Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 3

Chia sẻ: Song Song Cuoc | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:12

Thêm vào BST

Báo xấu

234
lượt xem 92
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chương 3 CHƯƠNG 3: TINH SẠCH DNA TỪ TẾ BÀO SỐNG Kỹ thuật di truyền tại nhiều thời điểm khác nhau, cần chuẩn bị ít nhất 3 loại DNA riêng biệt. Trước hết, total cell DNA sẽ được yêu cầu như một nguồn nguyên liệu từ các gen để tiến hành clone. Total cell DNA có thể là DNA từ nuôi cấy vi khuẩn, từ cây trồng, từ các tế bào động vật hoặc từ các nguồn sinh vật đang được nghiên cứu khác. Loại DNA thứ 2 được yêu cầu là DNA plasmid tinh khiết. Việc chuẩn bị DNA plasmid từ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 3

Chương 3 CHƯƠNG 3: TINH SẠCH DNA TỪ TẾ BÀO SỐNG Kỹ thuật di truyền tại nhiều thời điểm khác nhau, cần chuẩn bị ít nhất 3 loại DNA riêng biệt. Trước hết, total cell DNA sẽ được yêu cầu như một nguồn nguyên liệu từ các gen để tiến hành clone. Total cell DNA có thể là DNA từ nuôi cấy vi khuẩn, từ cây trồng, từ các tế bào động vật hoặc từ các nguồn sinh vật đang được nghiên cứu khác. Loại DNA thứ 2 được yêu cầu là DNA plasmid tinh khiết. Việc chuẩn bị DNA plasmid từ nuôi cấy vi khuẩn theo những b ước tương tự cơ bản như việc tinh khiết total cell DNA, nhưng điểm quan trọng là tại vài giai đoạn, DNA plasmid phải được phân chia từ một số lượng lớn DNA nhiếm sắc thể cùng tồn tại trong tế bào. Cuối cùng, DNA phage được sử dụng trong kỹ thuật cloning phage. DNA phage nhìn chung được chuẩn bị từ các hạt bacterriophage hơn từ việc ly trích từ tế bào nhiễm. Vì vậy, không gây nhiễm đối với DNA của vi khuẩn. Tuy nhiên, cần có những kỹ thuật đặc biệt để phá vỡ lớp vỏ phage. Một ngoại lệ là dạng sao mã mạch đôi của M13 từ các tế bào E.coli dường như giống với plasmid vi khuẩn. 3.1. Việc chuẩn bị total cell DNA. Nguyên tắc cơ bản của việc chuẩn bị DNA là ( ) Quy trình của sự chuẩn bị DNA total từ việc nuôi cấy tế bào vi khuẩn có thể được phân chia thành 4 giai đoạn (hình 3.1): 1. Nuôi cấy tế bào vi khuẩn tăng sinh khối và thu hoạch 2. Phá vỡ tế bào để giải phóng các thành phần tế bào 3. Phần trích của tế bào được xử lý để rút các thành phần, thu nhận DNA 4. Cô đặc dung dịch DNA thu được 3.1.1. Tăng sinh khối và thu hoạch trong nuôi cấy vi khuẩn: Hầu hết các vi sinh vật có thể tăng trưởng trong môi trường lỏng (môi trường canh) không quá khó khăn. Môi trường nuôi cấy phải cung cấp một hỗn hợp cân bằng chất dinh dưỡng thiết yếu trong dung dịch quy định cho phép vi khuẩn sinh trưởng và phân chia hiệu quả. Hai môi trường tăng trưởng điển hình được mô tả chi tiết ở bảng 3.1. M9 là một ví dụ của defined medium trong đó tất cả các thành phần đều được biết. Môi trường chứa hỗn hợp các chất dinh dưỡng vô cơ để cung cấp các yếu tố thiết yếu như nitrogen, Mg, Ca, hơn nữa là cung cấp glucose bổ sung cacbon và năng lượng. Thực tế, có các yếu tố tăng trưởng cộng thêm như trace elements và vitamin, phải được thêm vào môi trường M9 trước để hỗ trợ cho sự tăng trưởng của vi khuẩn. Chính xác, thành phần bổ sung phụ thuộc vào mỗi loại vi khuẩn. Môi trường thứ hai được mô tả ở bảng 3.1 có sự khác biệt hơn. LB là hỗn hợp phức tạp hay undefined medium, tính chất và số lượng của các thành phần không được xác định. Đó là do hai thành phần, tryptone và phần trích từ nấm men, là một phức hợp hóa học phức tạp. Tryptone cung cấp amino acid và các peptide nhỏ. Dịch trích từ nấm men (tế bào nấm men trong đường tiêu hóa) cung cấp nitrogen cùng với đường, các chất dinh dưỡng vô cơ và hữu cơ. Môi trường phức tạp như LB ( ). 1
Chương 3 Define medium phải được sử dụng khi việc nuôi cấy vi khuẩn được tiến hành dưới điều kiện kiểm soát tuyệt đối. Trong môi trường LB tại 370C, được cung cấp oxi bằng việc lắc với tốc độ 150-250 r.p.m trên trục quay, tế bào E.coli phân chia 20 phút một lần hoặc hơn cho đến khi dịch nuôi cấy đạt được một độ cực đại khoảng 2- 3 tb/ml. Sự tăng trưởng của dịch nuôi cấy có thể được kiểm tra thông qua việc đọc mật độ ánh sáng (OD) ở 600nm (hình 3.2), bước sóng của 1 đơn vị OD tương ứng với khoảng 0,8.109 tb/ml. Để chuẩn bị dịch chiết tế bào vi khuẩn phải được chứa trong một dung tích nhỏ tới mức có thể. Việc thu hoach vì vậy được thực hiện thông qua việc ly tâm dịch nuôi cấy (hình 3.3). Tốc độ giảm của máy ly tâm sẽ lắng tụ vi khuẩn xuống đáy ống ly tâm, cho phép trích dịch nuôi cấy. Vi khuẩn từ dich nuôi 1000ml ở mật độ tế bào cực đại chỉ cần thu lại trong một dung tích 10ml hoặc ít hơn bả vi khuẩn. Hình 3.2: Đánh giá số lượng tế bào vi khuẩn thông qua đo lường mật độ quang (a). Dịch nuôi cấy chứa trong bình thủy tinh và ánh sáng bước sóng 600nm chiếu qua. Lượng ánh sáng chiếu qua dịch nuôi cấy được đo và tính toán mật độ quang như sau: cường độ ánh sáng truyền đi 1 đơn vị OD = -log10 cường độ ánh sáng truyền tới Hệ thống này được thực hiện nhờ quang phổ kế. Lượng tế bào tương ứng với việc đọc OD được tính toán từ đường cong xác định giá trị. Đường cong này được vẽ từ giá trị OD dịch đó mật độ tb đã biết. Ví dụ: E.coli 1 đơn vị OD = 0,8.109 tb/ml a) Đo mật độ quang: b) Đánh giá số lượng tế bào từ đường cong xác định giá trị. 3.1.2. Chuẩn bị dịch trích tế bào: Tế bào vi khuẩn được bọc bên trong lớp màng cytoplasmic và bao xung quanh bởi thành tế bào cứng. Ở nhiều loài, như E.coli, thành tế bào là lớp màng bên ngoài thứ hai. Để giải phóng các thành phần tế bào phải phá hủy tất cả các lớp chắn bên ngoài. 2
Chương 3 Kỹ thuật phá vỡ tế bào vi khuẩn có thể chia thành 2 phương pháp cơ bản, cơ học và hóa học. Phá vớ tế bào được tiến hành bằng việc phơi sáng cho các tác nhân hóa học tác động lên toàn bộ các lớp bảo vệ. Phương pháp hóa học cũng thường xuyên được sử dụng với các tế bào vi khuẩn trong mục đích chuẩn bị DNA. Sự phân hủy hóa học nói chung là một tác nhân công kích (phá vỡ thành tế bào) và một tác nhân khác phá vỡ màng tế bào (hình 3.4a). Việc sử dụng các hóa chất phụ thuộc vào loại vi khuẩn, nhưng với E.coli và các vi khuẩn có quan hệ gần, việc làm suy yếu thành tế bào bằng lysozyme hay ethylene diamin tetra acetate (EDTA) hoặc là phức hợp của cả hai. Lysozyme là enzyme có trong lòng trắng trứng và trong chất tiết như nước mắt, nước bọt, tiêu hóa các hợp chất polymeric, chất giúp thành tế bào rắn chắc. Mặc khác, EDTA, tạo phức với ion Mg là yếu tố cần thiết bảo quản cấu trúc bên ngoài của màng tế bào, cũng như ngăn chặn enzyme cellular có thể phân hủy DNA. Trong nhiều trường hợp, chỉ với EDTA hay lysozyme là đủ để phân giải tế bào vi khuẩn, nhưng thông thường người ta còn thêm vào đó chất tẩy như sodium dodecyl sulphate (SDS). Chất tẩy tham gia vào quá trình thông qua việc rút các phân tử lipid và vì vậy gây ra sự phá hủy màng tế bào. Hình 3.3: Thu hoạch tế bào vi khuẩn bằng máy ly tâm. Máy ly tâm Lớp lắng tế Dịch vi khuẩn (Quay ở 8000 r.p.m trong bào vi khuẩn 10 phút) Hình 3.4: Chuẩn bị dịch trích tế bào. a) Phá hủy tế bào. Phá hủy thành tế bào Dịch trích tế bào Phân hủy màng tế bào b) Ly tâm dịch trích tế bòa để tách các cặn không hòa tan được. DNA, RNA, protein Ly tâm Dịch trích tế bào Mảnh vỡ tế bào 3
Chương 3 Khi đã có những tế bào bị phá hủy, bước cuối cùng của việc chuẩn bị dịch chiết tế bào là loại bỏ các mảnh không hòa tan. Các thành phần như các mảnh vỡ của thành tế bào được chiết lắng qua ly tâm, còn lại dịch chiết tế bào sạch. 3.1.3. Tinh khiết DNA từ dịch chiết tế bào: Ngoài DNA, dịch chiết tế bào vi khuẩn còn chứa một lượng đáng kể protein và RNA. Vài bước trong quy trình có thể được dùng để loại bỏ các chất tạp nhiễm, còn lại DNA ở dạng tinh khiết. Một cách tiêu chuẩn để loại protein từ dịch chiết tế bào là cho phenol hoặc hỗn hợp tỉ lệ 1:1 phenol và cloroform. Chất hữu cơ đó sẽ hòa tan tủa protein nhưng giữ lại nucleic acid (DNA và RNA) trong dịch nước, sau đó qua ly tâm phân tách, tủa protein phân tử sẽ nằm ở lớp giữ của dịch nước (DNA, RNA) và lớp hữu cơ phenol (hình 3.5). Dịch nước chứa acid nucleic sau đó được rút trích bằng pipette. Hình 3.5: Loại bỏ tạp nhiễm protein thông qua xử lý bằng phenol: DNA + RNA Ly tâm Dịch trích Trộn với Proteins tế bào phenol tách lớp Phenol Với nhiều dịch chiết tế bào, thành phần protein quá nhiều đến nỗi việc trích chiết bằng phenol không đủ để tinh sạch hoàn toàn acid nucleic. Vấn đề này được giải quyết bằng việc xử lý phenol nhiều lần nhưng có điều không mong muốn là sau mỗi lần trộn và các bước ly tâm sẽ gây đứt gãy các phân tử DNA. Phương pháp xử lý dịch chiết tế bào là dùng protease như Pronase hay Proteinase K trước khi xử lý phenol. Các enzyme này phá gãy các polypeptide thành nh ững đơn vị nhỏ hơn, để dễ dàng hơn trong phân tách phenol. Các phân tử RNA, đặc biệt là RNA thông tin (mRNA), được phân tách nhờ xử lý phenol nhưng hầu như vẫn còn chứa DNA trong lớp dịch nước. Cách hiệu quả duy nhất để tách RNA là dùng enzyme ribonuclease. Phân hủy nhanh chóng các phân tử đó thành các đơn vị nhỏ ribonucleotide. 3.1.4. Cô đặc mẫu DNA: Thông thường sự chuẩn bị thành công thường tạo ra được dung dịch đặc DNA mà không cần phải tiến hành cô đặc thêm. Tuy nhiên, khi thu được dịch loãng, điều quan trọng là tìm phương pháp để cô đặc DNA. Phương pháp cô đặc DNA được sử dụng phổ biến là ethanol precipitation. Trong môi trường muối (chính xác là các cation hóa trị I như Na+), tại nhiệt độ -20oC hoặc thấp hơn, ethanol nguyên chất kết tủa một cách hiệu quả các acid nucleic polymeric. Với dịch đặc DNA, ethanol được tách lớp ở phần trên của mẫu, các phân tử tủa ở mặt tiếp xúc. Một mẹo hay là sử dụng đũa thủy tinh nhúng xuyên qua dịch ethanol và dung dịch DNA, khuấy đũa trong dung dịch, các phân tử DNA sẽ bám chặt vào đũa và được kéo ra khỏi dung dịch ở dạng sợi dài (hình 3.6a). Hơn nữa, 4
Chương 3 nếu dịch ethanol trộn với dịch loãng DNA, kết tủa có thể thu được bằng máy ly tâm (hình 3.6b). Và sau đó hòa tan lại vào trong một dung tích nước thích hợp. Tủa ethanol có một tiến bộ là tách rời dung dịch và các thành phần acid nucleic monomeric. Hình 3.6: Thu hồi DNA nhờ tủa Ethanol. a) Ethanol nguyên chất được tách lớp lên phần trên của dịch cô đặc DNA. Các sợi DNA được tách ra từ đũa thủy tinh. b) Để dịch cô đặc ít nhất, ethanol đ ược thêm vào (với tỉ lệ 2,5 thể tích ethanol nguyên chất trong một thể tích dung dịch DNA) và thu DNA tủa bằng phương pháp ly tâm. 3.1.5. Đo độ cô đặc DNA: Việc biết chính xác bao nhiêu DNA hiện diện trong dung dịch khi tiến hành thử nghiệm chuyển gen là rất quan trọng. May mắn là các dịch cô đặc DNA có thể được đo một cách chính xác nhờ ultraviolet absorbance spectrophotometry. L ượng bức xạ tia tử ngoại hấp thu bởi dung dịch DNA tỉ lệ thuận với lượng DNA trong mẫu. Thông thường, lượng hấp thu được đo ở 260nm, tại bước sóng này ( ). Sự hấp thu tia tử ngoại cũng được sử dụng để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu DNA chuẩn bị. Với một mẫu DNA tinh sạch, tỉ lệ quang hấp thu ở 260nm và 280nm (A260/A280) là 1,8. Tỉ lệ thấp hơn 1,8 thì mẫu có thể bị nhiễm bẩn, hoặc protein hay phenol. 3.1.6. Chuẩn bị total cell DNA từ các sinh vật khác: Vi khuẩn không phải là sinh vật duy nhất để trích DNA yêu cầu. Total DNA từ thực vật và động vật sẽ được sử dụng nếu như mục tiêu của dự án kỹ thuật di truyền là clone gene từ các sinh vật khác. Mặc dầu các bước cơ bản trong tinh sạch DNA tương tự nhau trên các sinh vật, những biến đổi phải được lưu ý để phát hiện ra những đặc trưng đặc biệt của những tế bào đang được sử dụng. Sự tăng trưởng của các tế bào trong môi trường lỏng có lẽ là không hợp lý, mặc dù dịch tế bào động vật và thực vật đang trở nên rất quan trọng trong sinh học. 5
Chương 3 Tuy nhiên, những biến đổi chính hầu như được sử dụng tại giai đoạn phá hủy tế bào. Những hóa chất được sử dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khẩn thướng không phù hợp với các sinh vật khác:ví dụ như lysozyme, không tác động lên tế bào thực vật. Các enzyme phân hủy đặc biệt có thể được sử dụng cho hầu hết các loại thành tế bào nhưng thông thường là các kỹ thuật vật lý như nghiền lạnh vật liệu bằng cối và chày thì hiệu quả hơn. Mặc khác, hầu hết các tế bào động vật không co thành tế bào và có thể được phân giải một cách đơn giản thông qua việc xử lý bằng chất tẩy. Một khám phá quan trọng khác là thành phần sinh hóa trong các tế bào đang được sử dụng để ly trích DNA. Ở hầu hết vi khuẩn, thành phần sinh hóa chính hiện diện trong tế bào là protein, DNA và RNA, vì vậy phải tiến hành việc chiết tách bằng phenol hay xử lý protease, sau đó là loại RNA bằng ribonuclease, thu được mẫu DNA tinh sạch. Tuy nhiên, các phương pháp đó có thể không đủ để tinh tạo ra một mẫu DNA tinh sạch nếu như các tế bào chứa một lượng đáng kể các chất sinh hóa khác. Đặc biệt, vói các mô thực vật thì phương pháp này rất khó khăn vì chúng thường chứa một lượng lớn carbohydrate, không thể tách ra bằng xử lý phenol.Thay vào đó phải sử dụng một phương pháp khác. Sử dụng chất tẩy cetyltrimethylammonium bromide (CTAB),tạo thành một phức chất không hòa tan với acid nucleic. Khi CTAB được cho vào dịch chiết tế bào thực vật, phức hợp nucleic acid-CTAB kết tủa, tách rời carbohydrate, protein, và các chất gây nhiễm trong dịch nổi (hình 3.7). Kết tủa sau đó được thu nhận bằng phương pháp ly tâm và cho vào dung dịch muối NaCl 1M, hòa tan phức chất. Các acid nucleic được cô đặc nhờ phương pháp ethanol và RNA được tách nhờ xử lý ribonuclease. Hình 3.7: Phương pháp CTAB cho tinh sạch DNA thực vật 6
Chương 3 Phương pháp thứ hai được sử dụng,các phân tử acid nucleic mang điện tích âm, khác với hầu hết các tạp chất trong dịch chiết tế b ào. Điều này co nghĩa là acid nucleic sẽ bám vào bề mặt mang điện cực dương, ứng dụng cho các hạt trong nhựa ghi sắc trao đổi ion (hình 3.8a). Có thể cho trực tiếp nhựa vào trong dịch chiết tê bào tại thời điểm xử lý CTAB, nhưng việc xử dụng cột ghi săc thì tiện lợi hơn. Nhựa được chứa trong cột và cho dịch chiết tế bào vào (hình 3.8b). Các nucleic acid bám vào trong nhựa và giữ lạ trong cột, còn các tạp chất mang điện tích trung tính hay dương thì thoát ra bên ngoài. Sau khi loại bỏ các tạp chất, acid nucleic được thu lại bằng chác cho vào dung dịch có nồng độ muối cao, sẽ làm mất ổn định tương tác tĩnh điện giữa các phân tử acid nucleic và nhựa. 3.2. Chuẩn bị DNA plasmid: Việc tinh sạch các plasmid từ dịch vi khuẩn gồm các bước tương tự như việc chuẩn bị total cell DNA. Dịch tế bào có chứa plasmid tăng trưởng trong môi trường lỏng, thu hoạch và chuẩn bị dịch trích tế bào. Dịch trích được xử lý để loại RNA và tủa DNA bằng phương pháp tủa Ethanol.Tuy nhiên, có một điểm khacsnhau cơ bản giữa tinh sạch plasmid và chuẩn bị total cell DNA : Trong chuẩn bị plasmid, rất cần thiết để tách DNA plasmid từ một l ượng lớn DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn cùng tồn tại trong tế bào. Việc phân tách hai loại DNA rất khó khăn nhưng rất cần thiết đối với các plasmid được sử dụng trong kỹ thuật cloning. Sự hiện diện một lượng ít nhất DNA vi khuẩn tạp nhiễm trong kỹ thuật cloning cũng dễ dàng dẫn đến một kết quả không mong muốn. May mắn là có nhiều phương pháp để loại bỏ DNA vi khuẩn trong quá trình tinh sạch plasmid, và việc sử dụng từng phương pháp riêng lẽ hay kết hợp các phương pháp với nhau đều có thể phân lập được DNA plasmid rất tinh sạch. Các phương pháp đó dựa trên những đặc điểm khác nhau cơ bản giữa DNA plasmid và DNA vi khuẩn,chủ yếu là dựa vào kích cở. Plasmid lớn nhất chỉ bằng 8% kích cở của nhiễm sắc thể E.coli,và hầu hết là nhỏ hơn.Các kỹ thuật phân tách các phân tử DNA nhỏ từ cá phân tử lớn vì vậy mà tinh sạch các DNA plasmid một cách hiệu quả. Ngoài kích cở, DNA vi khuẩn và plasmid còn khác nhau về hình thể. Khi sử dụng một polymer như DNA, thường dựa vào hình thể không gian của phân tử, với hai hình thể đơn giản nhất là dạng sợi và dạng vòng. Các plasmid và nhiễm sắc thể vi khuẩn có dạng vòng, nhưng trong quá trình chuẩn bị dịch trích tế bào, chromosome bị bẻ gãy thành các mảnh dạng sợi. Ứng dụng phương pháp phân tách các plasmid dạng vòng từ các phân tử dạng sợi sẽ thu được các phân tử plasmid tinh sạch. 3.2.1. Sự phân chia dựa vào kích thước: Thông thường để phân đoạn theo kích th ước thì phải chuẩn bị chất chiết tế bào. Những tế bào này sẽ bị tan ra dưới điều kiện kiểm soát cẩn thận, sau đó 1 lượng nhỏ những đọan gãy của NST sẽ thoát ra ngo ài. Kết quả là những đoạn DNA này 7
Chương 3 vẫn còn rất lớn, lớn hơn nhiều so với plasmid, và có thể loại bỏ cùng với những mảnh vỡ tế bào bằng ly tâm. Tiến trình này được thực hiện bằng cách NST của vi khuẩn dính vào màng tế bào vi khuẩn, và những đoạn này hầu hết sẽ tạo trầm tích cùng với mảnh vỡ tế bào nếu như sự gắn này không bị phá vỡ. Sự phá vỡ tế bào phải được thực hiện một cách nhẹ nhàng để tránh 1 lượng lớn DNA của vi khuẩn sẽ bị gãy. Tiến trình được mô tả qua hình 3.9 đối với E.coli và những loài thân thuộc với nó. Thí nghiệm được thực hiện với EDTA và lysozyme với sự có mặt của đường sucrose. Những chất này ngăn không cho tế bào thoát ra ngoài. Những tế bào bị mất vách nhưng vẫn còn màng tế bào. Sự phân giải tế bào được kích ứng bằng cách thêm vào những chất tẩy không phải ion như Triton X-100 ( những chất tẩy ion như SDS, làm NST bị gãy). Với phương pháp này số lượng DNA bị gãy sẽ ít vì thế sự ly tâm sẽ tạo dịch tan trong suốt bao gồm toàn bộ plasmid. Dịch tan naỳ vẫn còn 1 ít DNA NST. Hơn nữa nếu plasmid là phân tử lớn, nó có thể hòa tan với mảnh vỡ tế bào. Sự phân chia theo kích thước sẽ bị thiếu DNA plasmid. Vì thế ta cần quan tâm đến những phương pháp khác nhau để loại bỏ sự nhiễm DNA vi khuẩn. Hình 3.9. Sự chuẩn bị dịch tan sạch. Tế bào VK chứa NST và plasmid được xử lý với lysozyme + EDTA + 25% fructose tạo tế bào thành dạng cầu, phá vỡ vách tế bào, nhưng màng tế bào vẫn còn nguyên.Triton X-100 phá vỡ tế bào thành từng mảnh. Đem ly tâm chất chiết tế bào này được dịch tan sạch chứa plasmid trong đó, những đoạn DNA lớn và mảnh vỡ tế bào lắng dưới đáy ống nghiệm. 3.2.2. Sự phân tách dựa trên cấu hình: Phương pháp này quan tâm tới có sự khác nhau giữa cấu hình của plasmid và DNA VK. Sự khác nhau này được dùng để phân tách 2 loại DNA này. Ta cần nhìn nhận chặt chẽ hơn về toàn bộ cấu hình plasmid. Thật không chính xác khi nói plasmid có cấu hình dạng vòng, bởi vì vòng DNA này có thể bị biến đổi bởi nhân tố nào đó tạo thành một dạng hoàn toàn khác. Hầu hết plasmid tồn tại trong tế bào dứơi dạng siêu xoắn (3.10 a). Dạng siêu xoắn này được biến đổi từ DNA sợi đôi, bền vững trong suốt quá trình sao chép của plasmid nhờ enzyme topoisomerase. Cấu hình xoắn này chỉ được duy trì nếu cả hai sợi polynucleotide vẫn còn nguyên vẹn, dạng này được gọi là covalently-closed- circular (ccc) DNA. Nếu 1 trong 2 sợi bị gãy, dạng siêu xoắn sẽ trở lại dạng bình thường, dạng linh hoạt, gọi là open-circular (3.10 b). Như vậy plasmid có cấu hình thay đổi. Dạng siêu xoắn quan trọng trong việc chuẩm bị plasmid bởi vì phân tử siêu xoắn có thể được phân tách dễ dàng từ DNA sợi đôi bình thường. Để làm điều này hai phương pháp được dùng phổ biến . Cả hai phương pháp có thể tinh sạch DNA plasmid từ chất chiết tế bào thô sơ. Thực tế kết quả tốt nhất đạt được nếu chuẩn bị một dịch tan sạch trước. Hình.3.10. Hai cấu hình của DNA plasmid. a ). Dạng siêu xoắn: hai sợi DNA còn nguyên. b ). Dạng vòng mở: 1 trong 2 sợi bị đứt. a.) Sự biến tính bằng kiềm: 8
Chương 3 Vấn đề cơ bản của kỹ thuật này là có một khoảng pH nhỏ mà ở đó DNA sợi đôi bình thường bị biến tính, trong khi plasmid siêu xoắn thì không. Nếu bổ sung dung dịch hydroxide vào chất chiết tế bào hay dịch tan sạch thì pH tăng đến 12- 12.5, pH cao này làm đứt nối hydrogen trong phân tử DNA bình thường, sau đó 2 sợi polynucleotic tách ra.( h 3.11), nếu thêm acid vào pH giảm còn 7. Những sợi DNA của VK đã biến tính quấn lại với nhau thành một đám rối. Hỗn hợp này đem ly tâm để tách DNA plasmid, DNA plasmid nổi lên trên, phân tử DNA thẳng lắng dứơi đáy ống nghiệm. Một thuận lợi của phương pháp này là ( đặc biệt là làm tan tế bào bằng SDS hay hòa tan = dd acetate) thì hầu hết protein hay RNA cũng không hòa tan và có thể loại bỏ bằng ly tâm. Sự xử lý với chất chiết phenol và ribonuclease có thể không cần đến nếu phương pháp biến tính bằng dung dịch kiềm được sử dụng. b) Phương pháp ly tâm trong gradient đ ộ đậm nhờ Ethidiumbromide-casein chloride: Đây là sự đảo ngược đặc biệt của kỹ thuật ly tâm cân bằng trong gradient độ đậm. Một mật độ gradient được tạo ra bằng ly tâm dd CsCl với tốc độ cao.( H. 3.12a). Gradient được tạo ra bởi vì với lực ly tâm lớn kéo các ion Cs và Cl về phía đáy ống nghiệm. Sự di chuyển xuống này được cân bằng bằng khuyếch tán. Vì thế mật độ gradient được thiết lập với mật độ CsCl cao ở phía đáy ống nghiệm. Những đại phân tử hiện diện trong dd CsCl khi ly tâm sẽ tạo một dãy tách biệt theo gradient ( H.3.12 b). Chính xác, dãy phân tử riêng biệt hiện diện ở đâu tùy thuộc vào mật độ nổi của nó. DNA có mật độ nổi khoảng 1.7g/cm3 và vì thế sẽ di chuyển đến điểm nổi có mật độ CsCl là 1.7g/cm3. Trái lại protein có độ nổi thấp hơn và vì thế nổi lên trên đỉnh ống nghiệm. RNA thì lắng dưới đáy. (H3.12b). Ly tâm trong gradient độ đậm có thể phân tách DNA, RNA, protein và thay thế việc xử lý với phenol và ribonuclease để tinh sạch DNA. Quan trọng hơn là phương pháp này với sự hiện diện của EtBr có thể đ ược dùng để tách DNA siêu xoắn khỏi DNA bình thường. EtBr kết hợp với DNA bằng cách xen vào giữa sát cặp base làm cho một phần sợi DNA tháo xoắn và dài ra ( mỗi cặp > 3.4Ao). Sự tháo xoắn này làm giảm mật độ nổi 0.125g/cm3 đối với DNA thẳng. Tuy nhiên DNA siêu xoắn không có đầu tận cùng tự do, có rất ít đoạn duỗi ra và chỉ kết hợp vói một lượng giới hạn ETBr. Mật độ nổi của phân tử siêu xoắn giảm ít hơn nhiều 0.085g/cm3. Kết quả là phân tử siêu xoắn tạo thành dãy trong gradient ETBr-CsCl ở vị trí khác với DNA vòng và thẳng. Ly tâm trong gradient độ đậm EtBr-CsCl là phương pháp hiệu quả cho việc thu DNA plasmid sạch. Khi một dịch tan sạch được tạo ra từ phương pháp này , dãy plasmid ở vị trí phân biệt với DNA thẳng của VK, phần protein thì nổi lên trên đỉnh, RNA lắng dưới đáy. Vị trí của DNA plasmid có thể được nhìn thấy bằng chiếu bức xạ tia cực tím lên thành ống nghiệm. Tia này làm cho EtBr đã kết dính phát huỳnh quang. DNA plasmid đựơc lấy ra bằng cách dùng ống tiêm đâm vào vị trí mẫu trên ống nghiệm.(H.3.14 b). EtBr đã kết hợp với DNA plasmid được lấy ra bằng n- butanol. Lắc hỗn hợp DNA plasmid với n-butanol sẽ phân hai lớp EtBr và DNA. 9
Chương 3 (H3.14 c). Sau đó tách CsCl bằng sự thẩm tích. DNA plasmid đựợc đựng trong ống thẩm tích và đặt ống này trong dd buffer. CsCl sẽ thẩm tích vào buffer. 3.2.3. Sự khuyếch đại plasmid: Sự chuẩn bị DNA plasmid có trở ngại là tỷ lệ DNA plasmid thì ít hơn so với tổng DNA của VK trong tế bào. Năng suất DNA từ việc nuôi cấy tế bào VK cũng không cao. Sự khuyếch đại plasmid thì có ý nghĩa trong vấn đề này. Sự khuyếch đại này nhắm vào việc tăng số lượng bản sao plasmid. Một vài plasmid có áô lượng bản sao lớn (20 hoặc hơn), đây là đặc tính có lợi cho sự khuýêch đại, trong điều kiện để khuyếch đại plasmid NST VK không thể sao chép và sự tổng hợp protein bị ức chế.Đặc tính này có lợi trong suốt quá trình plasmid sinh trưởng trong nuôi cấy tế bào chuẩn bị cho sự tinh sạch DNA plasmid. Sau khi thỏa mãn mật độ tế bào đạt được, chất ức chế tổng hợp protein đ ược thêm vào( chloramphenicol) và ủ trong 12 giờ. Trong suốt thời gian này plasmid tiếp tục được sao chép trong khi sự sao chép của NST VK và sự phân chia tế bào bị ức chế (h3.15). Kết quả là khoảng vài ngàn bản sao plasmid được tạo thành . Sự khuyếch đại này là phương pháp có hiệu quả để nâng cao số lượng bản sao plasmid. 3.3. Sự chuẩn bị DNA phage: Sự khác nhau cơ bản giữa sự làm sạch DNA phage và sự chuẩn bị tổng DNA tế bào và DNA plasmid là nguyên liệu ban đầu để tinh sạch phage không phải là chất chiết tế bào. Ta có thể thu được một lượng lớn hạt thực khuẩn thể trong dịch ngoại bào từ việc nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp nhiễm.Khi ly tâm tế bào nuôi cấy này, VK lắng xuống đáy ta thu được hạt phage trong dịch huyền phù (h3.16). Tách các hạt phage khỏi dịch huyền phù, DNA của chúng được tách bằng cách khử protein để loại bỏ vỏ capsid. Phương pháp này thì nhanh hơn phương pháp chuẩn bị tổng tế bào và DNA plasmid. Thành công của phương pháp này là thu được một lượng DNA có ý nghĩa và là đối tượng cho nhiều bẫy. Khó khăn chính, đặc biệt đối với phage lamda là trong nuôi cấy phải đạt mật độ phage lamda đủ cao ( số hạt phage /1 ml môi trường nuôi cấy.). Thực tế mật độ phage lamda hợp lý tối đa là 10 10/ml. Tuy nhiên với mật độ này lượng DNA phage thu được cũng rất thấp chỉ 500ng DNA. Vì vậy thể tích nuôi cấy phải đạt 500 -1000ml để thu được luợng DNA phage mong muốn. 3.3.1 Phát triển việc nuôi cấy để đạt độ lamda cao: Phát triển việc nuôi cấy với dung tích lớn không là vấn đề ( có thể nuôi cấy 50 lit hay lớn hơn trong công nghệ sinh học). Nhưng để đạt mật độ phage tối đa thì cần vài kỹ năng. Đối với phương pháp này , tế bào vi khuẩn đóng vai trò chính, phage lamda xâm nhiễm vào DNA vi khuẩn tao dạng prophage (h.3.17). Trong trường hợp này mật độ phage vô cùng thấp, muốn đạt mật độ phage lamda cao ta cần phải kích ứng để VK đi vào giai đoạn sinh tan, kết quả tế bào vi khuẩn chết và phóng thích các hạt phage vào môi trường. Sự kích ứng này khó kiểm soát, nhưng ta có thể kiểm soát chúng thông qua gen cI (gen này nằm trên vùng đột biến nhạy cảm với nhiệt của phage).Gen này làm nhiệm vụ giúp phage liên kết với DNA tế bào chủ. Nếu bị bất hoạt bởi nhân tố đột biến nào đó, gen cI sẽ không có tác dụng lâu dài và gây trở ngại cho quá trình phân giải. Gen cI hoạt động tốt ở 30 oC . 10
Chương 3 Bình thường sự tiềm tan có thể xảy ra, nhưng ở 42oC gen cI bị bất hoạt và sự tiềm tan không xảy ra. H3.17 . Sự cảm ứng tiềm tan của gen cIts bằng cách tăng nhiệt độ từ 30oC-42oC. Gen cIts xâm nhiễm vào DNA của Ecoli để sản xuất phage ngoại bào. Ở 30oC, không cảm ứng tế bào nhân đôi. Ở 42oC, nhiệt độ cảm ứng tạo genome phage lamda mong muốn, phage này qua quá trình phân chia, tổng hợp, đóng gói và phóng thích ra ngoài. 3.3.2. Sự chuẩn bị phage lamda có khả năng tiểm tan: Mặc dù hầu hết phage lamda có tính tiềm tan, nhiều vector tạo d òng được tạo ra từ phage lamda bằng cách loại bỏ gen cI và một vài gen khác vì thế sự tiềm tan không xảy ra. Những vector này không thể xâm nhiễm vào genome vi khuẩn, chúng chỉ xâm nhiễm vào tế bào bằng chu trình sinh tan. Để đạt mật độ phage cao ta bổ sung phage vào giai đọan tế bào phát triển thích hợp. + Nếu bổ sung phage vào khi số tế bào còn thấp phage sẽ giết chết tế bào, mật độ phage sẽ ít. (h3.18a) + Nếu bổ sung phage khi mật độ tế bào quá cao, sự nuôi cấy sẽ không hoàn tất vẫn còn lượng tế bào dư, mật độ phage sẽ ít. (h3.18b) +Thích hợp nhất là khi nuôi vi khuẩn ở mức nào đó thì cho phage vào ở mức đó , tạo sự cân bằng, việc nuôi cấy sẽ phát triển tốt, mật độ phage cao. ( h3.18c) Để xử lý vấn đề này tốt thì cần kỹ năng và kinh nghiệm. 3.3.3. Thu nhận phage từ việc nuôi cấy nhiễm: Những tế bào VK tan và tế bào còn nguyên còn sót lại có thể loại bỏ khỏi dịch huyền phù bằng ly tâm. (H3.16). Vấn đề là ta phải giảm thể tích dịch huyền phù còn 5ml hay ít hơn, để dể kiểm soát lượng DNA, ta làm như sau: (H3.19) Khử protein phage bằng PEG ( là hợp chất polyme chuỗi dài)+NaCl+ H2O hấp thu. Các chất này làm các hạt phage dính lại với nhau. Sau đó ly tâm với tốc độ cao các hạt phage cùng với mảnh vỡ tế bào vẫn còn sót lai sau ly tâm sẽ lắng xuống đáy. Loại bỏ phần dịch lơ lửng ta được lượng phage với thể tích mong muốn. 3.3.4 Sự tinh sạch DNA phage từ các hạt phage thu được ở trên: Sự khử protein nhờ PEG đôi khi chứa đủ lượng DNA phage, nhưng DNA phage thường xen lẫn với phần chất thu đ ược nên lượng phage thu được ở trên có thể chứa các mãnh vỡ VK, có thể là DNA tế bào không mong muốn .Ta có thể tinh sạch các hạt phage bằng CsCl với phương pháp ly tâm độ đậm gradient. Các hạt phage trong gradient CsCl có mật độ 1.45-1.50g/cm3.(h3.20). Việc lấy phage giống như lấy DNA đã mô tả trước đây.(p43 H3.14). Loại bỏ CsCl bằng sự thẩm tích để được phage sạch. DNA có thể được chiết bằng xử lý phenol và protease để làm tan vỏ protein của phage. 3.3.5. Sự tinh sạch DNA M13 gây ra một vài vấn đề: 11
Chương 3 Sự khác nhau giữa M13 và lamda là một thuận lợi để nhà sinh học phân tử chuẩn bị DNA M13. Sợi đôi M13 giống nh ư một số plasmid có số lượng bản sao lớn thì dễ dàng tinh sạch bằng phương pháp tinh sạch plasmid. Chuẩn bị chất chiết tế bào từ tế bào đã nhiễm M13, các bản sao của M13 đ ược tách khỏi DNA VK bằng ly tâm độ đậm gradient EtBr-CsCl. DNA sợi đơn của M13 được chứa trong vỏ protein của M13. Thuận lợi hơn so với lamda là M13 dễ đạt được mật độ cao, sự tiềm tan không xảy ra (h2.8). Để đạt được mật độ M13 cao ta cần tăng số lượng tế bào bị nhiễm lên. Mật đô M13 có thể đạt 1012/ml và cao hơn nữa một cách dễ dàng nếu không dùng chất ức chế đặc biệt. Mật độ M13 cao có ý nghĩa trong việc chuẩn bị DNA sợi đ ơn của M13 từ việc nuôi cấy chỉ một thể tích nhỏ 5 ml hay ít hơn. Trong trường hợp này không có sự tiềm tan, không có vấn đề với mảnh vỡ tế bào còn sót lại trong dịch huyền phù. Thường thì ly tâm graduent độ đậm CsCl thì cần thiết đối với phage lamda nhưng không cần thiết đối với M13. Tóm lại, chuẩn bị sợi đơn DNA M13 liên quan đến việc nuôi cấy nhiễm với thể tích nhỏ, ly tâm để loại bỏ tế bào VK, tủa phage M13 với PEG, dùng phenol để loại bỏ vỏ protein, tủa bằng ethanol để thu DNA. Hình 3.21Sự chuẩn bị DNA M13 của VK. a. Nuôi cấy tế bào bị nhiễm. b. Ly tâm loại bỏ tế bào. Tế bào lắng dưới đáy, M13 còn lại trong dịch huyền phù. c. Thêm PEG vào dịch huyền phù, ly tâm để tủa M13. d. Phage M13 lơ lửng trong buffer e. Thêm phenol loại bỏ vỏ protein thu được dịch DNA M13 f. Thêm ethanol để tủa DNA M13, DNA lắng dưới đáy. g. Thu được DNA M13 trong thể tích nhỏ. 12