Đồ án tốt nghiệp: Tuyển chọn các chủng Trichoderma đối kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:104

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm tuyển chọn các chủng Trichoderma spp có khả năng đối kháng nấm bệnh trên phế phẩm thanh long và chủng có khả năng sinh enzyme cellulase để tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Tuyển chọn các chủng Trichoderma đối kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG TRICHODERMA ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH TRÊN CÂY THANH LONG VÀ TĂNG CƯỜNG QUÁ TRÌNH Ủ COMPOST TỪ CÀNH THANH LONG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : THÁI QUỐC ĐÔNG MSSV: 1615101003 Lớp: 16HSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2018
LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của chúng em dưới sự hướng dẫn của tiến sĩ Nguyễn Thị Hai tại Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH của trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kỳ hình thức nào. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện THÁI QUỐC ĐÔNG
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã tạo điều kiện học tập để chúng em có thành quả như ngày hôm nay. Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, chúng em được các thầy cô trong Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập tại trường, cũng như trong quá trình thực hiện đồ án. Chúng em xin được gửi đến các Thầy Cô lời cảm ơn chân thành nhất, nhờ có Thầy Cô đã trang bị kiến thức cho chúng em để có thể thực hiện đồ án này. Chúng em cũng xin cảm ơn Thầy Cô trong phòng thí nghiệm và các bạn cùng khóa đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để chúng em hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo chúng em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn các Thầy Cô trong hội đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này. Chúng em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc sức khỏe trân trọng nhất. Trong quá trình làm đồ án, do kinh nghiệm còn thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên có nhiều thiếu sót, mong các Thầy cô bỏ qua. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện THÁI QUỐC ĐÔNG
MỤC LUC MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết đề tài ..................................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................... 1 3. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................... 1 4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 2 5. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. Tình hình sản xuất thanh long ở Việt Nam .............................................................. 3 1.1.1. Tình hình trồng thanh long ở Việt Nam ................................................................ 3 1.1.2. Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long ........................................................... 4 1.2. Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. ............................................................................................................................ 4 1.2.1. Phân loại nấm Neoscytalidium dimidiatum. .......................................................... 4 1.2.2. Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum ............................................... 5 1.3. Giới thiệu nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long. .............. 7 1.3.1. Phân loại ................................................................................................................ 7 1.3.2. Hình thức xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp ................................................ 8 1.4. Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm nâu và thán thư trên cây thanh long …10 1.5. Giới thiệu về nấm Trichoderma spp đối kháng với nấm bệnh. .............................. 11 1.5.1. Phân loại .............................................................................................................. 11 1.5.2. Các chủng nấm Trichoderma spp. ....................................................................... 11 1.5.3. Đặc điểm hình thái............................................................................................... 14 1.5.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .................................................................................. 15 1.5.5. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của Trichoderma spp. ..................................... 16 1.5.6. Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma spp phòng trừ nấm gây bệnh….16 1.5.7. Một số nghiên cứu của nấm Trichoderma spp trên thế giới và ở Việt Nam. ...... 18 1.5.8. Ứng dụng Trichoderma trong nông nghiệp ......................................................... 19 1.6. Khái niệm về ủ compost và sử dụng xác bã hữu cơ để ủ compost......................... 21 1.6.1. Định nghĩa compost ............................................................................................. 21 1.6.2. Cấu trúc và cơ chế phân giải cellulose ................................................................ 21 1.6.3. Các thông số quan trọng trong quá trình ủ compost............................................ 24 i
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 25 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ......................................................................... 25 2.2. Vật liệu ................................................................................................................... 25 2.2.1. Nguồn nấm đối kháng, nấm gây bệnh ................................................................. 25 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị .............................................................................................. 25 2.2.3. Hóa chất ............................................................................................................... 25 2.3. Phương pháp nhiên cứu. ......................................................................................... 28 2.3.1. Quan sát khả năng sinh trưởng của Trichoderma ............................................... 30 2.3.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma spp . .......................................................................................................................... 30 2.3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh. .......................................................................................................................... 32 2.3.4. Thử nghiệm ủ compost cành thanh long của nấm Trichoderma spp ................. 34 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................... 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 38 3.1. Đặc điểm sinh trưởng nấm Trichoderma spp ......................................................... 38 3.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma spp .......................................................................................................................... 45 3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng nấm Trichoderma spp ... .......................................................................................................................... 45 3.2.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng Trichoderma spp. ...... 47 3.3. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma spp với nấm bệnh .......................................................................................................................... 49 3.3.1. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum. .......................................................................................... 49 3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên thanh long. .................................................. 52 3.4. Thử nghiệm ủ compost từ cành thanh long của chủng nấm Trichoderma T3 ........ 54 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 57 4.1.Kết luận.................................................................................................................... 57 4.2.Kiến nghị ................................................................................................................. 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 58 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 62 Phụ lục A: Bảng số liệu thô ......................................................................................... 62 ii
A.1. Tốc độ sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. ......................... 62 A.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. .......................................................................................................................... 63 A.3. Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. .......................................................................................................................... 64 A.4. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 3 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 65 A.5. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 5 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 66 A.6. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 7 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 67 A.7. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 5 ngày. .......................................................................................................................... 68 A.8. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 7 ngày. .......................................................................................................................... 68 A.9. Hàm lượng C, N trong cành thanh long. ............................................................... 69 Phụ lục B: Số liệu xử lý ............................................................................................... 70 B.1. Tốc độ sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. ......................... 70 B.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. .......................................................................................................................... 71 B.3. Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. .......................................................................................................................... 73 B.4. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 3 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 74 B.5. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 5 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 76 B.6. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 7 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 78 B.7. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 5 ngày nuôi cấy. ............................................................................................................. 80 B.8. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 7 ngày nuôi cấy. ............................................................................................................. 81 Phụ lục C: Hình ảnh .................................................................................................... 82 C.1. Hình thái đại thể của các chủng nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA ................................................................................................................... 82 iii
C.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) và chitinase (cm) sau 2 ngày nuôi cấy của các chủng Trichoderma spp. ................................................................................... 83 C.3. Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum. .................................................................................................................... 89 C.4. Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp .......................................................................................................................... 93 iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma .......................................... 12 Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí .............. 24 Bảng 3.1 Đường kính tản nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy ......................... 38 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng nấm Trichoderma spp 45 Bảng 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma sau 2NSC... 47 Bảng 3.4 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum ..................................................................................................................... 49 Bảng 3.5 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma với nấm Colletotrichum sp. ....................................................................................................................................... 52 Bảng 3.6 Kết quả phân tích hàm lượng carbon, hàm lượng nitơ tổng của nguyên liệu ban đầu và 30 ngày sau ủ. .................................................................................................... 55 v
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái vi thể của Neoscytadium dimidiatum................................................ 5 Hình 1.2 Hình thái vi thể của Colletotrichum gleoesporioides ..................................... 7 Hình 1.3 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum. ............................................... 11 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử cellulose ............................................................................. 22 Hình 3.1 Chủng nấm Trichoderma T22, T26 và T3 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA. .............................................................................................................................. 45 Hình 3.2 Vòng phân giải enzyme cellulase của chủng Trichoderma T3,T22,T26,TC6,TC15 ...................................................................................................... 47 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma T3,T22,T7. ... 49 Hình 3.4. Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). ......................................................................................................................... 51 Hình 3.5 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). ................................... 51 Hình 3.6 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). ......... 51 Hình 3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). ......... 52 Hình 3.8 Đĩa nấm đối chứng Colletotrichum sp ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua)…53 Hình 3.9 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) ............................ 53 Hình 3.10 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) ............................ 54 Hình 3.11 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) ............................ 54 Hình 3.12 Thanh long trước khi ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm. ............ 55 Hình 3.13 Thanh long ở công thức đối chứng 30 ngày sau ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm ............................................................................................................. 56 vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CMC: Carboxymethyl cellulose NT: nghiệm thức ĐC: đối chứng PDA: Potato D-glucose Agar VSV: vi sinh vật NSC: ngày sau cấy vii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết đề tài Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất châu Á và cũng là nước xuất khẩu thanh long hàng đầu thế giới. Thanh long hiện đang được trồng tại các vùng chuyên canh quy mô lớn như các tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An. Diện tích ba tỉnh này chiếm 92% tổng diện tích cả nước. Trong đó, Bình Thuận là tỉnh có diện tích trồng thanh long cao nhất nước. Theo số liệu mới nhất của sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Bình Thuận, tính đến ngày 31/12/2017, toàn tỉnh có khoảng 27.845 ha thanh long với sản lượng 696.125 tấn. Đi kèm với sự gia tăng về diện tích và sản lượng thanh long là sự gia tăng về dịch bệnh và lượng phế thải từ cành thanh long. Trong số các dịch bệnh hại trên thanh long, bệnh đốm nâu và bệnh thán thư là hai bệnh hại chính gây ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của thanh long. Việc sử dụng thuốc hóa học có hiệu quả thấp đối với bệnh, đặc biệt trong điều kiện mưa. Vì vậy các nhà khoa học không ngừng tìm kiếm các tác nhân sinh học để quản lý bệnh hại thanh long. Trong bộ sưu tập các chủng Trichoderma của phòng thí nghiệm Viện khoa học ứng dụng, trường Đại học Công nghệ TP.HCM, có nhiều chủng có khả năng đối kháng cao với bệnh đốm nâu (Nguyễn Thị Bích Tuyền, 2016). Tuy vậy, chưa có nghiên cứu đánh giá nào trên bệnh thán thư. Vì vậy, để làm cơ sở chọn tạo các chủng tốt làm chế phẩm trừ bệnh đốm nâu và thán thư (hai bệnh hại chính trên thanh long) cũng như hỗ trợ ủ cành thanh long sinh viên tiến hành đề tài “Tuyển chọn các chủng Trichoderma đối kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long”. 2. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn các chủng Trichoderma spp có khả năng đối kháng nấm bệnh trên phế phẩm thanh long và chủng có khả năng sinh enzyme cellulase để tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long. 3. Mục tiêu nghiên cứu Xác định khả năng sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng Trichoderma spp. 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Xác định khả năng đối kháng với nấm bệnh Neoscytadium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Xác định khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long. Ứng dụng chủng nấm Trichoderma spp ủ compost. 4. Nội dung nghiên cứu Đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng nấm Trichoderma spp. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào cellulase và chitinase của chủng nấm Trichoderma spp. Đánh giá khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của các chủng nấm Trichoderma spp trong điều kiện phòng thí nghiệm. Đánh giá khả năng đối kháng nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long của các chủng nấm Trichoderma spp trong điều kiện phòng thí nghiệm. Xử lý các phế phẩm của cây thanh long bằng phương pháp ủ compost ở phạm vi phòng thí nghiệm. 5. Đối tượng nghiên cứu Các chủng nấm đối kháng Trichoderma spp. Nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long. Phế phẩm thanh long lấy từ Bình Thuận. 2
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình sản xuất thanh long ở Việt Nam 1.1.1. Tình hình trồng thanh long ở Việt Nam Cây thanh long là cây ăn trái thuộc họ xương rồng, có nguồn gốc ở vùng sa mạc thuộc Mexico và Columbia, thuộc nhóm cây nhiệt đới khô. Thanh long được người Pháp mang đến Việt Nam từ thế kỷ 19, trồng rải rác trong sân vườn, đến thập niên 1980 mới được trồng thương mại. Phần lớn thanh long được trồng ở Việt Nam là loài Hylocereus undatus, có vỏ đỏ hay hồng/ruột trắng còn lại là loại ruột đỏ. Loại vỏ đỏ ruột trắng chiếm 95%, 5% còn lại là loại vỏ đỏ, ruột đỏ. Mùa thanh long từ tháng 4 đến tháng 10, rộ nhất từ tháng 5 đến tháng 8. Nhiều giống thanh long được lai tạo để tăng năng suất, chất lượng và phù hợp đất đai và khí hậu từng vùng. Tại Viện Cây ăn quả Miền Nam hiện đang bảo tồn 20 giống thanh long từ nguồn thu thập trong nước và du nhập từ nước ngoài cùng 40 giống thanh long lai, phục vụ công tác nghiên cứu, bảo tồn gen, chọn tạo giống. Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất châu Á và cũng là nước xuất khẩu thanh long hàng đầu thế giới. Diện tích trồng thanh long ở Việt Nam tăng khá nhanh từ 5.512 ha năm 2000 lên đến 35.665 ha diện tích trồng thanh long với tổng sản lượng đạt khoảng 614.346 tấn vào năm 2014. Theo số liệu ước tính sơ bộ năm 2015, diện tích trồng mới gần 5.000 ha, sản lượng đạt khoảng 686.195 tấn. Hiện tại, thanh long đã được trồng rộng rãi ở các tỉnh thành trên toàn quốc. Tuy nhiên, diện tích tập trung lớn nhất là: Bình Thuận, Long An, Tiền Giang (3 tỉnh này đã có hơn 37 ngàn ha) tiếp theo là Tây Ninh, Đồng Nai, một số tỉnh Tây Nguyên và các tỉnh phía Bắc. Phát triển mạnh thành các vùng chuyên canh quy mô lớn tập trung ở các tỉnh như Bình Thuận, Tiền Giang, và Long An. Diện tích thanh long của ba tỉnh này chiếm 92% tổng diện tích và 96% sản lượng của cả nước, phần diện tích thanh long còn lại phân bố ở một số tỉnh miền nam như Vĩnh Long, Trà Vinh, Tây Ninh, Bà Rịa – Vũng Tàu và một số tỉnh Miền Bắc. Bình Thuận là nơi có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất chiếm 63,2% diện tích và 68,4% sản lượng cả nước, kế đến là Long An (chiếm 17,3% diện tích và 14,2% sản lượng) và đứng thứ ba là Tiền Giang (chiếm 10,9% diện tích và 13,7% sản lượng). 3
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.2. Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long Thanh long là cây trồng có giá trị xuất khẩu cao của Việt Nam. Bình Thuận là tỉnh có diện tích trồng thanh long nhiều nhất trong cả nước. Trong quá trình canh tác, nông dân gặp khó khăn trong khâu đảm bảo vệ sinh môi trường. Một trong nhưng nguyên do là sau lượng lớn cành thanh long, bông lép, trái thối sau khi được cắt tỉa không có chỗ tiêu hủy. Như vậy, bình quân mỗi năm có từ 3 – 4 vụ nên lượng phế phẩm từ cây thanh long lớn, nhiều hộ dân đã dùng biện pháp tủ dưới gốc thanh long, hoặc đổ đống ngay tại vườn gây hôi thối, là nguồn phát sinh gây bệnh cho cây thanh long. Điều này vừa ảnh hưởng đến môi trường, vừa không đảm bảo đúng quy trình sản xuất theo tiêu chuẩn ViệtGAP (Theo thời báo Úc, 2017). 1.2. Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. 1.2.1. Phân loại nấm Neoscytalydium dimidiatum. Bệnh đốm trắng hay còn gọi là bệnh đốm nâu, tắc kè, bệnh ma là những tên gọi khác nhau mà bà con nông dân trồng thanh long ở Bình Thuận, Tiền Giang và Long An đặt cho một loại dịch hại mới phát sinh. Theo ghi nhận của Viện Nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam thì trên thực tế bệnh đốm trắng bệnh này đã xuất hiện rải rác đầu tiên vào năm 2008 tại Bình Thuận và Tiền Giang và đến năm 2011 trở lại đây thì bệnh tấn công mạnh và lây lan nhanh hơn. Sau khi phân lập và định danh theo mô tả hình thái của Crous và cộng sự (2006), xác định nguyên nhân gây bệnh đốm trắng là nấm Neoscytalidium dimidiatum. Kết quả này tương tự như với các nghiên cứu ở Đài Loan (Chuang, et al. 2012) và ở Malaysia (Masratul Hawa, et al. 2013). Đặc điểm vị trí phân loại của nấm Neoscytalidium dimidiatum (Agrios, 2005; Crous & Slippers, 2006). 4
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ngành: Ascomyta Lớp: Dothideomycetes Bộ: Botryosphaeriales Họ: Botryosphaeceae Chi: Neoscytalidium Loài: Neoscytalidium dimidiatum Hình 1.1 Hình thái vi thể của N.dimidiatum thuộc ngành nấm túi Neoscytadium dimidiatum. (nguồn internet) (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thường có một nhân, đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo thành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế bào cấu tạo bằng chitin và glucan, đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất, trong nước, trên cạn, thực vật, động vật, một số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật, động vật, người gây nên những thiệt hại lớn. Ascomyta sinh sản sinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào, nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản vô tính bằng bào tử đính (conidia) và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Các bào tử khác tính (+,-) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lưỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi. Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch và giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế. Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở lỗ và quả thể hở. Cơ chế gây bệnh của nấm Neoscytalidium dimidiatum: Bào tử nấm nảy mầm trên bề mặt tiếp xúc rồi xâm nhập vào trong mô gây hoại tử, bệnh gây hại trên thân cành và quả thanh long. 1.2.2. Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum 1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu nước ngoài Theo báo cáo đầu tiên về nấm Neoscytalidium dimidiatum trên cây có múi tại Italya (G. Polizzi et al, 2009) vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới đã được phát hiện và chú ý ở phía Sicily, Italy trong vườn cây có múi, cam ngọt 2 tuổi đã xuất hiện một bệnh 5
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP mới với triệu chứng điển hình là chồi kém phát triển và thối trên thân, cành, gốc ghép, vết thối chảy gôm. Theo nghiên cứu viện nghiên cứu sở nông nghiệp, Đại học quốc gia Đài Loan, Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và 2010 bệnh đốm trắng đã xuất hiện ở một số cây Thanh long tại Đài Loan. Triệu chứng của bệnh là các vết nhỏ, tròn, vết bệnh lõm, màu cam. Bệnh được xác định do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Năm 2008, nấm Neoscytalidium dimidiatum đã phát hiện trên các quả Thanh long trồng ở Malaysia. Neoscytalidium dimidiatum đã gây ra triệu chứng như chấm tròn nhỏ, thối và sau đó mục nát. Mẫu bệnh đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở 250C trong 7 ngày. Nấm thu được nuôi cấy trên môi trường PDA, nấm có quả cành màu đen, đường kính 90mm, hình elip, hình trứng, hình que hoặc hình tròn trong pha lê có 2 vách ngăn. DNA chiết từ sợi nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA thực hiện phản ứng khuếch đại sử dụng mồi ITS4 và ITS5. Cuối cùng thực hiện lây bệnh nhân tạo để so sánh đánh giá bệnh. 1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Sự xuất hiện một loại dịch hại mới phát sinh gần đây gây thiệt hại nghiêm trọng và có xu hướng càng ngày lan rông, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng quả là mối lo ngại cho người nông dân trồng thanh long. Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền nam (2011), bệnh đốm trắng do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra, nấm này còn có tên khác là Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea,…(Crous et al. 2006) bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh và mùa mưa, nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển từ 20 – 30˚C. Ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan mạnh. Bệnh lây theo gió và nguồn nước nhiễm bệnh. Qua theo dõi thấy bệnh hại nặng ở những vùng có mực nước ngầm cao, những vườn vệ sinh kém, rậm rạp và bị che mát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân đạm hay phân bón phân chuồng chưa ủ hoai, vườn sử dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng hay vườn bón thiếu trung, vi lượng đều có tỉ lệ bệnh cao hơn bình thường và khi có bệnh thì khó phòng trừ hơn. Vết bệnh ban đầu là những đốm tròn nhỏ màu trắng, hơi lõm, về sau chuyển sang màu vàng cam và khi bệnh phát triển nặng đốm bệnh trở thành vết loét có màu nâu, hơi nổi lên và gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây, năng suất 6
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP và giá trị thương phẩm của quả. Bệnh thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, quả non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Theo Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2014) khi so sánh trình tự vùng gen ITS- RADN của mười một mẫu phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum tại Viện Nghiên Cứu CNSH và Môi Trường - trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh cho thấy các mẫu phân lập tương đồng rất cao với trình tự của loài Neoscytalidium dimidiatum đã được định danh về hình thái. Hà Thị Thúy và các cộng sự (2016) tại Viện Môi trường Nông nghiệp đã nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long do nấm Neodiumdimidiatum gây ra. Nghiên cứu đã xác định được 2 chủng vi sinh vật có khả năng ức chế Neoscytalidium dimidiatum cao là chủng Bacillus polyfermenticus và Streptomyces fradiea và đảm bảo an toàn sinh học khi đưa ra môi trường. 1.3. Giới thiệu nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long. 1.3.1. Phân loại Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Glomerellales Họ: Glomerellaceae Chi: Colletotrichum Loài: Colletotrichum sp Hình 1.2 Hình thái vi thể của Colletotrichum gloeosporioides (nguồn intrernet) Nấm Colletotrichum có hệ khuẩn ty thật, gồm có sự phát triển sợi nấm mảnh, phân nhánh, không màu và vách ngăn sợi nấm. Hệ sợi nấm có gian bào và nội bào, mỗi tế bào chứa nhiều nhân. Nhiều hạt dầu được sản xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm. Khi chín, sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng (Nguyễn Văn Bá và cs, 2005). Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là bào tử hậu (= bào tử áo = chlamydospores), nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới (Nguyễn Văn Bá và cs, 2005). 7
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Theo Agrios (2005) thì ở giai đoạn vô tính chúng cho ra các bào tử đính đơn bào, có dạng hình thoi, hình liềm hoặc hình trụ không màu và đôi khi có giọt dịch trong bên trong bào tử. Bào tử vô tính được sinh ra trong đĩa đài (acervulus) chứa nhiều đính bào đài (conidiophore) và gai cứng (setae) ở mép bìa đĩa đài hoặc giữa các cành bào đài. Đĩa đài dạng tròn hoặc dạng gối, có sáp, màu đen, có thể được quan sát trên bề mặt môi trường thạch agar bằng kính hiển vi. Trên mô bệnh, đĩa đài được tìm thấy bên dưới lớp biểu bì. Cành bào đài đơn giản, thon dài, bào tử trong suốt, một tế bào, dạng trứng hoặc dạng thon đến dạng liềm (Barnett và Hunter, 1998). Colletotrichum thường sản xuất khối bào tử nhày dính bên trong đĩa đài. Khối bào tử màu hồng hay màu da cam và đĩa đài đôi khi nhầm lẫn với ổ bào tử của nấm Fusarium. Những loài trong chi nấm Colletotrichum có thể hoặc không thể sinh ra gai . Theo Barnett và ctv(1998), trong nuôi cấy, gai cũng có thể không xuất hiện. Các gai dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ. Riêng ở loài Colletotrichum gloeosporioides, Padman và Janardhna còn ghi nhận thêm là mỗi loài nấm đều có bào tử và gai đặc trưng, sự sinh ra gai của nấm Colletotrichum chịu ảnh hưởng của ẩm độ không khí, gai được sinh ra nhiều ở điều kiện ẩm độ không khí tương đối thấp (Nguyễn Văn Bá và ctv., 2005). Phần lớn các chủng nấm Colletotrichum phân lập được ở Việt Nam thuộc loài C. gloeosporioides, chúng có khả năng gây bệnh trên cây thanh long cao hơn so với các loài khác. Các chủng của loài C. gloeosporioides chủ yếu được phân nhóm về mặt di truyền theo nguồn gốc địa lý. Thán thư (Anthracnose) mang nghĩa là “thui đen”, là bệnh hại trên tán lá cây, thân cành hoặc trái với đặc điểm là sự xuất hiện của những đốm màu đen hoặc những vết thương lõm xuống với mép rìa mảnh nhô lên (Agrios, 2005). Nó cũng là nguyên nhân của một số hiện tượng chết ngược của cành non, nhánh. Trong sự xâm nhiễm ở trái, triệu chứng thán thư thường có giai đoạn tiềm ẩn kéo dài. Triệu chứng ở một số cây ăn trái là những đốm nhô cao và có hóa bần trên bề mặt (Agrios, 2005). 1.3.2. Hình thức xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp Để nấm Colletotrichum xâm nhập vào mô kí chủ, chúng có 2 hình thức: Bằng cách bào tử đính nảy mầm và hình thành đĩa áp để xâm nhập trực tiếp 8
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong chi Colletotrichum có cấu trúc xâm nhiễm đặc biệt giúp nấm xâm nhập vào mô kí chủ được gọi là đĩa áp. Đĩa áp được xem là bộ phận rất quan trọng và cần thiết cho sự xâm nhiễm thành công của nấm (Perfec et al, 1990). Trong điều kiện môi trường thích hợp, ống mầm sẽ được tạo ra từ bào tử. Điều này được gọi là nảy mầm hay mọc mầm của bào tử. Với sự tăng trưởng liên tục của ống mầm, đĩa áp sẽ được phân biệt ở hai đầu của nó và dần dần tối màu lại (O'Connell et al, 2000). Trong đó, tín hiệu đầu tiên của bào tử nảy mầm là tiết ra chất extracellular matrix (ECM), chất ECM được coi là dấu hiệu trong suốt quá trình nảy mầm và hình thành đĩa áp, tổng thời gian để bào tử nảy mầm và tạo thành đĩa áp là 6 ˗ 9 giờ. Quá trình hình thành và phát triển của đĩa áp trải qua 7 giai đoạn: (1) Tiết ECM (2) Phân chia nhân (3) Tạo thành vách ngăn đầu tiên (4) Mầm nhú ra (5) Đỉnh phồng lên (6) Tạo thành vách thứ cấp (7) Sự hình thành melanin của đĩa áp Bằng cách xâm nhập thụ động vào mô kí chủ Bên cạnh xâm nhiễm trực tiếp bằng cách hình thành đĩa áp, nấm còn có thể xâm nhiễm bằng các con đường khác một cách thụ động. Nấm có thể xâm nhập qua các lỗ hở tự nhiên hoặc qua các vết thương trên cây (Đường Hồng Dật, 1984). Vết thương trên cây có thể do côn trùng, sâu bọ, tuyến trùng chích hút, cắn phá hoặc do các động vật lớn gây ra (trâu, bò, chim, chuột, gà, vịt, …) ở các bộ phận trên mặt đất và trong đất. Vết thương còn do dụng cụ trong quá trình chăm sóc cây gây ra hoặc do bứng cây đem trồng,… Vết thương cũng có thể là vết nứt trong lúc chồi non, mầm hoa đâm ra từ thân, cành của cây. Ngoài ra, vết thương còn do yếu tố tác động của giông bão, lũ lụt. Sự tích tụ các muối độc trong điều kiện đất ẩm cũng có thể làm cho rễ và cổ rễ bị tổn thương do tế bào ở nơi tiếp xúc với các chất độc đó bị chết đi. Cũng theo ông, các vết thương nhỏ li ti sẽ nhanh chóng được hàn gắn lại nên ít bị kí sinh xâm nhập vào, còn các vết thương to là nơi thuận lợi nhất cho tất cả các mầm bệnh xâm nhập vào. 9
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các cửa ngõ tự nhiên trên cây bao gồm các khí khẩu (Stoma) ở lá, bì khẩu (Lenticles) ở thân, cành và các thủy khẩu (Hydathodes) ở trên lá của một số loài cây. Các cửa ngõ này do không có các bộ phận bao che tốt như lớp cutin hoặc lớp sáp, chúng được cấu tạo hở nên rất dễ bị các loại mầm bệnh lợi dụng và xâm nhập vào một cách dễ dàng. 1.4. Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm nâu và thán thư trên cây thanh long. Để đảm bảo cây thanh long sinh trưởng và phát triển tốt hạn chế bệnh hại cây cần kiểm soát và quản lý từ giống, môi trường, biện pháp canh tác trong phòng trừ và trị bệnh cho cây trồng. Trồng các giống sạch bệnh, cần lựa chọn kỹ các cây con trước khi trồng, các cây có dấu hiệu nhiễm bệnh cần loại bỏ. a. Biện pháp canh tác Trước khi trồng cần làm sạch vườn để loại bỏ các nguồn có nguy cơ gây bệnh cho cây từ đất, nước, xác bã thực vật, dọn dẹp cỏ và các loại dây leo hoang dại xung quanh vườn thanh long. Tỉa cành tạo độ thông thoáng, thu gom và tiêu hủy các bộ phận của cây bệnh bằng cách chôn sâu hoặc đốt, ngoài ra, có thể xử lý bằng các chế phẩm sinh học làm phân bón, không vứt cành, quả bệnh xuống mương nước sẽ làm mầm bệnh dễ lây lan. Bón phân hữu cơ đã ủ hoại mục, cung cấp thêm vôi trước và sau mùa mưa. Bổ sung thêm vi lượng ( Bo, Canxi, Magie, Silic, Bo…) tăng sức kháng chịu cho cây. Cuối mùa khô, những cành còn phấn non nên tiến hành cắt 2 – 3 cm ở đầu mút cành để thoát nước đọng trên cành, giúp thúc nhanh quá trình già hóa cành nhằm hạn chế bệnh gây hại. Không để chồi non trong mùa mưa, nếu chồi non ra phải cắt tỉa hết và khử trùng ngay vết cắt bằng thuốc có chứa gốc đồng, tăng cường chăm sóc cây trong mùa mưa. b. Biện pháp sinh học Các tác nhân sinh học có khả năng phòng bệnh tốt không kém hơn thuốc hóa học nhưng lại an toàn và tiết kiệm chi phí hơn. Có thể bổ sung chế phẩm sinh học Trichoderma trộn với phân hữu cơ bón cho đất nhằm cung cấp nguồn dinh dưỡng cần thiết đồng thời tăng khả năng kiểm soát nguồn bệnh. 10