Độc tính lên nguyên bào xương của xi măng trám bít ống tủy calcium silicate

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> ĐỘC TÍNH LÊN NGUYÊN BÀO XƯƠNG<br /> CỦA XI MĂNG TRÁM BÍT ỐNG TỦY CALCIUM SILICATE<br /> Võ Thị Thủy Tiên, Trần Xuân Vĩnh<br /> Khoa Răng - Hàm - Mặt, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh<br /> Vật liệu nền calcium silicate là vật liệu có hoạt tính sinh học nhờ khả năng kích thích lành thương và hỗ<br /> trợ hình thành mô. Nghiên cứu này đánh giá tính gây độc tế bào của một xi măng trám bít ống tủy nền tricalcium silicate mới (BioRoot RCS; Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Pháp) đối với nguyên bào xương người<br /> so với một loại xi măng đang được sử dụng phổ biến hiện nay (AH26; Dentpsly, Konstanz, Đức). Nghiên cứu<br /> sử dụng mô hình tiếp xúc gián tiếp giữa tế bào với dịch chiết xi măng để đánh giá hai thông số là độc tính<br /> đối với tế bào và khả năng tăng sinh của tế bào. Kết quả cho thấy, dịch chiết BioRoot RCS có độc tính đối<br /> với nguyên bào xương người thấp hơn và mức độ tăng sinh tế bào cao hơn so với AH26. Như vậy, xi măng<br /> trám bít ống tủy nền calcium silicate BioRoot RCS tương hợp sinh học với nguyên bào xương người.<br /> Từ khóa: Độc tính tế bào, tăng sinh tế bào, BioRoot RCS, nguyên bào xương người, xi măng trám bít<br /> ống tủy calcium silicate<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Xi măng trám bít ống tủy cùng với vật liệu<br /> lõi rắn đóng một vai trò quan trọng cho sự<br /> <br /> chất sinh ung tiềm năng như bisphenol-Adiglycidyl ether [2 - 5].<br /> <br /> thành công của điều trị nội nha. Tuy nhiên,<br /> <br /> Dựa trên hoạt tính sinh học nổi bật của vật<br /> <br /> sau khi trám bít ống tủy, xi măng có thể tương<br /> <br /> liệu nền calcium silicate, xi măng trám bít ống<br /> <br /> tác với mô quanh chóp gây ảnh hưởng đến<br /> <br /> tủy<br /> <br /> kết quả sau cùng. Vì vậy, việc nghiên cứu và<br /> <br /> (Septodont, Saint - Maur - des - Fossés,<br /> <br /> đánh giá tính tương hợp sinh học với các tế<br /> <br /> Pháp) chứa tricalcium silicate và zirconium<br /> <br /> bào hiện diện ở vùng quanh chóp của các xi<br /> <br /> oxide đã ra đời. Một số nghiên cứu ban đầu<br /> <br /> măng nội nha là vô cùng cần thiết.<br /> <br /> đã cho thấy BioRoot RCS có hoạt tính sinh<br /> <br /> nền<br /> <br /> calcium<br /> <br /> silicate<br /> <br /> BioRoot<br /> <br /> RCS<br /> <br /> Trước đây, các xi măng trám bít ống tủy<br /> <br /> học, cụ thể là nó phóng thích calcium hydrox-<br /> <br /> được phân thành 5 loại chính theo thành phần<br /> <br /> ide sau khi đông và tạo calcium phosphate khi<br /> <br /> hóa học, gồm oxide kẽm - eugenol, calcium<br /> <br /> tiếp xúc với dịch sinh lý [6; 7]. Ngoài ra, các<br /> <br /> hydroxide, silicone, glass - ionomer và nhựa.<br /> <br /> nghiên cứu còn ghi nhận được BioRoot RCS<br /> <br /> Trong đó, xi măng nền nhựa epoxy AH26<br /> <br /> có độc tính thấp với nguyên bào sợi nướu, tế<br /> <br /> thường được sử dụng trên lâm sàng do có<br /> <br /> bào dây chằng nha chu đồng thời kích thích<br /> <br /> các đặc tính cơ lý tốt [1]. Tuy nhiên, một số<br /> <br /> tiết yếu tố tạo mạch và tạo xương [8 - 10].<br /> <br /> nghiên cứu đã báo cáo về tính gây độc của xi<br /> <br /> Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có<br /> <br /> măng này do sự phóng thích formaldehyde và<br /> <br /> nghiên cứu nào về ảnh hưởng của xi măng<br /> calcium silicate lên nguyên bào xương cũng là<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Xuân Vĩnh, Khoa Răng - Hàm - Mặt,<br /> Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh<br /> Email: vinhdentist@yahoo.com<br /> Ngày nhận: 25/12/2017<br /> Ngày được chấp thuận: 18/3/2018<br /> <br /> TCNCYH 114 (5) - 2018<br /> <br /> những tế bào hiện diện ở vùng quanh chóp.<br /> Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Độc<br /> tính lên nguyên bào xương người của xi măng<br /> trám bít ống tủy BioRoot RCS và sự tăng sinh<br /> 43<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> của nguyên bào xương” nhằm góp phần đánh<br /> <br /> thu nhận từ mô mỡ) được cung cấp bởi Bộ<br /> <br /> giá tính tương hợp sinh học của loại vật liệu<br /> <br /> môn Mô - Phôi - Di truyền, Trường Đại học Y<br /> <br /> mới này.<br /> <br /> khoa Phạm Ngọc Thạch.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> Hai loại xi măng trám bít ống tủy được<br /> khảo sát trong nghiên cứu là xi măng nền cal-<br /> <br /> 1. Đối tượng<br /> Nghiên cứu sử dụng nguyên bào xương<br /> người (được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô<br /> <br /> cium silicate BioRoot RCS (Septodont, SaintMaur-des-Fossés, Pháp) và xi măng nền nhựa<br /> epoxy AH26 không chứa bạc (Dentpsly, Konstanz, Đức) (bảng 1).<br /> <br /> Bảng 1. Hai loại xi măng trám bít ống tủy sử dụng trong nghiên cứu<br /> Xi măng<br /> BioRoot RCS<br /> <br /> AH26 không chứa bạc<br /> <br /> Số lô<br /> <br /> B18997<br /> <br /> 110000440<br /> <br /> Hạn sử dụng<br /> <br /> 08/2018<br /> <br /> 06/2020<br /> <br /> Tricalcium silicate,<br /> zirconium oxide, povidone<br /> <br /> Bismuth (III) oxide,<br /> Methenamine<br /> <br /> Nước, calcium chloride,<br /> hydrosolube polymer<br /> <br /> Bisphenol-A-diglycidyl-ether<br /> <br /> 1 muỗng bột : 5-7 giọt chất lỏng<br /> <br /> Bột: lỏng = 2-3 : 1<br /> <br /> 10 phút<br /> <br /> 4 - 6 giờ<br /> <br /> 4 giờ<br /> <br /> 9 - 15 giờ<br /> <br /> Thành<br /> phần<br /> <br /> Bột<br /> Lỏng<br /> <br /> Tỷ lệ trộn<br /> Thời gian làm việc<br /> Thời gian đông<br /> <br /> 2. Phương pháp<br /> Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được<br /> thực hiện từ tháng 11/2016 đến tháng<br /> 05/2017.<br /> Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro<br /> có nhóm chứng.<br /> Quy trình nghiên cứu<br /> <br /> dịch chiết xi măng bằng phương pháp đếm tế<br /> bào sử dụng buồng đếm hồng cầu.<br /> (i) Đánh giá độc tính đối với nguyên bào<br /> xương người<br /> - Trộn xi măng theo hướng dẫn của nhà<br /> sản xuất, cho vào khuôn có đường kính 4 mm<br /> và chiều cao 1 mm, chờ đến khi xi măng<br /> đông.<br /> <br /> Nghiên cứu gồm 2 quy trình riêng biệt là (i)<br /> <br /> - Ngâm khối xi măng vào môi trường biệt<br /> <br /> đánh giá độc tính của dịch chiết xi măng đối<br /> <br /> hóa và nuôi cấy nguyên bào xương (gọi tắt là<br /> <br /> với nguyên bào xương người bằng thử<br /> <br /> môi trường biệt hóa) theo tiêu chuẩn ISO<br /> <br /> nghiệm MTT và (ii) đánh giá mức độ tăng sinh<br /> <br /> 10993-12:2012 [11]. Sau 24 giờ, thu được<br /> <br /> của nguyên bào xương người khi tiếp xúc với<br /> <br /> dịch chiết xi măng nồng độ 100%. Pha loãng<br /> <br /> 44<br /> <br /> TCNCYH 114 (5) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> dịch chiết thành các nồng độ 50%, 25%,<br /> <br /> giếng với mật độ 1 x 104 tế bào/giếng rồi ủ<br /> <br /> 12,5% và 6,25%.<br /> <br /> trong tủ nuôi tế bào. Sau 24 giờ, hút bỏ môi<br /> <br /> - Chuyển nguyên bào xương lên đĩa 96<br /> <br /> trường biệt hóa ở tất cả các giếng, rửa sạch<br /> <br /> giếng với mật độ 1x10 tế bào/giếng rồi ủ 24<br /> <br /> nhẹ nhàng tế bào bằng dung dịch PBS để bắt<br /> <br /> giờ. Sau đó, hút bỏ môi trường ở tất cả các<br /> <br /> đầu đánh giá mức độ tăng sinh (T0).<br /> <br /> 4<br /> <br /> giếng, rửa sạch nhẹ nhàng tế bào bằng dung<br /> dịch muối đệm phosphate (PBS).<br /> - Cho 100 µl dịch chiết xi măng vào giếng<br /> tương ứng (03 giếng/từng nồng độ dịch chiết<br /> của mỗi loại xi măng) rồi tiếp tục ủ 24 giờ.<br /> <br /> - Cho 200 µl dịch chiết xi măng nồng độ tối<br /> ưu (03 giếng/mỗi thời điểm 2, 4, 6, 8, 10 ngày)<br /> rồi ủ đĩa 96 giếng trong tủ nuôi tế bào.<br /> - Sau mỗi 2 ngày, đếm số lượng tế bào ở<br /> giếng tương ứng như sau: Hút bỏ dịch chiết<br /> <br /> - Sau 24 giờ, hút bỏ dịch chiết. Thêm 100<br /> <br /> cũ rồi rửa sạch nhẹ nhàng tế bào bằng dung<br /> <br /> µl dung dịch MTT (1 mg/ml PBS) vào từng<br /> <br /> dịch PBS. Tiếp theo, cho 20 µl dung dịch<br /> <br /> giếng và ủ thêm 4 giờ. Sau 4 giờ, thêm 100 µl<br /> <br /> Trypsin - EDTA 0,25% vào mỗi giếng, ủ 15<br /> <br /> dung dịch DMSO vào mỗi giếng để hòa tan<br /> <br /> phút để tách tế bào. Sau đó, cho 20 µl môi<br /> <br /> các tinh thể formazan hình thành rồi đo mật độ<br /> <br /> trường biệt hóa vào mỗi giếng, huyền phù tế<br /> <br /> quang (OD) ở bước sóng 490 nm bằng máy<br /> <br /> bào, hút bỏ môi trường. Thu tế bào rồi nhuộm<br /> <br /> phân tích MTT. Mô hình nghiên cứu sử dụng<br /> <br /> Trypan blue 0,4% với tỷ lệ 1:1. Đếm số lượng<br /> <br /> chứng âm là môi trường biệt hóa và chứng<br /> <br /> tế bào bằng buồng đếm hồng cầu dưới kính<br /> <br /> dương là dịch chiết latex theo tiêu chuẩn ISO<br /> <br /> hiển vi đảo ngược theo quy tắc cạnh trên -<br /> <br /> (12)<br /> <br /> 10993-5:2009<br /> <br /> bên phải. Cuối cùng, thay 200 µl dịch chiết<br /> <br /> .<br /> <br /> - Số đo OD được chuyển thành tỷ lệ phần<br /> trăm tế bào sống theo công thức:<br /> 100 x OD490e<br /> % tế bào sống =<br /> OD490b<br /> OD490e: mật độ quang của dịch chiết vật<br /> liệu.<br /> OD490b: mật độ quang của chứng âm.<br /> - Lặp lại thử nghiệm 3 lần.<br /> (ii) Đánh giá mức độ tăng sinh của nguyên<br /> bào xương người.<br /> <br /> mới cho các giếng còn lại rồi tiếp tục ủ trong<br /> tủ nuôi tế bào.<br /> - Lặp lại thử nghiệm 3 lần.<br /> Các biến số trong nghiên cứu được trình<br /> bày trong bảng 2.<br /> Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng<br /> phần mềm SPSS 16.0.<br /> Thống kê mô tả: Số liệu được trình bày<br /> dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn.<br /> Thống kê suy lý: Sử dụng phép kiểm Mann<br /> -Whitney U để so sánh tỷ lệ phần trăm tế bào<br /> sống của từng nồng độ dịch chiết và mật độ tế<br /> <br /> - Tạo dịch chiết xi măng như trên. Dựa trên<br /> <br /> bào tại từng thời điểm giữa 2 loại xi măng.<br /> <br /> kết quả đánh giá độc tính, chọn nồng độ dịch<br /> <br /> Các kiểm định với giá trị p < 0,05 được cho là<br /> <br /> chiết xi măng có tỷ lệ phần trăm tế bào sống<br /> <br /> có ý nghĩa thống kê.<br /> <br /> cao nhất (nồng độ tối ưu) để đánh giá mức độ<br /> tăng sinh.<br /> - Chuyển nguyên bào xương lên đĩa 96<br /> <br /> TCNCYH 114 (5) - 2018<br /> <br /> 3. Đạo đức nghiên cứu<br /> Nghiên cứu in vitro đảm bảo các nguyên<br /> tắc đạo đức trong nghiên cứu y sinh học.<br /> 45<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 2. Các biến số trong nghiên cứu<br /> STT<br /> <br /> Biến số<br /> <br /> Đánh giá<br /> <br /> Đo lường<br /> <br /> 1<br /> <br /> Độc tính tế bào<br /> (Định lượng)<br /> <br /> Tỷ lệ phần trăm<br /> tế bào sống<br /> <br /> Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 490<br /> nm bằng máy phân tích MTT<br /> <br /> 2<br /> <br /> Mức độ tăng sinh của<br /> <br /> Mật độ tế bào<br /> <br /> Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> 1. Độc tính với nguyên bào xương người của các nồng độ dịch chiết BioRoot RCS và<br /> AH26<br /> <br /> Biểu đồ 1. Tỷ lệ phần trăm tế bào sống của nguyên bào xương khi tiếp xúc với dịch chiết<br /> BioRoot RCS và AH26 ở các nồng độ 100%, 50%, 25%, 12,5% và 6,25%<br /> *: p < 0,05 (Kiểm định Mann-Whitney U).<br /> Kết quả cho thấy cả 2 nhóm vật liệu đều không gây độc tế bào cấp tính ở tất cả các nông độ.<br /> Tuy nhiên % tế bào sống của nhóm Bioroot RCS cao hơn so với nhóm AH26.<br /> 2. Mức độ tăng sinh của nguyên bào xương người khi tiếp xúc với dịch chiết BioRoot<br /> RCS và AH26 6,25% (đây là nồng độ không gây độc tế bào)<br /> <br /> 46<br /> <br /> TCNCYH 114 (5) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 1. Mật độ nguyên bào xương (số lượng nguyên bào xương trung bình trên 1 giếng)<br /> khi tiếp xúc với dịch chiết BioRoot RCS và AH26 nồng độ 6,25% tại các thời điểm 0, 2, 4, 6,<br /> 8, 10 ngày<br /> Mật độ tế bào (tế bào/ml) (Trung bình ± Độ lệch chuẩn)<br /> <br /> Vật liệu<br /> (N = 9)<br /> BioRoot<br /> RCS<br /> AH26<br /> <br /> Ngày 0<br /> <br /> Ngày 2<br /> <br /> Ngày 4<br /> <br /> Ngày 6<br /> <br /> Ngày 8<br /> <br /> Ngày 10<br /> <br /> 10000,0<br /> ± 0,0<br /> <br /> 73333,3<br /> ± 31411,3<br /> <br /> 65000,0<br /> ± 53944,4<br /> <br /> 66666,7<br /> ± 25033,3<br /> <br /> 65000,0<br /> ± 28106,9<br /> <br /> 56666,7<br /> ± 41311,8<br /> <br /> 10000<br /> ± 0,0<br /> <br /> 18333,3<br /> ± 9831,9<br /> <br /> 20000,0<br /> ± 15491,9<br /> <br /> 46666,7<br /> ± 28047,6<br /> <br /> 13333,3<br /> ± 10327,9<br /> <br /> 6666,7<br /> ± 8164,9<br /> <br /> 80000<br /> <br /> *<br /> <br /> 70000<br /> 60000<br /> 50000<br /> 40000<br /> 30000<br /> 20000<br /> BioRoot<br /> <br /> 10000<br /> 0<br /> <br /> 0 <br /> <br /> 1 <br /> Ngày<br /> <br /> 2 2<br /> 0 Ngày<br /> <br /> 3 4<br /> Ngày<br /> <br /> 4 6 Ngày<br /> 5 8<br /> Ngày<br /> <br /> 6 10<br /> Ngày<br /> <br /> AH26<br /> 7 <br /> <br /> Biểu đồ 2. Đường cong tăng trưởng của nguyên bào xương khi tiếp xúc với dịch chiết<br /> BioRoot RCS và AH26 nồng độ 6,25%<br /> *: p < 0,05 (Kiểm định Mann Whitney-U).<br /> Kết quả cho thấy số lượng nguyên bào xương của nhóm Bioroot RCS cao hơn so với nhóm<br /> AH26.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Thử nghiệm tính gây độc tế bào in vitro là<br /> <br /> nghiệm dịch chiết là loại thử nghiệm phù hợp<br /> <br /> một bước thiết yếu của quá trình khảo sát tính<br /> <br /> cho việc xác định độc tính của những vật liệu<br /> <br /> tương hợp sinh học, trong đó sử dụng tế bào<br /> <br /> có độ hòa tan như xi măng trám bít ống tủy<br /> <br /> mô để quan sát sự tăng trưởng, sinh sản và<br /> <br /> [12].<br /> <br /> hình thái tế bào dưới sự tác động của vật liệu.<br /> <br /> Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy dịch<br /> <br /> Theo ISO 10993 - 5:2009, có 3 loại thử<br /> <br /> chiết của xi măng BioRoot RCS không gây<br /> <br /> nghiệm tính gây độc tế bào, trong đó thử<br /> <br /> độc tế bào cấp tính theo tiêu chuẩn ISO 10993<br /> <br /> TCNCYH 114 (5) - 2018<br /> <br /> 47<br /> <br />