Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong tơ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:77

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm nuôi cấy thu nhận sinh khối hệ sợi nấm linh chi đen Amauroderma subresinosum và khảo sát một số hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm cũng như các phân đoạn cao chiết. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong tơ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TƠ NẤM LINH CHI ĐEN AMAURODERMA SUBRESINOSUM Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG Sinh viên thực hiện : TRẦN LÊ VIỆT HÀ MSSV: 1151110113 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TƠ NẤM LINH CHI ĐEN AMAURODERMA SUBRESINOSUM Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG Sinh viên thực hiện : TRẦN LÊ VIỆT HÀ MSSV: 1151110113 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện dựa trên cơ sở thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh. Các số liệu, kết quả trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố ở bất kỳ công trình nào khác. TP. HCM, ngày 20 tháng 8, năm 2015 Trần Lê Việt Hà
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được cuốn đồ án một cách tốt đẹp, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ quý thầy cô, gia đình cũng như bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn và lời chúc sức khỏe đến ban lãnh đạo trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã truyền đạt cho em những kiến thức về chuyên ngành trong suốt quá trình học tập tại trường, giúp cho em nắm vững lý thuyết cũng như thực hành. Em xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Hoàng Dũng đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đồ án cũng như lúc viết bài báo cáo, để hôm nay em có thể hoàn thành bài báo cáo tốt nhất của mình. Và em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị và các bạn cùng làm việc tại phòng Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành công việc một cách tốt nhất. Con vô cùng cảm ơn ba mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên con trong suốt quá trình học tập. Cám ơn bạn bè, tập thể lớp 11DSH04 đã hỗ trợ, chia sẻ việc học tập trong thời gian 4 năm Đại học.
MỤC LỤC MỤC LỤC ......................................................................................................................... i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................... iv DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ v DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................................. vi MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài.................................................................................... 1 2. Tình hình nghiên cứu ........................................................................................ 1 3. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................... 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu ......................................................................................... 3 5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 3 6. Các kết quả đạt được của đề tài ....................................................................... 3 7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp ................................................................................... 4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 5 1.1 Nấm linh chi ....................................................................................................... 5 1.1.1 Khái quát chung ............................................................................................ 5 1.1.2 Đặc điểm sinh học......................................................................................... 6 1.1.3 Điều kiện sống của nấm linh chi .................................................................. 8 1.1.4 Sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi .................................. 8 1.1.5 Tác dụng trị liệu của nấm Linh chi............................................................. 13 1.2 Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) ............................................ 16 1.2.1 Vị trí phân loại................................................................................................ 16 1.2.2 Đặc điểm hình thái ......................................................................................... 17 1.2.3 Các nghiên cứu về nấm Linh chi đen ............................................................ 19 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 20 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 20 i
2.2 Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................... 20 2.3 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 20 2.3.1 Thiết bị............................................................................................................ 20 2.3.2 Hóa chất .......................................................................................................... 20 2.3.3 Môi trường sử dụng........................................................................................ 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 21 2.4.1 Theo dõi sự tăng sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng. ...... 21 2.4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi đen A. subresinosum ..... 21 2.4.3 Khảo sát hoạt tính của tơ nấm linh chi khi chiết với các phân đoạn dung môi khác nhau. ................................................................................................................ 25 2.4.4 Xác định thành phần có trong các phân đoạn dịch chiết thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................................ 29 2.5 Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN............................................................... 31 3.1 Thu nhận sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng ................... 31 3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi A. subresinosum ............ 33 3.2.1 Định tính anthraglycosid ................................................................................ 33 3.2.2 Định tính flavonoid ........................................................................................ 33 3.2.3 Định tính acid béo .......................................................................................... 34 3.2.4 Định tính alkaloid ........................................................................................... 35 3.2.5 Định tính tinh dầu........................................................................................... 36 3.2.6 Định tính carotenoid....................................................................................... 36 3.2.7 Định tính phytosterol...................................................................................... 36 3.2.8 Định tính steroid ............................................................................................. 37 3.2.9 Định tính tanin................................................................................................ 38 3.2.10 Định tính đường khử .................................................................................... 38 3.2.11 Định tính antocyanosid ................................................................................ 39 3.2.12 Định tính saponin ......................................................................................... 40 ii
3.2.13 Định tính acid uronic.................................................................................... 41 3.2.14 Định tính acid hữu cơ ................................................................................... 41 3.3 Khảo sát hoạt tính cao chiết Methanol tổng của tơ nấm Linh chi đen ......... 44 3.3.1 Khả năng kháng khuẩn của tơ nấm linh chi trong cao Methanol.................. 44 3.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết Methanol tổng................................. 45 3.4 Khảo sát hoạt tính các phân đoạn cao của tơ nấm Linh chi A.subresinosum ..................................................................................................................................... 47 3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm linh chi ................................... 47 3.4.2 Khả năng kháng oxy hóa của các loại cao chiết ............................................ 49 3.5 Kết quả phân tích thành phần có trong cao chiết tơ nấm A. subresinosum bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................. 55 Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 59 4.1 Kết luận ................................................................................................................ 59 4.2 Kiến nghị .............................................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 60 PHỤ LỤC iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DMSO : Dimethylsunfoxide DPPH : 2,2 diphenyl-1-pycryl-hydrazyl HPLC : High-performance liquid chromatography IC50 : The half maximal Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế 50%) LB : Luria Bertani MeOH : Methanol OD : Optical Density PDA : Potato Dextrose Agar PD-broth : Potato Dextrose Broth UV : Ultra Violet iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi .......................... 8 Bảng 1.2 Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi ................... 10 Bảng 1.3 Lục bảo Linh chi và các tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590)............................... 13 Bảng 3.1 Khả năng tích lũy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng của nấm linh chi đen. ........... 31 Bảng 3.2 Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết .......................... 42 Bảng 3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học có trong các loại tơ nấm Linh chi.................... 43 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao MeOH thu được trên ................... 44 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao MeOH thu được .......................... 46 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn cao thu được trên đĩa thạch .......................................................................................................................................... 47 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Hexane thu được ......................... 50 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Chloroform thu được .................. 51 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Ethyl acetate thu được ................ 52 Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Nước thu được .......................... 53 v
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu tạo nấm Linh chi .................................................................................................. 7 Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi ........................................................................ 7 Hình 1.3 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum. (Corner, 1993) ................... 17 Hình 1.4 Quả thể của A.subresinosum ..................................................................................... 19 Hình 2.1 Quy trình thu nhận dịch chiết tơ nấm để phân tích thành phần hóa hoc ................... 22 Hình 2.2 Sơ đồ điều chế cao chiết chứa hoạt chất từ tơ nấm Linh chi đen .............................. 26 Hình 2.3 Phản ứng trung hòa gốc DPPH ................................................................................. 28 Hình 2.4 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Hexane và Chloroform. ............................ 30 Hình 2.5 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Ethyl acetate và Nước. ............................. 30 Hình 3.1 Khả năng tích lũy sinh khối của sợi nấm Amauroderma subresinosum trong môi trường lỏng................................................................................................................................ 32 Hình 3.2 Định tính anthraglycosid ........................................................................................... 33 Hình 3.3 Định tính flavonoid ................................................................................................... 33 Hình 3.4 Định tính acid béo ..................................................................................................... 34 Hình 3.5 Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer .................................................................... 35 Hình 3.6 Định tính alkaloid với thuốc thử Bouchardat ............................................................ 35 Hình 3.7 Định tính carotenoid.................................................................................................. 36 Hình 3.8 Định tính phytosterol ................................................................................................. 36 Hình 3.9 Định tính steroid........................................................................................................ 37 Hình 3.10 Định tính tanin........................................................................................................ 38 Hình 3.11 Định tính đường khử trước khi đun......................................................................... 38 Hình 3.12 Định tính đường khử sau khi đun ............................................................................ 39 Hình 3.13 Định tính antocyanosid ........................................................................................... 39 Hình 3.14 Định tính saponin .................................................................................................... 40 Hình 3.15 Định tính acid uronic ............................................................................................... 41 Hình 3.16 Định tính acid hữu cơ ............................................................................................. 41 Hình 3.17 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao MeOH ....................................................... 45 Hình 3.18 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao MeOH thu được. ...... 46 vi
Hình 3.19 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Hexane ...................................................... 48 Hình 3.20 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Chloroform ............................................... 48 Hình 3.21 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Ethyl acetate.............................................. 49 Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Hexane thu được. ..... 50 Hình 3.23 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Chloroform thu được. .................................................................................................................................................. 51 Hình 3.24 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Ethyl acetate thu được. .................................................................................................................................................. 52 Hình 3.25 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao nước thu được. ......... 53 Hình 3.26 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết ................................................................. 54 Hình 3.27 Sắc ký đồ của dung dịch cao Hexane đo ở bước sóng 254 nm ............................... 55 Hình 3.28 Sắc ký đồ của dung dịch cao Chloroform đo ở bước sóng 254 nm ........................ 56 Hình 3.29 Sắc ký đồ của dung dịch cao Ethyl acetate đo ở bước sóng 254 nm ...................... 57 Hình 3.30 Sắc ký đồ của dung dịch cao Nước đo ở bước sóng 254 nm .................................. 58 vii
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc. Các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhân Linh chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời. Sách “Thần nông bản thảo” đã nói: “Linh chi là thuốc kết tinh được cái quý của mây mưa trên núi cao, cái tinh của ngũ hành trong ngày đêm mà khoe năm sắc nên có thể giữ sức khỏe cho các bậc đế vương”. Đến đời Minh (năm 1590) trong sách “Bản thảo cương mục”, tác giả Lý Thời Trân đã phân nấm Linh chi thành “Lục bảo Linh chi” theo sáu màu sắc xanh, trắng, đỏ, vàng, đen, tím và khái quát tác dụng trị liệu của Linh chi theo từng màu. Nhưng nói chung các loại Linh chi đều có tính bình, không độc, có tác dụng chữa trị tốt đối với những bệnh về tim mạch, phổi, gan… Đến nay với sự phát triển Khoa học – kỹ thuật, nấm Linh chi còn được chứng minh tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi… Chính vì thế, việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng nấm Linh chi vẫn đang được chú trọng. Việc nuôi trồng cũng như thu hoạch quả thể nấm Linh chi tốn khá nhiều thời gian. Amauroderma subresinosum là một loại nấm Linh chi đen thường thấy ở các rừng quốc gia Việt Nam. Đây là một loại nấm hiếm trong họ Ganodermataceae, hoạt tính của A. subresinosum hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu thấu đáo. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong tơ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum” để nâng cao hiệu quả sản xuất hoạt tính cần thiết của nấm Linh chi mà không cần chờ thời gian ra quả thể, đáp ứng nhanh nhu cầu sử dụng của con người. 2. Tình hình nghiên cứu ❖ Ngoài nước Trên thế giới, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm Linh chi cũng như những ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau. 1
Trong một nghiên cứu của Mekkaway, Min và cộng sự (1998) cho biết Ganoderiol F, ganodermanontriol, acid ganoderic beta, ganodermanondiol, ganoderma nontriol, acid ganolucidic A, gucidumol B có trong dịch chiết nước của Linh chi có tác dụng chống HIV và còn nhiều ứng dụng có lợi khác của nấm Linh chi. Năm 2014, Huey Jen Lin và cộng sự, nghiên cứu một loại protein điều hòa miễn dịch từ nấm Linh Chi Ganoderma lucidum có khả năng chữa lành nhanh vết thương sau khi phẫu thuật điện ở mô gan chuột. ❖ Trong nước Những năm gần đây, tại Việt Nam, trên thị trường thuốc y học cổ truyền dân tộc cả nước, đặc biệt tại TP.HCM, xuất hiện nhiều loại thuốc mới mang tên Linh chi với giá bán rất đắt (mắc hơn nhân sâm). Hiện nay, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh trong nước và xuất khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành chế biến nuôi trồng, nghiên cứu thăm dò những dược chất có trong nấm Linh chi. Một số công trình nghiên cứu khoa học đã công bố như: “Bước đầu nghiên cứu tác dụng nấm linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua một số chỉ số lipid máu ở chuột cống” [15],“Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của nấm Linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) trên chuột gây suy gan thực nghiệm” (Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan), “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) đối với cấu trúc mô tinh hoàn chuột nhắt trắng dòng SWISS khi bị chiếu xạ liều cao” (Đoàn Suy Nghĩ) [4], “Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan – Việt Nam” (Nguyễn Minh Khang) [13]. 3. Mục đích nghiên cứu Nuôi cấy thu nhận sinh khối hệ sợi nấm linh chi đen Amauroderma subresinosum và khảo sát một số hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm cũng như các phân đoạn cao chiết. 2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Thu nhận sinh khối của tơ nấm Linh chi Amauroderma subresinosum. - Định tính sơ bộ thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi A.subresinosum. - Khảo sát khả năng kháng khuẩn và khả năng bắt các gốc tự do có trong tơ nấm Linh chi A.subresinosum. 5. Phương pháp nghiên cứu - Tăng sinh tơ nấm Linh chi trong môi trường lỏng để thu nhận sinh khối. - Thu dịch chiết tơ nấm để khảo sát sơ bộ thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi. - Dùng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch để khảo sát khả năng kháng khuẩn của tơ nấm với các phân đoạn dung môi khác nhau. - Dùng phương pháp thử nghiệm DPPH để khảo sát khả năng chống oxy hóa của tơ nấm Linh chi A.subresinosum. - Ghi chép và xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2010, Statgraphics centurion. 6. Các kết quả đạt được của đề tài - Thời gian nuôi cấy thích hợp để thu nhận sinh khối tơ nấm linh chi là 18 ngày trong điều kiện nhiệt độ 30oC và đặt nơi tránh ánh sáng. - Trong thành phần tơ nấm linh chi, được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 30oC thì có các hoạt chất: antraglycosid, acid béo, tinh dầu, phytosterol, tanin, đường khử, saponin, acid uronic, acid hữu cơ,… - Trong các phân đoạn chiết của tơ nấm, cao Methanol được đánh giá có khả năng kháng khuẩn tốt nhất với các loại vi khuẩn S.aureus, B.subtilis, E.coli, P.aeruginosa ở nồng độ 20 mg/ml cũng như khả năng bắt gốc tự do IC50 là 1,094 mg/ml. - Các phân đoạn cao chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, nước của tơ nấm có khả năng kháng khuẩn yếu hơn cao tổng Methanol, khả năng kháng oxy hóa 3
của cao Chloroform và cao Ethyl acetate thì tốt hơn cao tổng, cao Hexane thì tương đương, còn cao nước thì khả năng kháng oxy hóa yếu nhất. - Phân tích các phân đoạn chiết, thu được trong cao Hexane có 3 hợp chất, cao Chloroform có 1 chất, cao Ethyl acetate có 2 chất và cao nước thì chưa xác định được. 7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp Đồ án gồm có 4 chương: • Chương 1: Tổng quan tài liệu • Chương 2: Vật liệu và phương pháp • Chương 3: Kết quả và thảo luận • Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm linh chi 1.1.1 Khái quát chung Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganodermataceae, người miền Bắc xưa còn gọi là nấm lim. Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung…[8]. Nấm Linh chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ. Hình thái quả thể nấm Linh chi được mô tả như sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt hoặc thận. Mặt trên mũ có vân đồng tâm và bóng loáng, màu vàng cam cho đến màu đỏ đậm hoặc nâu đen. Mặt dưới phẳng, có nhiều lỗ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử. Cuống nấm đặc và cứng, sậm màu và bóng loáng [12]. Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm. Trong sách “Thần nông bản thảo“ cách đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi” thời nhà Minh với các khái quát công dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590). Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau: ▪ Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi) ▪ Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi) ▪ Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi) ▪ Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi) ▪ Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi) ▪ Tử chi (Linh chi tím) Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại, trong đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crôm... Chúng đã được sử dụng là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, 5
đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào với hàm lượng rất thấp [17]. Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…, việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm. Đồng thời nghiên cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng. Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác (1720- 1791) cũng thấy đề cập đến Linh chi. Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định, đây là nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam. Trong quyển “Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” [2], giáo sư Đổ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu của loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dược. 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganodermataceae) Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài [6]. Quả thể nấm Linh chi gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối diện với mũ nấm). Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3 cm. Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm. Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt. Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng như láng vecni. Mũ nấm có đường kính 2 – 15 cm, dày 0,8 – 1,2 cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm. Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm. 6
Hình 1.1 Cấu tạo nấm Linh chi 1.1.2.2 Chu trình sống của nấm Linh chi Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm. Bào tử nấm thường có dạng hình trứng cụt đầu màu rỉ sắt. Cấu tạo vỏ ngoài bào tử gồm hai lớp, có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Lớp ngoài nhẵn, lớp trong có nhiều gai nhỏ, nối liền hai lớp vỏ. Bào tử nấm Linh chi có kích thước trung bình 4,5 – 6,5 x 8,5 – 11,5 µm. Khi nuôi cấy tơ nấm lúc đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, sợi nấm ngăn thành nhiều phần và hình thành các bào tử vô tính. Chu kỳ sống của nấm Linh chi giống như hầu hết các loại nấm khác, nghĩa là cũng bắt đầu từ các bào tử, bào tử nảy mầm phát triển thành hệ mạng sợi tơ nấm. Gặp điều kiện thuận lợi sợi nấm sẽ kết thành nụ nấm, nụ phát triển thành chồi, rồi tán và thành tai trưởng thành. Trên tai nấm sinh ra các bào tử, bào tử phóng thích ra ngoài và chu trình lại tiếp tục. [1] Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi 7
1.1.3 Điều kiện sống của nấm linh chi Linh chi phân bố khắp nơi trên thế giới, ký sinh và hoại sinh rộng khắp ở các loài cây lá rộng đến lá kim, thậm chí ở các tre trúc, dừa, cau, cọ dừa và nho. Nấm Linh chi tiết ra các men phân giải màng tế bào endopolygalacturonase (endo – PG) và endopectin methyl – translinase (endo – PMTE) có tác dụng làm nhũn tế bào thực vật rất mạnh gây nên tình trạng các loại gỗ và rễ cây bị mùn ra [9]. Bảng 1.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi [1] Yếu tố Nuôi tơ Ra quả thể Nhiệt độ 20 – 35oC 25 – 30oC Ẩm độ 55 – 60% 90 – 95% pH 4,5 – 6 4,5 – 6 Ánh sáng Không cần Cần ánh sáng tán xạ từ mọi phía 1.1.4 Sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi Nấm Linh chi có lịch sử lâu đời trong nền y học cổ truyền các nước phương Đông. Nhiều thành phần có hoạt tính sinh học đã được xác định trong quả thể, tơ nấm, bào tử và trong cả môi trường nuôi cấy. Polysaccharide và triterpenes là hai hoạt chất sinh học chính trong số đó. Polysaccharide từ Ganoderma lucidum được tìm thấy trước tiên trong phòng thí nghiệm có tác dụng chống lại ung thư theo con đường điều biến miễn dịch. hoạt chất sinh học chống lại sự oxy hóa, cân bằng lượng cholesterol, chống tăng huyết áp, bảo vệ gan, tổng hợp cholesterol…[25] Nghiên cứu mới nhất của Viện Nghiên cứu Linh chi hoang dại của Trung Quốc cho thấy, Linh chi có lượng germanium (một chất giúp khí huyết lưu thông, thúc đẩy sự hấp thụ ôxy của tế bào) cao hơn nhân sâm 8 lần. Lượng polysaccaride cao trong Linh chi giúp tăng cường miễn dịch, làm mạnh gan, cô lập và diệt các tế bào ung thư. Các hoạt chất của Linh chi còn có tác dụng chống dị ứng, chống viêm, chữa trị các 8
bệnh liên quan đến tim và huyết áp, làm mạnh thận, bổ phổi, mạnh gân xương, tăng trí nhớ, chống lão hóa…[6] 1.1.4.1 Ganoderma polysaccharide (GLPs) Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi. Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng. Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị. Một trong 4 loại polysaccharide có đặc tính chống khối u mạnh nhất là beta – D glucan, trọng lượng phân tử 3,12 * 105 hoặc 1,56 * 106, có tác dụng chống ung thu và tăng tính miễn dịch cho cơ thể. [24, 25] Vai trò dược học của polysaccharide: ▪ Kích thích hệ miễn dịch cơ thể ▪ Gia tăng khả năng dung nạp oxygen ▪ Giảm gốc tự do hydroxyl ▪ Ức chế khối u phát triển ▪ Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ ▪ Tăng chức năng gan ▪ Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường ▪ Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein 1.1.4.2 Ganoderic Acid Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử ganoderma. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng G.acid cao thì có nhiều vị đắng. 9