,75µl cho mỗi mồi xuôi và ngược pháp tạo dòng chuyển một alen vào vector<br /> (10nM/µl), 0,1µl TaKaRa TaqTM HotStart plasmid. Sản phẩm PCR được nhân dòng trực<br /> Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2µl genomic tiếp vào vector pGEM-T dạng mạch thẳng có<br /> DNA (20-50ng/µl) và 8,4µl nước cất 2 lần khử đầu dính T (theo bộ kit pGEM®-T Easy Vector<br /> ion. Các phản ứng luôn kèm theo một chứng âm Systems-Promega, Mỹ). Sản phẩm nhân dòng<br /> không chứa DNA để kiểm soát ngoại nhiễm. được nhiệt biến nạp vào tế bào khả biến E. coli<br /> Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực hiện DH5, plasmid mang gen lacZ giúp chọn lọc<br /> trên máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức). những khuẩn lạc có gen chèn dựa trên sự chọn<br /> Chu kỳ nhiệt: khởi đầu tại 980C trong 3 phút, lọc màu sắc trắng/xanh của khuẩn lạc trên môi<br /> tiếp theo với 40 chu kỳ lặp lại các bước 980C: 20 trường nuôi cấy chứa X-gal, IPTG và Ampicillin.<br /> giây, 620C: 20 giây, 720C: 1 phút; kế tiếp với bước Plasmid tái tổ hợp được tách ra từ các khuẩn lạc<br /> 720C: 2 phút. Trữ sản phẩm PCR tại 40C. Kiểm trắng bằng kit PureYieldTM Plasmid Miniprep<br /> tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose System (Promega, Mỹ) và kiểm tra sự có mặt của<br /> 2% và nhuộm bằng Diamond™ Nucleic Acid gen HLA-B bằng PCR với các cặp mồi 5UT-F và<br /> Dye (Promega-Mỹ). Bin3M13-R với cùng thể tích và chu trình luân<br /> nhiệt như ở bước đầu tiên. Sản phẩm PCR từ<br /> Kỹ thuật giải trình tự<br /> plasmid sẽ được giải trình tự cũng bằng cặp mồi<br /> Bảng 2. Cặp mồi được sử dụng để giải trình tự trình từ Bảng 2 và đọc kết quả bằng phần mềm CLC<br /> tự exon 2, 3 và vùng lân cận của gen HLA-B Main Workbench. Kết quả giải trình tự lần 2 sẽ<br /> Tên mồi Trình tự chuỗi (5’-3’) Vị trí đọc<br /> có kết quả đồng hợp tử, dựa vào kết quả của 2<br /> Seq-BIn2- Chiều ngược,<br /> GGA TCT CGG ACC CGG AG lần giải trình tự sẽ giúp xác định 2 alen dị hợp tử<br /> R exon 2<br /> Bin3M13-R Chiều ngược, trên gen HLA-B.<br /> GGCCATCCCCGGCGACCTAT<br /> exon 3<br /> Thực hiện so sánh kết quả sử dụng phần mềm<br /> Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng BLAST của EBI<br /> Exosap-IT glycerol solution (Affymetrix-Mỹ)<br /> Phần mềm HLA BLAST của EBI là một phần<br /> theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và<br /> mềm online miễn phí có thể truy cập vào ở địa<br /> được thực hiện phản ứng cycle sequencing với<br /> chỉ https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/blast.html.<br /> BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit<br /> (Applied Biosystems, Mỹ) cặp mồi theo Bảng 2. Sau khi truy cập và lựa chọn chế độ so sánh<br /> Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, cần thiết, toàn bộ trình tự DNA của exon 2 và 3<br /> hòa tan trong Hi-Di formanide, biến tính ở của các mẫu sẽ được nhập vào hệ thống.<br /> 95C trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự Ngưỡng xác định (% identities) và mức độ<br /> DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic dương tính (% positive) của mẫu phải đạt 100%<br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Nhi Khoa BV. Nhi Đồng 1 221<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> mới được chấp nhận và phân típ HLA-B. KẾT QUẢ<br /> Nếu vẫn chưa phân định được alen kết quả, Phản ứng PCR khuếch đại exon 2,3 và vùng<br /> kết quả cuối cùng sẽ được chọn dựa theo các lân cận của gen HLA-B cho sản phẩn có hình<br /> alen HLA phổ biến và mô tả rõ (CWD: common ảnh kích thước đúng với thiết kế ban đầu khi<br /> and well-documented) của Hiệp hội Phù hợp điện di trên gel agarose 1% (Hình 1).<br /> mô và Di truyền miễn dịch Hoa Kỳ (ASHI: Kết quả giải trình tự 20 mẫu cho thấy có 4<br /> American Society for Histocompatibility and mẫu đồng hợp tử sẽ được phân tích tiếp tục trên<br /> Immunogenetics) phiên bản 2.0.0. hệ thống BLAST của EBI (Hình 2), còn lại 16 mẫu<br /> dị hợp tử sẽ được tiến hành tạo dòng (Hình 3).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Kết quả PCR khuếch đại exon 2,3 và vùng lân cận của gen HLA-B<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Kết quả HLA-B đồng hợp tử<br /> <br /> <br /> <br /> 222 Hội Nghị Khoa Học Nhi Khoa BV. Nhi Đồng 1<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Kết quả HLA-B dị hợp tử<br /> Sau khi chuyển 1 alen HLA-B vào vector được khuếch đại có kích thước khoảng 1000bp<br /> DNA và tiến hành nhiệt biến nạp vào tế bào khả (Hình 5).<br /> biến E. coli DH5, các tế bào khả biến sẽ được ủ<br /> nuối cấy trên môi trường thạch LB qua đêm ở<br /> nhiệt độ 370C. Các tế bào sẽ tạo khúm trên thạch<br /> LB như trên Hình 4. Chỉ có các khúm tế bào màu<br /> trắng được chọn để tiếp tục tiến hành ly trích<br /> DNA sau đó.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5. Sản phẩm PCR lần 2<br /> Kết qủa giải trình tự lần 2 của các mẫu được<br /> tạo dòng đều cho sóng đơn dưới dạng đồng hợp<br /> tử (Hình 6).<br /> Phối hợp hai lần giải trình tự sẽ giúp xác<br /> Hình 4. Các khúm vi khuẩn xanh và trắng mọc trên định được 2 alen HLA-B di hợp tử. Kết quả các<br /> thạch LB alen HLA-B trên 20 mẫu tham gia nghiên cứu<br /> DNA ly trích từ khúm vi khuẩn màu trắng được tóm tắt trong Bảng 3 với 4 mẫu cho kết quả<br /> được dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng đồng hợp tử và 16 mẫu cho kết quả dị hợp tử.<br /> PCR lần 2 khuếch đại đoạn gen HLA-B chèn Trong đó, các alen phổ biến nhất là 15:02, 46:01,<br /> vào vector plasmid với cặp mồi trong Bảng 1 38:02 và 40:01 với tần suất lần lượt 20%, 10%,<br /> cho kết quả phù hợp với dự đoán, băng DNA 7,5% và 7,5%.<br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Nhi Khoa BV. Nhi Đồng 1 223<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6. Các kết quả trình tự trước và sau khi tạo dòng<br /> Bảng 3. Kết quả định típ HLA-B của 20 đối tượng bằng phương pháp giải trình tự kết hợp với tạo<br /> tham gia nghiên cứu dòng. Các alen HLA-B được xác định trong<br /> TT Trạng thái Alen 1 Alen 2 %ID %Positive nghiên cứu này bao gồm 07:02, 07:05, 13:01,<br /> 1 Dị hợp tử 13:01 58:01 100 100 15:01, 15:02, 15:25, 15:27, 18:02, 27:06, 35:05, 38:02,<br /> 2 Đồng hợp tử 40:01 X 100 100 40:01, 44:03, 46:01, 55:02, 56:01, 57:01, 58:01 đều là<br /> 3 Đồng hợp tử 15:02 X 100 100<br /> các alen đã được báo cáo trong dân số người<br /> 4 Dị hợp tử 40:01 46:01 100 100<br /> 5 Dị hợp tử 15:27 58:01 100 100<br /> Kinh Việt Nam trước đây(1). Một số alen lần đầu<br /> 6 Dị hợp tử 46:01 56:01 100 100 mô tả là 15:12 và 15:35. Kết quả nghiên cứu này<br /> 7 Dị hợp tử 15:02 15:25 100 100 cũng cho thấy số trường hợp mang alen HLA-B<br /> 8 Dị hợp tử 07:05 57:01 100 100 đồng hợp tử khá hiếm phù hợp với tính đa hình<br /> 9 Dị hợp tử 15:25 15:35 100 100 rất cao của locus HLA-B trong nhiều chủng tộc<br /> 10 Dị hợp tử 15:25 38:02 100 100<br /> như người Kinh Việt Nam, người Hán Trung<br /> 11 Dị hợp tử 18:02 38:02 100 100<br /> Quốc, Nhật Bản và Thái Lan(1,2,5,7) với số liệu<br /> 12 Dị hợp tử 15:02 44:03 100 100<br /> 13 Dị hợp tử 15:01 15:25 100 100 được so sánh trong Bảng 4. Các alen phổ biến ở<br /> 14 Dị hợp tử 15:02 35:05 100 100 người Việt Nam cũng thể hiện phần nào trong<br /> 15 Đồng hợp tử 46:01 X 100 100 nghiên cứu này là 15:02, 46:01 và 40:01, điều này<br /> 16 Dị hợp tử 27:06 55:02 100 100 góp phần cho thấy tính tương đồng giữa người<br /> 17 Dị hợp tử 15:12 44:03 100 100 Kinh Việt Nam, người Hán Trung Quốc và<br /> 18 Đồng hợp tử 15:02 X 100 100<br /> người Thái khi 2 trong 3 alen phổ biến nhất của<br /> 19 Dị hợp tử 15:02 27:06 100 100<br /> 20 Dị hợp tử 07:02 38:02 100 100<br /> HLA-B ở cả 3 dân số đều là 46:01 và 40:01(1,5,7).<br /> Ngoài ra, nghiên cứu của chúng tôi cũng sử<br /> BÀN LUẬN dụng phương pháp giải trình tự Sanger cho kết<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây quả chính xác hơn ở độ phân giải 4 chữ số so với<br /> dựng hoàn chỉnh phương pháp định típ HLA-B các phương pháp SSO-PCR truyền thống.<br /> Bảng 4. So sánh kết quả tần suất lưu hành phổ biến của các alen HLA-B giữa các nghiên cứu<br /> Dân số Việt Nam Trung Quốc Thái Lan Nhật Bản<br /> (1) (7) (5) (2)<br /> Tác giả Chúng tôi Hoa và cs Shen và cs Nakkam và cs Ikeda và cs<br /> Năm tiến hành 2018 2008 2014 2017 2014<br /> Thứ tự từ tần suất lưu hành cao nhất đến thấp<br /> Các alen lưu hành phổ biến<br /> Tô đậm là các alen phổ biến chung trong dân số châu Á<br /> <br /> <br /> <br /> 224 Hội Nghị Khoa Học Nhi Khoa BV. Nhi Đồng 1<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Dân số Việt Nam Trung Quốc Thái Lan Nhật Bản<br /> (1) (7) (5) (2)<br /> Tác giả Chúng tôi Hoa và cs Shen và cs Nakkam và cs Ikeda và cs<br /> 15:02 (20) 15:02 (13.5) 46:01 (14.4) 46:01 (16.8) 51:01 (8.9)<br /> HLA-B (%) 46:01 (10) 46:01 (11.5) 40:01 (11.7) 13:01 (9.1) 35:01 (8.2)<br /> 40:01 (7.5) 38:02 (6.5) 13:01 (8.4) 40:01 (6.9) 40:02 (7.9)<br /> Phương pháp Sanger sequencing SSO-PCR SSO-PCR SSO-PCR SSO-PCR<br /> 2. Ikeda N, Kojima H, Nishikawa M, et al (2015) Determination of<br /> KẾT LUẬN HLA-A, -C, -B, -DRB1 allele and haplotype frequency in<br /> Định típ HLA bằng kỹ thuật giải trình tự Japanese population based on family study. Tissue Antigens,<br /> 85(4):252–259.<br /> Sanger có ưu điểm là có khả năng xác định các 3. Lazaro A, Tu B, Yang R, Xiao Y, Kariyawasam K, Ng J, Hurley<br /> alen cơ bản, phổ biến, đã được mô tả rõ ở độ CK (2013) Human leukocyte antigen (HLA) typing by DNA<br /> sequencing. Methods Mol Biol Clifton NJ, 1034:161–195.<br /> phân giải 4 chữ số, giá thành rẻ. Tuy nhiên, nó<br /> 4. Mosaad YM (2015) Clinical Role of Human Leukocyte Antigen<br /> vẫn có điểm giới hạn là khó xác định cụ thể típ in Health and Disease. Scand J Immunol, 82(4):283–306.<br /> HLA độ phân giải cao hơn nếu chỉ dựa vào trình 5. Nakkam N, Konyoung P, Kanjanawart S, Saksit N, Kongpan T,<br /> Khaeso K, Khunarkornsiri U, Dornsena A, Tassaneeyakul W,<br /> tự exon 2 và 3 mà còn cần phải có trình tự các Tassaneeyakul W (2018) HLA Pharmacogenetic Markers of<br /> exon và intron còn lại để có thể định típ HLA Drug Hypersensitivity in a Thai Population. Front Genet, doi:<br /> chính xác trước xu hướng ngày càng có nhiều 10.3389/fgene.2018.00277.<br /> 6. Sanchez-Mazas A, Vidan-Jeras B, Nunes JM, et al (2012)<br /> alen mới được mô tả và đưa vào dữ liệu của Strategies to work with HLA data in human populations for<br /> IMGT. Việc tiếp tục xác định trình tự các exon và histocompatibility, clinical transplantation, epidemiology and<br /> population genetics: HLA-NET methodological<br /> intron còn lại bằng phương pháp giải trình tự<br /> recommendations. Int J Immunogenet, 39(6):459–476.<br /> Sanger cần nhiều thời gian và công sức, vì vậy 7. Shen Y, Cao D, Li Y, et al (2014) Distribution of HLA-A, -B, and -<br /> cần phải có một phương pháp có khả năng giải C Alleles and HLA/KIR Combinations in Han Population in<br /> China. J Immunol Res, doi: 10.1155/2014/565296.<br /> trình tự hàng loạt, đồng thời các exon và intron<br /> này và phương pháp giải trình tự thế hệ mới<br /> Ngày nhận bài báo: 20/05/2019<br /> được xem như là một ứng cử viên phù hợp cho<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/07/2019<br /> việc định típ HLA trong tương lai.<br /> Ngày bài báo được đăng: 05/09/2019<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Hoa BK, Hang NTL, Kashiwase K, et al (2008) HLA-A, -B, -C, -<br /> DRB1 and -DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population<br /> in Vietnam. Tissue Antigens, 71(2):127–134.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Nhi Khoa BV. Nhi Đồng 1 225<br />