Giáo trình-Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản-chương 2

Chia sẻ: Vu Dinh Hiep | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:15

Thêm vào BST

Báo xấu

390
lượt xem 106
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT II.1. QUAN SÁT DẤU HIỆU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH HỌC II.1.1.Phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh II.1.1.1.Những vấn đề cần lưu ý khi quan sát bệnh lý thủy sản Thông tin về dấu hiệu bệnh, mô học và tế bào học của mẫu bệnh phẩm thực hiện khi giải phẫu là phần rất quan trọng cho các chẩn đoán có liên quan nhằm cung cấp thông tin cho một chẩn đoán đầy đủ. Trong đa số các trường hợp, kết quả chẩn đoán đòi hỏi phải có những bằng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình-Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản-chương 2

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT II.1. QUAN SÁT DẤU HIỆU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH HỌC II.1.1.Phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh II.1.1.1.Những vấn đề cần lưu ý khi quan sát bệnh lý thủy sản Thông tin về dấu hiệu bệnh, mô học và tế bào học của mẫu bệnh phẩm thực hiện khi giải phẫu là phần rất quan trọng cho các chẩn đoán có liên quan nhằm cung cấp thông tin cho một chẩn đoán đầy đủ. Trong đa số các trường hợp, kết quả chẩn đoán đòi hỏi phải có những bằng chứng cho thấy sự liên quan giữa mầm bệnh và những tổn thương của cơ thể do mầm bệnh đó gây nên. Ngoài vai trò xác định tương quan giữa mầm bệnh và vật chủ, những thông tin từ kết quả quan sát còn giúp xác định/phân biệt những yếu tố tham gia gây bệnh khác. Những biến đổi về hình thái của mô và tế bào phải được xác định và phân ra thành các nhóm ví dụ như những biểu hiện của vật chủ với sự tấn công của mầm bệnh nhằm có những biện pháp chẩn đoán khác nhau để có kết quả xác định do cơ thể có rất nhiều loại mô và chúng có những biểu hiện khác nhau về mặt bệnh lý. Để có thể lựa chọn phương pháp chẩn đoán hợp lý, người làm công tác chẩn đoán phải thu thập, ghi nhận hoặc phải đuợc cung cấp những thông tin sau: 1. Vị trí xuất hiện của những dấu hiệu bệnh lý trên cơ thể, các nội quan và mô cũng như những những thay đổi trong thời gian gần nhất được phán đoán thông qua: (i) quá trình diễn biến bệnh (Đã chết hay đang bị bệnh nặng; Tình trạng bệnh: số còn sống, số khỏe, số bệnh và số đã chết) ; (ii) báo cáo chi tiết về quan sát lâm sàng; (iii) mẫu mô bệnh và (iv) kết quả xét nghiệm mô bệnh học trên nhiều tiêu bản mô. 2. Kết quả chẩn đoán lâm sàng trước và sau khi tử vong 3. Những thông tin liên quan đến khả năng bị nhiễm độc tố 4. Chấn thương hoặc những thông tin liên quan đến tình trạng kiệt sức 5. Các điều kiện về dinh dưỡng, sinh sản, mật độ và môi trường nuôi. 6. Thông tin về biện pháp phòng bệnh được áp dụng như loại thuốc hay vắc xin được sử dụng, thời gian và phương thức sử dụng. 7. Thông tin về kết quả các chẩn đoán trước đây (nếu có). Những xáo trộn về mặt sinh lý hay trao đổi chất của cơ thể thường không thấy được qua phân tích mô bệnh học mà chỉ có thể bằng các quan sát những tổn thương hay những thay đổi về mặt hình thể do những xáo trộn có liên quan gây ra. Mẫu được thu để phục vụ cho việc chẩn đoán để định dạng mầm bệnh, xác định tác nhân gây bệnh hay cung cấp thông tin cho việc xác định nguyên nhân gây bệnh tùy 19
thuộc vào việc chọn lựa phương pháp chẩn đoán như đã nêu ở trên. Chi tiết các bước thu mẫu được trình bày ở phụ lục 1. II.1.1.2. Quan sát bệnh lý ở tôm Việc phát hiện ra bệnh ở tôm rất khó khăn, trừ khi có hiện tượng tôm chết hàng loạt. Dấu hiệu bệnh thường xuất hiện ở một số ít cá thể trong ao nuôi do vậy cần phải quan sát tôm nuôi thường xuyên nhằm xác định được bệnh ở giai đoạn sớm nhất. Trong hầu hết các trường hợp, biểu hiện bên ngoài thường giống nhau mặc dù tác nhân gây bệnh khác nhau. Nếu phiêu sinh vật phát triển, chất lượng nước và tôm đều ở trong điều kiện tốt thì kể từ tuần lễ nuôi thứ ba sẽ không thể nhìn thấy tôm nữa. Khi tôm bị những tác động do môi trường xấu hoặc bị bệnh chúng thường nổi lên mặt nước hoặc tập trung ven bờ. Khi thấy tôm xuất hiện ở ven bờ hay trên mặt ao thì đó là dấu hiệu nghiêm trọng. Vì thế cần phát hiện sớm những dấu hiệu khác thường qua sàn ăn hoặc chài. Tôm thường thích lên mặt ao hay ven bờ vì nước ở đó có hàm lượng oxy cao. Trong nhiều trường hợp cũng có thể là để tránh hàm lượng chất độc cao ở đáy ao. Kiểm tra các ao nuôi vào ban đêm và lúc sáng sớm là rất quan trọng vì tôm bệnh sẽ nổi lên mặt nước hoặc ven bờ rất nhiều vào những lúc này. Khi thấy tôm tập trung ven bờ thì nên kiểm tra đáy ao để biết số tôm chết, nhất là ở khu vực đặt máy sục khí, ở giữa ao nơi tích cặn bã và quanh cống thoát. Trong hầu hết các trường hợp, không thể xác định bệnh trong ao nuôi qua một lần thu mẫu cho dù có phân tích nhiều chỉ tiêu đi nữa thì ý nghĩa của nó rất nhỏ. Điều cần thiết ở đây là cần theo dõi đàn tôm trong suốt quá trình nuôi. Phát hiện được bệnh ở giai đoạn sớm thường dựa vào những dấu hiệu xuất hiện trên tôm, chất lượng nước và những ghi nhận trong sản xuất bao gồm thức ăn tôm sử dụng và quá trình sinh trưởng. Điều này chỉ có thể thực hiện được ở những trại có các số liệu theo dõi đầy đủ về xu hướng phát triển, tỉ lệ sống, tình trạng sức khỏe, sinh khối và tỉ lệ chuyển hóa thức ăn ở mỗi thời điểm thu mẫu. Mật độ thả nuôi ảnh hưởng rất lớn đến quá trình phát triển của tôm trong ao. Mật độ thả quá dày chắc chắn sẽ gặp trở ngại, vì tôm sẽ cạnh tranh nhau về thức ăn và môi trường sống. Mật độ thả phù hợp cho từng ao tùy thuộc vào nhiều yếu tố như: điều kiện về thổ nhưỡng, chất lượng nước, khí hậu ở vùng nuôi; kiểu thiết kế và cấu trúc ao nuôi; trang thiết bị; cỡ tôm thu hoạch dự kiến và kinh nghiệm của người quản lý. Thiết kế ao tốt có thể bù đắp cho một số trở ngại về môi trường và cỡ tôm thu hoạch có thể bị giới hạn bởi môi trường xấu. Khi chất lượng nước tại chỗ xấu hoặc quá thay đổi thì thả tôm với mật độ cao thường không có hiệu quả. Những thay đổi về thời tiết và chất lượng nước theo mùa có ảnh hưởng đến tôm nuôi. Thời gian chuẩn bị ao và thả giống phù hợp cho việc nuôi tôm cũng phải được xem xét. Các thông tin về môi trường và quản lý ao nuôi cần lưu ý bao gồm: chất lượng nước đặc biệt là hàm lượng oxy hòa tan, pH và nhiệt độ; những biến động về thời tiết như mưa lớn; tình trạng đáy ao; sự phát triển của tảo và hình thức quản lý nước. Sự xấu đi của nền đáy ao có thể dẫn đến chất lượng nước kém và gây bệnh cho tôm, tuy nhiên nó cũng gây ra các ảnh hưởng trực tiếp. Chế độ sục khí trong ao ảnh hưởng đến sự tích tụ chất thải ở đáy ao. Nếu như phần diện tích sạch ở đáy ao giảm sẽ làm tăng số lượng tôm đến sàn ăn và tôm ăn hết thức ăn nhanh hơn. Cũng có thể có trường hợp ngược lại, nếu các sàn ăn đặt ở nơi dơ bẩn trong ao thì số tôm đến sàn ăn cũng sẽ giảm. Thường 20
có nhiều dấu hiệu khác xuất hiện trên tôm cũng cho biết chất lượng nước xấu như màu sắc bất thường ở mang, vỏ bẩn, phồng đuôi, ăn lẫn nhau và phụ bộ bị thương. Nếu có nghi ngờ về sự xấu đi của nền đáy ao thì nên lội khắp ao để xem lượng chất thải tích tụ và sự phân bổ của chúng ra sao. Mặc dù tảo phát triển tốt thường có lợi cho ao nuôi, nhưng trong ao nuôi thay nước ít có thể gặp rắc rối do tảo phát triển quá mức vì các chất dinh dưỡng tích lũy trong ao. Phương thức quản lý và xử lý nước cần phải được lưu tâm đặc biệt. Mục đích của giai đoạn lấy nước, xử lý nước và bón phân là để thúc đẩy phiêu sinh vật phát triển tốt và ngăn ngừa các sinh vật khác vào ao nuôi, trong đó có các sinh vật gây bệnh và sinh vật mang mầm bệnh. Các sinh vật này bao gồm các loài cá, giáp xác và các động vật không xương sống khác. Các sinh vật này có thể cạnh tranh hoặc giết hại tôm và chúng có thể mang mầm bệnh vào ao nuôi như các mầm bệnh vi-rut rất nguy hiểm. Những dấu hiệu bệnh lý bên ngoài cơ thể tôm nuôi thường không cung cấp những thông tin nhất định nào về tác nhân gây bệnh. Phức tạp hơn là dấu hiệu bệnh lý do nhiều tác nhân cùng gây ra cộng với những biến đổi bất lợi về các yếu tố môi trường. Việc chẩn đoán bệnh nếu chỉ đơn thuần dựa vào dấu hiệu bên ngoài sẽ không chính xác mà cần phải được thực hiện cùng với phương pháp phân tích mô bệnh học hay các phương pháp chẩn đoán khác. Dấu hiệu bệnh được tiến hành qua các bước như sau: 1. Quan sát hoạt động của tôm 2. Quan sát màu sắc cơ thể như: - Hiện tượng đỏ thân hay đỏ phụ bộ - Sự xuất hiện những đốm trắng trên vỏ - Hiện tượng vỏ tôm có màu xanh - Hiện tượng đầu vàng - Thịt tôm có màu trắng đục 3. Quan sát màu sắc mang như: - Hiện tượng mang tôm có màu hơi nâu hay đen - Hiện tượng mang tôm có màu xanh 4. Phụ bộ 5. Lớp biểu bì 6 . Cơ 7. Túi tinh 8. Tăng trưởng chậm hay tôm bị còi 21
9. Dị dạng 10. Mềm vỏ 11. Màu sắc và độ đầy của ruột 12. Màu sắc của phân Thông tin chi tiết về phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh trên cơ thể tôm được trình bày trong phần bệnh tôm, giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005). Các dấu hiệu bệnh thường gặp ở tôm được trình bày ở phụ lục 2. II.1.1.3.Phương pháp quan sát bệnh lý ở cá II.1.1.3.1. Quan sát hoạt động của cá Hoạt động của cá phải được quan sát thường xuyên mới có thể phát hiện sớm những biểu hiện bất thường. Bầt kỳ một dấu hiệu hoạt động bất thường của cá cũng cần phải được ghi nhận và tìm hiểu nguyên nhân. Trước khi có dấu hiệu bệnh lý rõ ràng, cá thường ăn nhiều hơn bình thường và sau đó ngừng ăn, hoặc có một số cá tách đàn khi bắt mồi. Sự ghi nhận thường xuyên những thông tin về hệ số chuyển hóa thức ăn, tỉ số chiều dài/trọng lượng cơ thể hoặc những dấu hiệu về hình dạng cơ thể sẽ giúp dự đoán/phát hiện bệnh sắp xảy ra. Những biểu hiện bất thường của cá như bơi gần mặt nước, chìm xuống đáy ao, mất thăng bằng hoặc thiếu oxy hay có bất kỳ những dấu hiệu hoạt động bất thường nào. Sự xuất hiện đột ngột của những hoạt động bất thường của cá thường liên quan đến tình trạng hôn mê của cơ thể cá. Những thay đổi về hoạt động của cá thường xảy ra khi cá bị sốc. Thiếu oxy làm cá bị ngạt thở, lờ đờ, phình bụng hay bơi lắc lư mất hăng bằng và thậm chí làm ảnh hưởng xấu đến mang và máu. Những hoạt động lạ thường còn có thể do những rối loạn về thần kinh liên quan đến bệnh (bệnh do vi-rút gây viêm não và võng mạc). Phải theo dõi xem cá chết dưới hình thức nào và mức độ ra sao. Nếu cá cứ tiếp tục chết dai dẳng thì phải thu mẫu gởi đến phòng thí nghiệm để thực hiện các chẩn đoán ở mức 2 và 3. Nếu cá chết đồng loạt hoặc chết theo vùng ngẫu nhiên thì phải xem xét ngay lập tức và các chỉ tiêu về môi trường trước và sau khi cá chết cần phải được ghi nhận và xem xét. Cá chết lan từ vùng này sang vùng khác có thể là do tác nhân gây bệnh truyền nhiễm và phải thu mẫu định dạng mầm bệnh ngay lập tức. Việc làm tức thời (nếu có thể) là cách ly cá bị bệnh và cá khỏe trong thời gian xác địng nguyên nhân gây tử vong. Tăng trưởng hàng ngày của cá cần phải được ghi nhận càng đầy đủ càng tốt. Tốt nhất là thu mẫu định kỳ hoặc ước lượng khi cho cá ăn mỗi ngày. Bên cạnh thông tin về tăng trưởng của cá thông tin về hoạt động bắt mồi và cá chết (nếu có) cũng cần được ghi nhận đầy đủ. Thời gian thay bể hay thay nước, vệ sinh dụng cụ/ống dẫn nước hay khử trùng trại cũng càn được ghi chép lại. Trong nhiều trường hợp, những thông tin trên rất hữu ích để tìm ra nguyên hay xuất hiện bệnh trong trại nuôi cá. II.1.1.3.2. Thông tin về sản xuất, môi trường và quản lý ao Chất lượng nước và những điều kiện môi trường biến động cũng có những ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe của cá có thể là ảnh hưởng trực tiếp (trong giới hạn chịu đựng về 22
mặt sinh lý) hay gián tiếp (làm tăng sự mẫn cảm của cá với mầm bệnh). Nhiệt độ, độ mặn, độ đục, vi khuẩn gây bẩn và sự phát triển của tảo đều là những yếu tố môi trường quan trọng. Mật độ nuôi cao trong các hệ thống nuôi thâm canh làm cho các bị sốc và gây nên những thay đổi về môi trường tạo điều kiện cho bệnh bộc phát. Sự tích tụ chất thải từ thức ăn thừa do cho ăn quá mức hay do cá giảm ăn đều sinh ra độc tố khi phân hủy làm ảnh hưởng trực tiếp đến cá và tạo điều kiện môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Các mầm bệnh này thường là các tác nhân gây bệnh thứ cấp. Ngoài ra các chất gây ô nhiễm khác cũng có thể ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe của cá. Thông tin vế môi trường nuôi đặc biệt là ở những hệ thống nuôi hở, ao, bè hay lồng rất quan trọng khi xác định nguyên nhân gây bệnh. Các thông tin cần phải ghi nhận càng thường xuyên càng tốt là: những thay đổi về thời tiết, nhiệt độ nước, hàm lượng oxy, pH, độ mặn, độ trong và sự phát triển của tảo và hoạt động của con người. II.1.1.3.3.Quan sát bề mặt cơ thể cá Những quan sát bề mặt cơ thể cá nói chung không cung cấp nhiều thông tin liên quan đến một sự cố về bệnh riêng lẻ nhưng những quan sát về dấu hiệu lâm sàng ở bề mặt cơ thể cùng với những biện pháp hợp lý như loại bỏ hoặc cách ly cá bệnh với cá khỏe, thu mẫu xét nghiệm có thể giảm đáng kể thất thoát do bệnh. II.1.1.3.4.Quan sát trên da và vây cá Những tổn thương trên da và vây thường là do bệnh truyền nhiễm, ví dụ như bệnh đỏ da ở cá chép. Tuy nhiên, những vết thương trước đó do những nguyên nhân cơ học (cá cọ vào thành bể hay do những sinh vật khác như cá dữ, chim) hay tổn thương hóa học tấn công sẽ tạo điều kiện cho các mầm bệnh sơ cấp hay thứ cấp (ví dụ như trường hợp nhiễm vi khuẩn Aeromonas) tấn công làm xấu thêm tình trạng sức khỏe của cá. Những thay đổi ở da liên quan đến bệnh, ví dụ như bệnh đốm đỏ dù là nhỏ hay to thường đòi hỏi phải có những động tác tích cực để xử lý. Những dấu hiệu bệnh thường xuất hiện xung quanh các tia vi, nắp mang, hậu môn và vùng đuôi, cũng có khi dấu hiệu bệnh lan khắp toàn thân. Những dấu hiệu như xuất huyết hoặc mất cân bằng thẩm thấu sẽ làm cho da cá sậm màu đi. Những vết thương bị xuất huyết trên da dễ dẫn đến tình trạng lở loét làm ảnh hưởng đến việc điều hòa áp suất thẩm thấu và khả năng đề kháng của cơ thể với các mầm bệnh thứ cấp. Hiện tượng lở loét thường gặp ở phần da vùng lưng và đầu và có thể do bệnh gây nên. Ở một số loài cá, những chỗ da bị sưng lên là dấu hiệu của sự mất vẩy hoặc sự tích tụ chất nhày. Ngoại ký sinh trùng hay giun dẹp cũng cần phải được lưu ý. Khi những loài ký sinh trùng này xuất hiện trên da cá nhiều hơn mức bình thường sẽ làm cho cá bị nhiễm những mầm bệnh thứ cấp, là dấu hiệu của sự phát bệnh hay bị sốc. Ký sinh trùng có thể bám trên bề mặt da cá hoặc ở giai đoạn ấu trùng sống trong bào nang/bào xác dưới da hay vi cá. Những dạng bào xác ấu trùng như ấu trùng sán lá song chủ metacercariae có thể phát hiện nhờ những đốm trắng hay đen dưới da (hoặc sâu trong mô). Mắt của cá cũng là nơi cần được quan sát cẩn thận để phát hiện bệnh. Hình dạng, màu sắc, tình trạng đục vẩn, bọt khí và những đốm đỏ nhỏ lấm tấm do xuất huyết đều là những dấu hiệu cho thấy cá sắp bị bệnh hoặc đang ở trong tình trạng nhiễm bệnh. Ví dụ 23
như trường hợp mắt cá bị to và trương phồng lên còn được gọi là cá bị lồi mắt thường liên quan đến nhiều trường hợp bệnh ở cá. II.1.1.3.5. Quan sát mang Mang cá là một trong số các mô dễ quan sát những thay đổi khi cá bị bệnh như mang nhợt nhạt hay bị lở loét. Những thay đổi ở mang cá thường là có liên quan đến bệnh và cần phải lưu tâm đặc biệt khi thấy những biểu hiện bất thường xuất hiện ở mang. Những đốm đỏ trên mang là dấu hiệu của sự xuất huyết đã làm giảm di khả năng thực hiện các chức năng của mang. Mang bị sinh vật gây bẩn bám, tích tụ nhiều chất nhày hay ký sinh trùng (tiêm mao trùng, sán lá đơn chủ, giáp xác chân chèo, nấm, v.v.) đều có thể làm hạn chế bề mặt tiếp xúc của mang và là dấu hiệu ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của cá. Những ảnh hưởng xấu ở mang có thể làm ảnh hưởng trực tiếp đến cá hoặc làm cho cá dễ mẫn cảm với các mầm bệnh thứ cấp khác. II.1.1.3.6. Quan sát trên cơ thể Bất kỳ một thay đổi khác thường nào về mặt hình dạng của cá đều là dấu hiệu không tốt về mặt sức khỏe. Những thay đổi về hình dạng thường gặp là “đầu nhọn” hay xảy ra ở cá con là dấu hiệu của sự phát triển không bình thường; hiện tượng ưỡn hay vẹo cột sống là dấu hiệu không tốt về dinh dưỡng hay môi trường. Phù cơ thể là một hiện tượng xuất hiện khá phổ biến và dễ nhận thấy nhất về mặt thay đổi hình dạng cơ thể của cá. Phù cơ thể là sự căng phồng phần bụng làm cho bụng cá trương to. Đây là dấu hiệu bệnh cho thấy có sự sưng lên của các nội quan cá như gan, tụy hay thận, sự tích tụ dịch cơ thể do ký sinh trùng hoặc do những nguyên nhân khác chưa rõ. Phù cơ thể là một trong những nhân tố của khá nhiều bệnh nguy hiểm ở cá liên quan đến sự ngưng trệ hệ thống điều hòa thẩm thấu do có nhiều tế bào máu của thận bị phá hủy. II.1.1.3.7. Quan sát bên trong cơ thể cá Quan sát bên trong cơ thể cá là bước tiếp sau việc quan sát những thay đổi về hoạt động/tập tính sống của cá. Mẫu cá bệnh phải được giải phẫu dọc theo phần bụng từ họng đến hậu môn để quan sát các nội quan và xoang cơ thể. Nên giải phẫu mẫu cá khỏe để so sánh những sai khác của nội quan cá khoẻ và cá bệnh. Nếu như cá khỏe mạnh và các mô cơ thể bình thường thì sẽ không thấy dịch cơ thể trong khoang bụng cá, cơ rắn chắc, có thể thấy những lớp mỡ có màu trắng kem xung quanh ruột và dạ dày. Thận có màu đỏ sẫm nằm sát phần tận cùng phía trên của khoang cơ thể giữa tuỷ sống và bóng hơi, gan có màu đỏ, tụy và lách cũng có màu đỏ. II.1.1.3.8. Quan sát khoang bụng và các mô Những dấu hiệu bệnh thường thấy nhất trong khoang cơ thể là sự xuất huyết và sự tích tụ dịch cơ thể. Những đốm máu có thể xuất hiện trong cơ vách của khoang cơ thể.Vách của khoang cơ thể mềm nhũn, rã ra khi giải phẫu là dấu hiệu cho biết cá đã chết lâu và sẽ không còn thích hợp cho việc chẩn đoán chính xác do sự xâm nhập rất nhanh của các vi sinh vật hoại sinh là mầm bệnh cơ hội khi sau khi cá chết. Hiện tượng hoại cơ còn có thể do cơ bị nhiễm trùng ví dụ như ký sinh trùng nhóm thích bào tử trùng (myxosporean). Có thể quan sát sự nhiễm trùng này bằng cách ép một mảnh 24
nhỏ mẫu mô bị nhiễm lên lam kính và quan sát bằng kính hiển vi giải phẫu để quan sát những thể vùi dạng bào tử. Một số loài ký sinh trùng nhóm vi bào tử trùng (microsporidian) và thích bào tử trùng có thể hình thành bào xác trong cơ của cá, mô liên kết các nội quan và khoảng cơ thể, và những cơ quan khác. Những dạng bào xác này tập trung thành từng cụm có hình cầu trắng và đòi hỏi thao tác định danh để xác định ký sinh trùng thuộc nhóm nào. Giun sán cũng có thể xuất hiện trong khoang bụng, nhóm này thường nằm cuộn lại xung quanh các nội quan và các mô màng bụng. Sự hiện của chúng thường không gây nguy hiểm cho cá tuy nhiên nếu chúng có quá nhiều trong khoang bụng sẽ gây chèn ép hay chiếm chỗ các nội quan của cá. II.1.1.3.9. Quan sát các nội quan Bất cứ những đốm trắng xám nào xuất hiện trên một trong những cơ nội quan của cá như gan, thận, tụy hay lách đều do bệnh vì những đốm trắng xám này là dấu hiệu của sự hoại tử hoặc tổn thương ở mô. Ở thận hoặc lách thì đây là dấu hiệu của sự ngưng sản xuất tế bào máu. Những vết loét trên thận còn có thể là do ảnh hưởng trực tiếp của sự điều hoà áp suất thẩm thấu. Những vết loét trên gan thì có thể do ảnh hưởng của cơ chế kháng khuẩn và kháng độc tố. Bất kỳ một nội quan nào của cá bị sưng lên đều là dấu hiệu của bệnh cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt. Khi ruột cá bị sưng thì phải kiểm tra xem là do thức ăn hay do sự tích tụ dịch nhày. Sự tích tụ dịch nhày là dấu hiệu của ngưng tiêu hóa thức ăn, loại bỏ chất thải cũng như sự kích động ruột thường có liên quan đến những bệnh nguy hiểm. Đây cũng có thể do sự xâm nhập cơ hội của những đoạn ruột đã bị kích động do sự thay đổi quá nhanh về thức ăn ví dụ như do trùng roi Hexamita salmonis. Ruột có đầy dịch nhày có thể nhận ra qua phân kết cụm, phân kéo dài hay có dịch nhày. Thông tin về phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh trên cơ thể cá cũng được trình bày trong phần bệnh cá, giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005). Các dấu hiệu bệnh thường gặp ở cá được trình bày ở phụ lục 3. II.1.2. Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi Quan sát mẫu giải phẫu tươi có thể được thực hiện ngay tại trại nuôi hay chỉ cần có kính hiển vi và các dụng cụ tiểu phẫu đơn giản là có thể thực hiện được nhằm giúp đánh giá tình trạng sức khỏe tôm/cá nuôi và phán đoán những nguyên nhân có thể gây bùng phát bệnh. Những phương pháp trình bày dưới đây thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh tôm. Ở cá, các kỹ thuật này cũng được áp dụng khá tương tự. Thông tin chi tiết về các phương pháp cơ bản trong chẩn đoán bệnh cá có thể tham khão thêm trong tài liệu hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy sản (Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease, FAO fisheries technical paper 402/2) hoặc trong giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005). Kính phết huyết tương Để kiểm tra hình thái của hồng cầu và sự hiện diện của vi trùng và ký sinh trùng trong máu. Những biến đổi như nhân bị co lại thường có liên quan đến bệnh Vibrio hoặc bệnh đầu vàng. Nhân bị vỡ và có nhiều thể vùi trong tế bào chất là biểu hiện đặc trưng của sự 25
nhiễm vi-rút gây bệnh đầu vàng (YHV). Vi khuẩn Vibrio thường phổ biến trong các trường hợp nhiễm khuẩn. Vi bào tử trùng (Microsporidium) cũng thường được tìm thấy trong máu. Có thể nhuộm mẫu huyết tương bằng phương pháp nhuộm Gram hay nhuộm Heamatocyline & Eosin (H&E) (xem phụ lục 4). Kính phết mẫu gan tụy, cơ và cơ quan sinh dục đặt lên lam cho vào một giọt dung dịch cố định Davidson, phết đều, để khô và nhuộm bằng thuốc nhuộm H&E. Phương pháp này có thể phát hiện các thể ẩn của vi-rút trong trường hợp tôm bị nhiễm nặng. Ngoài ra cũng có thể phát hiện nhóm Vibrio và vi bào tử trùng. Cố định mang tôm bằng dung dịch HCl Davidson và nhuộm bằng thuốc nhuộm H&E có thể phát hiện vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV), YHV và vi-rút gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV). Vi khuẩn gây bệnh đóng rong, nguyên sinh động vật, nấm mycosis và hiện tượng tiết hắc tố cũng được phát hiện bằng cách này (xem phụ lục 5). Quan sát tiêu bản tươi bằng cách lấy mẫu của mang, phụ bộ, cơ quan gan tụy, cơ, cơ quan sinh dục và ruột giữa cho vào một giọt dung dịch 2.8 % NaCl hoặc nước biển vô trùng, đậy bằng lam và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn dạng sợi, nguyên sinh động vật, vi khuẩn hình que có khả năng di động (thường là nhóm Vibrio), nấm mycosis, tảo khuê, tảo lục và cả mùn bã hữu cơ. Ở những chỗ bị đen dưới vỏ hoặc trong cơ có thể dùng dao tiểu phẫu để cắt mẫu và đặt mẫu lên phiến kính với một giọt dung dịch 2.8 % NaCl và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn gây bẩn, nguyên sinh động vật và nấm Furasium. Một số phương pháp nhuộm nhanh hiện đang được sử dụng để phát hiện vi-rút baculo ở tôm sú (Monodon baculovirus-MBV), YHV và WSSV (xem phụ lục 6). II.1.3. Phương pháp mô học Mô bệnh học là phương pháp xác định các tổn thương ở các mô tế bào dựa trên các thủ thuật nhuộm tế bào và quan sát bằng kính hiển vi. Phương pháp này cho phép người phân tích kết luận tính chất của các vùng tổn thương. So sánh và đối chiếu với các kết quả quan sát bên ngoài là công việc rất cần thiết để có được một chẩn đoán đúng. Nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thương bên ngoài mà không có các dữ kiện khác có liên quan đến cá tôm bệnh thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình thái tổn thương của vài bệnh có thể giống nhau và gây nhầm lẫn trong chẩn đoán. Phương pháp mô học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển vi và mô bệnh học là một chuyên môn hẹp của phương thức mô học đề cập tới quá trình phát triển bệnh. Mô bệnh học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp bệnh chỉ có thể chẩn đoán được bằng phương pháp này. Tuy nhiên, nó có những hạn chế nhất định, chẳng hạn, thao tác tương đối chậm và trong nhiều trường hợp bệnh tôm phải được xử lý ngay trước khi có được kết quả xét nghiệm mô học. Phương pháp mô học chỉ nên sử dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm để xác định tác nhân gây bệnh 26
Trước khi quan sát dưới kính hiển vi, mẫu phải được cố định để tránh bị hư thối, loại bỏ thức ăn và đúc khối sáp. Cắt mẫu thành từng lát mỏng khoảng 5 micromet, rồi đặt lên lam, nhuộm màu và đậy bằng lam kính. Thịt tôm bị phân hủy cực kỳ nhanh sau khi tôm chết, vì thế cần phải cố định chúng. Tôm chết dù được giữ trong nước đá hay đông lạnh cũng đều vô ích đối với phương pháp mô học do những biến đổi xảy ra trong cơ. Dung dịch cố định tôm tốt nhất là dung dịch Davidson’s và formaline đệm trung tính (phụ lục 5). II.1.3.1. Mục tiêu - Nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào (vi thể) - So sánh đối chiếu các tổn thương với những biểu hiện lâm sàng của vật chủ để tìm hiểu mối quan hệ mật thiết giữa biến đổi hình thái và các rối loạn chức năng làm cơ sở cho việc chẩn đoán. II.1.3.2. Những điều cần lưu ý khi sử dụng phương pháp mô bệnh học: 1. Kết quả phân tích mô học có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán bệnh hiển thị quan hệ trực tiếp giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ 2. Khi thực hiện các phân tích mô học cần phải ghi nhận và phân loại những biến đổi về hình thái và cấu tạo ở mức tế bào. Mỗi loại mô, tế bào có những biểu hiện khác nhau với tác nhân gây bệnh. II.1.3.3. Phương pháp mô học bao gồm các bước: 1. Các giai đoạn tạo lát cắt tế bào (tiêu bản mô học) - Thu mẫu (theo phương pháp của Lightner, 1996) - Cố định mẫu (dung dịch Davidson’s). Sau đó trữ trong dung dịch 50-70 % alcohol. - Cắt mẫu - Tách nước - Đúc parafin - Cắt mẫu bằng microtom - Dùng xylen để loại parafin ra khỏi lát cắt. 2. Nhuộm lát cắt bằng phương pháp nhuộm H&E 3. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi và nhận định kết quả 27
II.2. KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH II.2.1. Nguyên tắc Kỹ thuật hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry-IHC) cho phép phát hiện kháng nguyên trên tiêu bản mô bằng cách sử dụng kháng thể có tính đặc hiệu với kháng nguyên qua phản ứng kháng nguyên-kháng thể. Kháng thể dùng cho phản ứng có thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang (kỹ thuật IFC), enzym, chất phóng xạ… để có thể nhận biết khi quan sát dưới kính hiển vi điện, kính hiển vi huỳnh quang hay những loại kính hiển vi khác (hình 2.1). II.2.2. Ứng dụng - Xác định tác nhân gây bệnh một cách chuyên biệt dựa trên tính nhạy và tính chuyên biệt của phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể. - Do khả năng phát hiện kháng nguyên trong tiêu bản mô hay tế bào nên phương pháp này cho phép tìm hiểu khả năng gây bệnh của tác nhân gây bệnh . - Quan sát bằng kính hiển vi điện hay kính hiển vi huỳnh quang, một vài phương pháp đặc biệt được sử dụng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Hình 2.1. Nguyên lý kỹ thuật IHC (KT: kháng thể; KN: kháng nguyên) 28
II.2.3. Mẫu phân tích Mẫu sử dụng là mô hay dịch cơ thể còn tươi: thời gian chuẩn bị mẫu thường là khoảng 24 giờ. Sau đó mẫu được xử lý bằng một trong các phương pháp sau: Vết bôi/kính phết: vết bôi dùng cho xét nghiệm IHC phải được gởi đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 giờ sau khi chuẩn bị tiêu bản. Trường hợp lâu hơn 48 giờ thì mẫu phải được giữ trong tủ lạnh và tránh ánh sáng để kháng nguyên không bị hư. Thông tin chi tiết về việc chuẩn bị tiêu bản phải được sự hướng dẫn của phòng thí nghiêm nhận mẫu. Formalin: cố định mẫu (dày khoảng
II.2.5.2. Nhược điểm: - Thời gian giữ mẫu trong formalin càng lâu sẽ càng dễ gây ra hiện tượng liên kết giữa các kháng nguyên tạo kết quả dương tính giả. - Đòi hỏi quá trình tạo ra kháng thể chuyên biệt, kiểm tra tính ổn định của phản ứng giữa kháng thể và kháng nguyên. - Một số kháng thể chỉ có thể cho phản ứng có hiệu quả với mẫu đông lạnh. - Kết quả âm tính hay dương tính giả phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của mô được sử dụng, phương pháp và thời gian cố định, kinh nghiệm làm việc với kháng thể của người phân tích. II.3. KỸ THUẬT NUÔI VI SINH VẬT Những kỹ thuật nuôi vi sinh vật giúp cho việc chẩn đoán sơ bộ mầm bệnh vi sinh vật ở mức họ hoặc có khi đến mức giống. Trong trường hợp đòi hỏi phải có chẩn đoán xác định thì phải sử dụng những phương pháp định danh chuyên biệt tùy theo loài hoặc týp. Tuy nhiên hạn chế của phương pháp nuôi vi sinh vật trong chẩn đoán bệnh là thường dễ gặp trường hợp âm tính giả đối với một số mầm bệnh vi sinh đòi hỏi điều kiện nuôi cấy đặc biệt. Mặt khác vấn đề tạp nhiễm trong quá trình nuôi cấy rất dễ gây nên hiện tượng dương tính giả trong chẩn đoán. II.2.1. Nuôi vi khuẩn II.2.1.1. Ứng dụng Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn của loài vi khuẩn phân lập được trên mẫu bệnh phẩm II.2.1.2. Phương pháp Phân lập và nuôi vi khuẩn bằng môi trường chọn lọc tùy theo dạng vi khuẩn được nuôi. Vi khuẩn thường được nuôi trong môi trường có chứa kháng sinh mà chúng kháng. Cách làm này vừa có thể giúp kiểm soát sự phát triển của chúng, theo dõi sự thay đổi khả năng kháng thuốc trong cùng một quần thể cũng như giúp xác định loại kháng sinh có hiệu lực với loài vi khuẩn đó. Một số môi trường chọn lọc thường được sử dụng nuôi mầm bệnh vi khuẩn ở thủy sản như: - Vibrio sp: TCBS - Aeromonas sp: aeromonas agar + ampicillin, rimler short agar, ampicillin-dextrin agar - Flexibacter sp: Cytophaga - Edwardsiella ictaluri: Edwardsiella ictaluri agar 30
II.2.1.3. Mẫu phân tích Cơ, gan, thận hay máu của sinh vật bị bệnh. Trong một số trường hợp bệnh phẩm thủy sản lở loét mẫu có thể được thu bằng cách dùnh gạc bông gòn lấy mẫu tại vết thương. Mẫu cũng có thể được thu từ dịch cơ thể của bệnh phẩm. II.2.1.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh. Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và dễ bị tạp nhiễm với các mầm bệnh cơ hội II.2.2. Nuôi nguyên sinh động vật II.2.2.1. Ứng dụng Giúp đánh giá tình trạng nhiễm nguyên sinh động vật trên mẫu bệnh phẩm II.2.2.2. Phương pháp Nguyên sinh động vật được nuôi trên các dòng tế bào đặc biệt có bổ sung fetal bovine serum và kháng sinh như penicillin, streptomycin để tránh nhiễm khuẩn. II.2.2.3. Mẫu phân tích Mẫu ruột, phân, máu hay các mô cơ thể. Cách tốt nhất là rửa mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý có chứa kháng sinh để tránh nhiễm khuẩn, sau đó giữ trong tủ lạnh trước khi chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. II.2.2.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh. Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và sau khi thu mẫu phải được xử lý trong vòng 24 giờ II.2.3. Nuôi vi-rút II.2.3.1. Ứng dụng Việc nuôi vi-rút thường được sử dụng nhằm hỗ trợ cho các phép chẩn đoán nhiễm vi-rút. Việc phân lập vi-rút thường gắn với các xét nghiệm phân tử như PCR nên phương pháp thu mẫu cũng phải được thực hiện tùy theo vi-rút là DNA hay RNA vi-rút. 31
II.2.3.2. Phương pháp Vi-rút là sinh vật sống ký sinh bắt buộc nên việc nuôi vi-rút thường được thực hiện trên tế bào sống hoặc trong cơ thể sinh vật sống. Tế bào sống thường được nuôi trong đĩa petri hoặc trong lọ tiệt trùng. Mẫu được nghiền và sau đó cho vào môi trường nuôi cấy và nhiệt độ thích hợp để vi-rút phát triển. II.2.3.3. Mẫu phân tích Mẫu phải được thu vào thời điểm có bệnh bộc phát vì vi-rút có thể không còn hiện diện trên cơ thể vật chủ khoảng 2 ngày sau khi có thấy dấu hiệu bệnh lý. Tùy theo điều kiện thực tế mà mẫu có thể được vận chuyển sống, ướp nước đá, nước đá khô hoặc nitơ lỏng để chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu gởi đến phòng thí nghiệm phải kèm theo các thông tin về loại mẫu, loại vi-rút tình nghi bị nhiễm và thời gian quan sát thấy dấu hiệu bệnh lý liên quan đến vi-rút đó. Mẫu được thu có thể là mẫu mô hoặc dung dịch trích từ mô trong điều kiện vô trùng, mẫu máu được thu với dung dịch chống đông. Điều kiện vận chuyển và lưu trữ mẫu tùy theo loại vi-rút và sẽ tùy theo phòng thí nghiệm phân tích hướng dẫn. Một số phòng thí nghiệm đòi hỏi mẫu phải được giữ trong môi trường có bổ sung protein và kháng sinh khi vận chuyển, mẫu phải được vận chuyển trong nước đá trong vòng 24 giờ, hoặc phải giữ lạnh ở 4°C nếu vận chuyển trong vòng 5 ngày. Trường hợp lâu hơn 5 ngày phải giữ mẫu ở -70°C, v.v…. II.2.3.4. Đọc kết quả Nhìn chung, việc phân lập vi-rút từ mô hay máu của vật chủ bị bệnh là đầy đủ làm chứng cứ cho sự nhiễm vi-rút. Tuy nhiên, vi-rút có thể tham gia như là mầm bệnh thứ cấp chứ không phải là tác nhân gây bệnh chủ yếu. Điều cần thiết trong quá trình chẩn đoán là phải có cơ sở cho thấy vi-rút có liên quan đến sự tổn thương của cơ thể vật chủ hoặc vi-rút là tác nhân gây bệnh chủ yếu. Việc này đòi hỏi những kỹ thuật có thể xác định vai trò gây bệnh của vi-rút như tế bào học hoặc mô bệnh học đi kèm theo bằng những phương pháp như IHC hay hiển vi điện tử. Cần phải ghi nhận rằng hiện tại qui trình PCR đã được phát triển đối với hầu hết vi-rút gây bệnh ở thủy sản giúp cho việc sàng lọc và xác định vi-rút mới khá hiệu quả. Tuy nhiên việc sử dụng PCR thuần túy để chẩn đoán bệnh cần phải được thận trọng khi xác nhận quan hệ giữa vi-rút và dấu hiệu bệnh lý. 32
II.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II 1. Alday de Graindorge, V. and Flegel, T.W. (1999). Diagnosis of shrimp diseases with emphasis on black tiger prawn, Penaeus monodon. 2. Austin, B., and Austin, D. A. (999). Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed and wild fish 3rd Edition 3. FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. Fisheries technical paper 402/2. 4. Forbes, B. A., Sahm, D. F., and Weissfeld, A. S. (2002). Laboratory methods in basic virology In: Diagnostic Microbiology. 11th edition. 5. Hirsh, D. C., MacLachlan, N. J., and Walker, R. L. (2004). Laboratory Diagnosis. In: Veterinary Microbiology 2nd edition. 6. Lightner, D. V. (1996). A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp. 7. Noga, E. J. (1999). Fish Disease: Diagnosis and Treatment. 8. OIE (2006). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. 9. Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Ngọc Hải. (2002). Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi. 10. Tonguthai, K., Chinabut, S., Somsiri,T., Chanratchakool, P., and Kanchanakhan, S. (1999). Diagnostic Procedures for Finfish Diseases 11. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005). Giáo trình bệnh học thủy sản. 33