Đột biến mới gen LDLR ở bệnh nhân tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

1
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là một bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường đặc trưng bởi nồng độ LDL-cholesterol (LDL-C) trong máu tăng cao bất thường. Bài viết trình bày xác định đột biến mới trên exon 3, 4, 9, 13, 14 gen LDLR.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đột biến mới gen LDLR ở bệnh nhân tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ 24 - HỘI HÓA SINH Y HỌC VIỆT NAM - 2020 ĐỘT BIẾN MỚI GEN LDLR Ở BỆNH NHÂN TĂNG CHOLESTEROL MÁU CÓ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH Hoàng Thị Yến*, Lê Thị Yến*, Vũ Đức Anh*, Vũ Chí Dũng*, Đặng Thị Ngọc Dung* TÓM TẮT 7 HYPERCHOLESTEROLEMIA Bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình PATIENT (Familial Hypercholesterolemia - FH) là một Familial hypercholesterolemia (FH) is an bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường đặc autosomal dominant disorder of lipoprotein trưng bởi nồng độ LDL-cholesterol (LDL-C) metabolism characterized by high levels of LDL- trong máu tăng cao bất thường. Đột biến gây cholesterol (LDL-C) in the blood. Over 80% of bệnh trên 80% do gen LDLR. Hiện nay bệnh FH the mutations are caused by the LDLR gene. còn chưa được quan tâm một cách thực sự, dẫn Nowaday, FH disease has not been paid much tới sự chậm trễ trong điều trị và có thể gây ra các attention, leading to a delay in treatment and can biến cố tim mạch hoặc tử vong. Mục tiêu: Xác cause cardiovascular complications or death. định đột biến mới trên exon 3, 4, 9, 13, 14 gen LDLR; Đối tượng và phương pháp nghiên Objectives: Identify new mutations in exon 3, 4, cứu: 26 bệnh nhi FH theo tiêu chuẩn Simon 9, 13, 14 of LDLR gene. Subjects and Methods: Broome được phân tích gen, xác định đột biến 26 FH children according to Simon Broome mới trên exon 3, 4, 9, 13, 14 gen LDLR. Kết criteria were genetically analyzed, identified new quả: Phát hiện được 2 đột biến mới, chưa từng mutations on exon 3, 4, 9, 13, 14 of LDLR gene. được công bố: đột biến c.1335C>T trên exon 9 Results: Detected 2 new mutations, never và đột biến c.1978C>T trên exon 13. Kết luận: announced: mutation c.1335C>T on exon 9 and Nghiên cứu phát hiện được 2 đột biến mới và dự mutation c.1978C>T on exon 13 LDLR gene. đoán có khả năng gây bệnh. Kết quả nghiên cứu Conclusion: The study discovered 2 new rất có ý nghĩa trong việc bổ sung thêm đột biến mutations and predicted the ability to cause mới vào bản đồ đột biến gen LDLR gây bệnh FH disease. The research results are very meaningful ở người Việt Nam. in adding new mutations to the LDLR gene Từ khoá: tăng cholesterol máu có tính chất mutation map that causes FH disease in gia đình, exon 9, exon 13, đột biến gen LDLR Vietnamese people. SUMMARY Keywords: familial hypercholesterolemia, exon 9, exon 13, LDLR gene mutation NEW MUTATION OF LDLR GENE IN FAMILIAL I. ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng cholesterol đóng vai trò quan trọng *Bệnh viện Tim Hà Nội trong việc hình thành, phát triển và nứt vỡ Chịu trách nhiệm chính: Hoàng Thị Yến của mảng xơ vữa, làm tăng các nguy cơ mắc Email: yenhoangbvtim@gmail.com bệnh tim mạch (coronary heart disease: Ngày nhận bài: 15.10.2020 CHD) nguyên phát và tử vong. Bệnh mạch Ngày phản biện khoa học: 20.10.2020 vành là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu Ngày duyệt bài: 28.10.2020 46
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 trong 10 năm trở lại đây [1]. Tăng (2) Triệu chứng kèm theo: cholesterol trong máu có thể do nhiều + Xanthoma gân xuất hiện ở bệnh nhân nguyên nhân và nguyên nhân vô cùng quan hoặc có ở thế hệ có mối quan hệ huyết thống trọng là do đột biến gen gây nên. bậc 1 với bệnh nhân (cha mẹ, anh chị em Bệnh tăng cholesterol có tính chất gia ruột) hoặc có ở thế hệ có mối quan hệ huyết đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là thống bậc 2 với bệnh nhân (ông bà, chú, dì). một bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường - Bố, mẹ hoặc người bảo trợ và bệnh nhi đặc trưng bởi nồng độ LDL-cholesterol FH đồng ý cho bệnh nhi tham gia nghiên (LDL-C) trong máu tăng cao bất thường. cứu. Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy hơn Tiêu chuẩn loại trừ: 1.000 đột biến của gen LDLR đã được xác Bệnh nhi mắc hội chứng thận hư, bệnh định ở bệnh nhân tăng cholesterol có tính nhân từ chối tham gia nghiên cứu. chất gia đình. Tỉ lệ mắc bệnh ước tính trên 2.2. Thiết kế nghiên cứu: toàn thế giới từ 1:500 đến 1: 300. Đây là - Các bệnh nhi được khám và chẩn đoán bệnh di truyền đơn gen, nguyên nhân chủ FH tại bệnh viện nhi Trung Ương, sẽ được yếu liên quan đến đột biến gen LDLR với tỉ lấy máu xét nghiệm các chỉ số lipid máu và lệ đột biến trên 80% [2]. Viện quốc gia về y thực hiện các kỹ thuật: tách chiết DNA, kiểm tế và lâm sàng của Anh (NICE) đã đưa ra tra độ tinh sạch DNA, thực hiện phản ứng khuyến cáo về sàng lọc phân tầng đối với PCR với các mồi tự thiết kế và giải trình tự những người thân có quan hệ huyết thống gen bằng phương pháp Sanger để xác định gần với bệnh nhân đã được chẩn đoán lâm đột biến điểm trên 5 exon: 3, 4, 9, 13, 14 gen sàng FH, giúp giảm tỉ lệ bệnh tật và tử vong LDLR. do bệnh tim mạch ở những người FH thông 2.3. Phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt qua chẩn đoán bệnh sớm và quản lý bệnh ngang hiệu quả [3]. ➢ Địa điểm và thời gian: từ 5/2017 – Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định 10/2018 tại Bệnh viện nhi Trung Ương đột biến gen LDLR trên nhóm bệnh nhi FH ➢ Xét nghiệm cholesterol, triglycerid, bằng phương pháp giải trình tự Sanger và đã HDL-C, LDL-C (mmol/L) trên hệ thống phát hiện được 2 đột biến mới. Cobas e601 sử dụng kit của hãng Roche diagnostics. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ➢ Kỹ thuật tách DNA: máu toàn phần 2.1.Đối tượng nghiên cứu: chống đông EDTA được tách DNA theo ➢ 26 bệnh nhân được chẩn đoán FH phương pháp tách cột; nồng độ và độ tinh theo tiêu chuẩn Simon Broome [3] và được sạch DNA được xác định trên máy phân tích xác định đột biến trên 5 exon gen Nanodrop, những mẫu DNA đạt OD260/ LDLR: 3, 4, 9, 13, 14. OD280 từ 1,8-2,0 sẽ được sử dụng phân tích. Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhi đáp ➢ Thiết kế mồi: Nghiên cứu sử dụng ứng tiêu chuẩn Simon Broome: mồi tự thiết kế, trình tự mồi cho các đoạn (1) TC máu > 6.7 mmol/L hoặc LDL-C exon trong nghiên cứu được thiết kế đặc hiệu >4.0 mmol/L ở trẻ em
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ 24 - HỘI HÓA SINH Y HỌC VIỆT NAM - 2020 Bảng 1. Trình tự mồi khuếch đại exon 3, 4, 9, 13, 14 của gen LDLR Kích thước Mồi Trình tự (bp) Mồi xuôi CTCAGTGGGTCTTTCCTTTG Exon 3 Mồi ngược CCTGACTGTGCGTGACAA 400 Mồi xuôi TGTTGGGAGACTTCACACGG Exon 4 529 Mồi ngược TCCACTTCGGCACCTAAATCA Mồi xuôi CTCTTTTTCTGGGTGCCTC Exon 9 448 Mồi ngược CTGGATGTCTCTGCTGATGA Exon 13, Mồi xuôi TAGTTGTGGAGAGAGGGTGGC 638 14 Mồi ngược AAAGTATGGTTATCCCGACTCA ➢ Kỹ thuật PCR: Thành phần phản ứng PCR (thể tích 25µl) gồm 12,5µl Taq2X; 0,5µl mồi xuôi; 0,5µl mồi ngược; 0,1µl DNA và 10,5µl H2O freeDNA. Bảng 2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại exon 3 Chu trình Biến tính Bắt cặp Tổng hợp 0 1 95 C - 5 phút 2 - 34 950C - 30 giây Tm = 550C (30 giây) 720C - 30 giây 35 30 giây 720C - 5 phút Tương tự tiến hành cùng chu kỳ nhiệt độ và số chu kỳ tương tự với exon 9, 13, 14 tại Tm = 55 C, exon 4 tại Tm = 570C. Tiến hành điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% với điện 0 thế 120v, trong 30 phút. ➢ Kỹ thuật giải trình tự gen: Sau khi khuếch đại, sản phẩm PCR được tinh sạch và được giải trình tự bằng phương pháp Sanger với hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencin Kit trên máy giải trình tự tự động Prism 3730xl – ABI (Mỹ). Trình tự gen được đọc bằng phần mềm Sequence Scanner và đối chiếu với trình tự của gen LDLR trên GeneBank bằng ApE, sử dụng phần mềm MutationTaster dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả điện di Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của exon 9 với mồi LDLR (448 bp) 48
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 Marker: 100 bp; (-): Chứng âm; (+): hiện sản phẩm khuếch đại của các exon có Chứng dương; MS1-MS14: Mẫu bệnh nhi từ kích thước tương ứng với mẫu chứng dương, MS1  MS14 điều này cho thấy khuếch đại đúng sản phẩm Nhận xét: Mẫu đối chứng âm (-) không có và không có hiện tượng biến đổi bất thường sản phẩm khuếch đại PCR, chứng tỏ sản trên các exon của các mẫu nghiên cứu. Các phẩm PCR không bị nhiễm sản phẩm ngoại sản phẩm PCR này đủ chất lượng để tiến lai. Các giếng của mẫu nghiên cứu đều xuất hành giải trình tự gen để xác định đột biến. 3.2. Kết quả xác định đột biến Đột biến dị hợp tử trên exon 9 (c.1335C>T) Bình thường c.1335C c.1335C>T Hình 2. Hình ảnh đột biến c.1335C>T trên exon 9 gen LDLR Hình 2 cho thấy kết quả giải trình tự mẫu MS19 thu được 2 đỉnh: màu đỏ và màu xanh da trời tương ứng với nucleotide Thymin và Cytosin của kiểu gen dị hợp tử TC tại vị trí nucleotide 1335 trên exon 9 gen LDLR. Đột biến c.1335C>T không gây ra sự thay đổi acid amin và là đột biến mới chưa từng được công bố trước đây. Đột biến này được tìm thấy trên bệnh nhi MS19 trong nhóm 26 đối tượng bệnh nhi FH. Đột biến exon 13 (c.1978C>T) Bình thường c.1978C c.1978C>T stop codon (CAG→UAG) Hình 3. Hình ảnh đột biến c.1978C>T Hình 3 cho thấy kết quả giải trình tự mẫu 660, từ bộ ba CAG thay bằng UAG (UAG là MS23 thu được 2 đỉnh: màu đỏ và màu xanh 1 trong 3 bộ ba kết thúc). Đây là đột biến da trời tương ứng với nucleotide Thymin và mới được phát hiện trong nghiên cứu có tên Cytosin của kiểu gen dị hợp tử TC tại vị trí là c.1978C>T stop codon, là dạng đột biến nucleotide 1978 trên exon 13 gen LDLR. vô nghĩa. Đột biến này được tìm thấy trên Trong đột biến này có sự thay thế từ bệnh nhân MS23 trong nhóm 26 bệnh nhi nucleotide Cytosin thành Thymin, từ đó gây FH. ra sự thay đổi bộ 3 mã hóa ở vị trí acid amin 49
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ 24 - HỘI HÓA SINH Y HỌC VIỆT NAM - 2020 IV. BÀN LUẬN CM950764 đã được công bố trong ngân hàng 4.1. Đột biến dị hợp tử trên exon 9 dữ liệu đột biến gen ở người (The Human (c.1335C>T) Gene Mutation Database - HGMD): Đột biến c.1335C>T: Đột biến trên exon 9 http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?ge gen LDLR, đây là đột biến mới được phát ne=LDLR&accession=CM950764) hiện trong nghiên cứu và có 1 bệnh nhi FH Mặc dù các thuật toán dự đoán về khả mang đột biến này. Đột biến có sự thay thế năng gây bệnh có độ nhạy và độ đặc hiệu nucleotide Cytosin thành Thymin tại vị trí cao, tuy nhiên vẫn cần các thí nghiệm in vivo c.1335 làm thay đổi bộ ba mã hóa GAC và in vitro để khẳng định đột biến trên có thành GAU. Tuy có sự thay đổi về phải gây bệnh hay không. nucleotide, nhưng 2 bộ ba mã hóa GAU và 4.2. Đột biến dị hợp tử trên exon 13 GAC đều mã hóa cho acid amin Aspartat. (c.1978C>T) Đa phần các đột biến không làm thay đổi Đột biến c.1978C>T: Đột biến trên exon acid amin đều là các dạng đột biến trung 13 gen LDLR ở dạng dị hợp tử, đây là đột tính, tuy nhiên khi sử dụng phần mềm dự biến mới được phát hiện trên 01 bệnh nhi FH đoán khả năng đột biến MutationTaster cho với biểu hiện u vàng và xét nghiệm lipid máu thấy c.1335C>T là một đột biến có khả năng tăng cao điển hình. gây bệnh và được cho là gây bệnh tại vị trí Hình 4. Vị trí đột biến c.1978C>T tạo mã stop codon và vùng mã hóa cho protein LDLr tương ứng. Ở người bình thường, tại vị trí nucleotide trong ba bộ 3 kết thúc (UAG, UAA, UGA), số 1978 trên exon 13 gen LDLR là ngay lập tức quá trình dịch mã bị dừng lại và nucleotide Cytosin, trong quá trình dịch mã kết thúc quá trình tổng hợp protein LDLr tại để tổng hợp protein LDLr sẽ tạo ra bộ 3 mã vị trí này. Việc dừng lại quá trình dịch mã hóa CAG tại vị trí a.a 660. Khi xuất hiện đột khiến cho các cấu trúc phía sau vị trí đột biến biến thay thế nucleotide Cytosin bằng của protein LDLr (bao gồm 1 phần của vùng Thymin tại vị trí nucleotide số 1978 thì quá giống EGF, vùng OLS, vùng xuyên màng trình dịch mã tại vị trí acid amin 660 sẽ bị TM và vùng trong bào tương) không được thay đổi thành bộ 3 mã hóa UAG là một hình thành, tạo nên một protein bất thường 50
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 và gây đột biến vô nghĩa. Những đột biến dòng tế bào Hep G2. Đột biến trên đã tạo ra dạng vô nghĩa thường được khẳng định là protein đột biến có khối lượng 120 kDa do đột biến gây bệnh [4]. Các nghiên cứu cho không được trải qua quá trình glycosyl hóa, thấy tình trạng phân rã mRNA qua trung do đó thụ thể được hình thành không thể vận gian đột biến vô nghĩa (Nonsense-mediated chuyển từ lưới nội sinh chất tới bộ máy mRNA decay - NMD) là một trong nhiều cơ Golgi (thiếu hụt một phần – đột biến loại chế kiểm soát bởi các tế bào để ngăn chặn 2B). Khi được nhuộm đánh giá bằng miễn tác dụng độc hại của các peptid bị cắt cụt dịch huỳnh quang cho thấy lượng LDLr trên hoặc bị biến đổi so với protein được sinh ra màng giảm đáng kể, quá trình vận chuyển bình thường [5]. Các đột biến vô nghĩa nằm LDL-C vào trong tế bào cũng giảm rõ rệt [9]. ở vị trí dài hơn 50 - 55 bp so với vị trí nối Đột biến vô nghĩa này được xếp vào nhóm 1 chức năng exon-exon (hướng về phía vùng (nhóm đột biến vô nghĩa, dịch khung, vị trí promoter và các exon, intron trước) thường nối, đột biến bất hoạt vùng promoter) nên gây ra tình trạng phân rã mRNA qua trung nồng độ LDL-C cao hơn và đòi hỏi điều trị gian đột biến vô nghĩa (NMD) [6]. Nghiên liều Atorvastatin cao hơn so với các nhóm cứu của Weiss (2000) và Dedoussis (2004) đột biến còn lại. Bệnh nhi MS23 phát hiện đã chứng minh nhóm bệnh nhân mang đột đột biến c.1978C>T vào viện với biểu hiện u biến vô nghĩa dạng dị hợp tử ở gen LDLR đã vàng ở vùng khuỷu, mông, đầu gối; các xét loại bỏ hoàn toàn chức năng của thụ thể và nghiệm ban đầu có nồng độ TC và LDL-C TC, LDL-C khi chưa điều trị cao hơn có ý tăng rất cao. nghĩa thống kê so với nhóm khiếm khuyết Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Øystein thụ thể trong nhóm bệnh nhân FH có u vàng Lunde Holla và cs (2009) trên các chủng tế [7]. Đột biến vô nghĩa c.1978C>T trong bào có chứa các đột biến vô nghĩa dị hợp tử nghiên cứu của chúng tôi nằm ở vị trí 133 bp lại cho thấy hiệu quả điều trị của các chất ức so với vị trí nối chức năng exon-exon, do đó chế các phức hợp ribosome RNA nhận biết đột biến có khả năng gây ra tình trạng phân các vùng stop codon sớm như Emetine, rã mRNA qua trung gian đột biến vô nghĩa Cycloheximide và Gentamicin [8]. Thực và gây thiếu hụt protein LDLr có chức năng nghiệm tiến hành với chủng tế bào có đột mặc dù là dạng đột biến dị hợp tử. Øystein biến vô nghĩa tạo mã stop codon sớm Lunde Holla và cộng sự (2009) đã thực c.296C>G cho thấy với liều lượng nghiệm với 4 loại đột biến vô nghĩa dị hợp Gentamicin (300 µg/mL) sau 20 giờ điều trị trên gen LDLR trên tế bào cho thấy lượng và Emetine (300 µg/mL) sau 2 giờ điều trị thụ thể LDLr và tình trạng hấp thu LDL-C thì LDLR mRNA và protein LDLr tăng lên vào trong tế bào giảm có ý nghĩa thống kê ngang bằng với tế bào bình thường. Do đó, với p
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ 24 - HỘI HÓA SINH Y HỌC VIỆT NAM - 2020 truyền ngày càng phát triển. Đối với bệnh Review for Familial hypercholesterolaemia: nhân MS23 nhóm nghiên cứu có thể tư vấn the identification and management of adults với bác sỹ điều trị lâm sàng cân nhắc sử and children with familial dụng thử nghiệm các nhóm thuốc trên khi hypercholesterolaemia., National thất bại với các thuốc điều trị khác và theo Collaborating Centre for Primary Care and Royal College of General Practitioners. dõi hiệu quả điều trị. 4. Keeling K.M, Xue X, Gunn G et al (2014). V. KẾT LUẬN Therapeutics based on stop codon readthrough. Annu Rev Genomics Hum Nghiên cứu đã xác định được 2 đột biến Genet, 15, 371-94. mới (c.1335C>T trên exon 9 và c.1978C >T 5. Byers P.H (2002). Killing the messenger: trên exon 13) gen LDLR. Hai đột biến dị hợp new insights into nonsense-mediated mRNA tử này chưa được công bố và có khả năng decay. J Clin Invest, 109(1), 3-6. gây bệnh. Kết quả nghiên cứu rất có ý nghĩa 6. Nagy E and Maquat L.E (1998). A rule for trong việc bổ sung thêm đột biến mới vào termination-codon position within intron- bản đồ đột biến gen LDLR gây bệnh FH. containing genes: when nonsense affects RNA abundance. Trends Biochem Sci, 23(6), TÀI LIỆU THAM KHẢO 198-9. 1. P. C. Santos, A. C. Morgan, C. E. Jannes et 7. Dedoussis G.V, Skoumas J, Pitsavos C et al al (2014). Presence and type of low density (2004). FH clinical phenotype in Greek lipoprotein receptor (LDLR) mutation patients with LDL-R defective vs. negative influences the lipid profile and response to mutations. Eur J Clin Invest, 34(6), 402-9. lipid-lowering therapy in Brazilian patients 8. Holla Ø.L, Kulseth M.A, Berge K.E et al with heterozygous familial (2009). Nonsense-mediated decay of human hypercholesterolemia. Atherosclerosis, LDL receptor mRNA. Scand J Clin Lab 233(1), 206-10. Invest, 69(3), 409-17. 2. R. Henderson, M. O'Kane, V. McGilligan 9. Shu H, Chi J, Li J et al (2017). A novel et al (2016). The genetics and screening of indel variant in LDLR responsible for familial familial hypercholesterolaemia. J Biomed Sci, hypercholesterolemia in a Chinese family. 23, 39. PloS one, 12(12), e0189316. 3. DeMott K., Nherera L., Shaw EJ. et al (2008). Clinical Guidelines and Evidence 52