Giáo trình-Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản-chương 4

Chia sẻ: Vu Dinh Hiep | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

Thêm vào BST

Báo xấu

242
lượt xem 70
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

CHƯƠNG 4: CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ IV.1. KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction-PCR) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng DNA in vitro không cần có sự hiện diện của tế bào. IV.1.1. Nguyên tắc Tất cả các DNA polymeraza khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình-Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản-chương 4

CHƯƠNG 4: CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ IV.1. KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction-PCR) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng DNA in vitro không cần có sự hiện diện của tế bào. IV.1.1. Nguyên tắc Tất cả các DNA polymeraza khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymeraza sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA thì chỉ đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen. Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn sau (hình 4.1): IV.1.1.1. Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là ở 94-95 ºC trong vòng 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn. IV.1.1.2. Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ dược hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70 ºC tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1phút. Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. IV.1.1.3. Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension): Nhiệt độ được tăng lên đến 72 ºC. Đó là điều kiện tốt nhất để cho Taq polymeraza hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymeraza hoạt động. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Theo Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq là 150 nucleotit/giây ở nhiệt độ 75oC - 80oC; 60 nucleotit/giây ở 70oC; 24 nucleotit/giây ở 55oC; 1,5 nucleotit/giây ở 37oC và ở nhiệt độ 22oC chỉ còn 0,25 nucleotit/giây. Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử DNA khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn DNA vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì hai đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi. Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng đoạn DNA được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản 48
sẽ tạo ra 2n bản DNA từ một khuôn ban đầu. Sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng bản mẫu ban đầu. Hình 4.1. Nguyên lý kỹ thuật PCR IV.1.2. Ứng dụng PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau, như phân tích hệ gen của động vật và thực vật vì nó cho phép tạo ra một lượng lớn các đoạn trình tự đặc hiệu, xác định trình tự của DNA được nhân bản, nhân bản quần thể mRNA để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc hiệu từ cDNA để làm mẫu lai, xác định sinh vật chuyển gen. PCR cũng được dùng để phân tích tiến hoá, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA trong và giữa các quần thể. 49
PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, vi-rút, ký sinh trùng (protozoa hay metazoa) và nấm. Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở cá và tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm có: (i) ở cá có vi-rút gây bệnh ở cá nheo mỹ (channel catfish virus-CCV), vi-rút gây nhiễm trùng và hoại tử cơ quan tạo máu (infectious hematopoietic necrosis virus-IHNV), vi-rút gây nhiễm trùng và hoại tử tuyến tụy (infectious pancreatic necrosis virus-IPNV), vi-rút gây xuất huyết và nhiễm trùng máu (viral hemorrhagic septicemia virus-VHSV), vi-rút gây hoại tử hệ thần kinh (viral nervous necrosis virus-VNNV) và Renibacterium salmoninarum; (ii) ở tôm có vi-rút đốm trắng (WSSV), vi-rút đầu vàng (YHV), vi-rút gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious hypodermal and haematopoeitic necrosis virus-IHHNV), vi-rút gây hộI chứng taura (Taura syndrome virus-TSV), nội ký sinh trùng và vi khuẩn đặc biệt là nhóm Vibrio. IV.1.3. Phương pháp IV.1.3.1. Ly trích DNA hay RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn Trong phòng thí nghiệm DNA hoặc RNA được ly trích từ mẫu bệnh phẩm. Mô cơ thể được ly trích tùy thuộc vào nơi mà mầm bệnh muốn chẩn đoán thường tấn công. IV.1.3.2. Chuẩn bị Thành phần của một phản ứng PCR (reaction mix) bao gồm DNA khuôn tức là đoạn trình tự DNA cần được nhân lên; 2 đoạn mồi, mỗi mồi dài khoảng 18-24 nucleotid; DNA polymeraza (thường hiện nay sử dụng là Taq polymeraza - là một loại enzym chịu nhiệt); bốn loại deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) và dung dịch đệm và ion Mg2+. Phản ứng PCR tối ưu khi DNA khuôn tinh sạch, nhưng một ưu điểm lớn của phương pháp PCR là cho phép nhân cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phá hủy từng phần như những vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hoá thạch, tóc, móng tay của người đã chết... Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuyếch đại một đoạn DNA đặc trưng. Mồi luôn gắn với DNA khuôn ở đầu 3’ và DNA polymeraza kéo dài chuỗi tổng hợp theo chiều 5’ → 3’. Trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ trong phản ứng PCR là những nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng PCR. Việc chọn mồi cũng phải tuân thủ một số nguyên tắc như: - Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi. - Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt nhau quá xa. - Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. 50
- Trình tự nằm giữa 2 mồi không quá lớn. Phản ứng PCR sẽ tối ưu nếu đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb. Trước đây trong phản ứng PCR người ta thường dùng DNA polymeraza I tách chiết từ DNA polymeraza thông dụng nhất là Taq polymerse được tách ra từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng 94-100 °C. Enzym này có hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 70-80 °C, có trọng lượng phân tử là 94kD, gồm 832 axit amin do gen có 2499 cặp bazơ tổng hợp nên. Saiki (1988) đã chỉ ra rằng hoạt tính của Taq polymeraza giảm 50% sau 130 phút ở nhiệt độ 92,5 °C, sau 40 phút ở 95 °C và sau 5-6 phút ở 97 °C. Mặt khác, nồng độ ion Mg2+ và dNTP trong hỗn hợp phản ứng cũng ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính của Taq polymeraza. Bốn loại nucleotit thường được sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 µM/mỗi loại nucleotit, nếu sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotit xãy ra sẽ dẫn tới các lỗi sao chép của DNA polymeraza. Nồng độ ion Mg2+ cũng là nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Tuy nhiên không có một quy luật chung cho vấn đề này. Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua thử nghiệm. Trong thực tế số chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kỳ. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn ra qua 2 giai đoạn. Trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu. Sau đó hiệu quả khuyếch đại giảm do các nguyên nhân sau: - Hoạt tính của polymeraza giảm theo thời gian ở nhiệt độ cao - Sự cạn kiệt các thành phần của phản ứng. - Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau - Sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng. PCR được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt và sau đó các đoạn DNA được phân biệt bằng kỹ thuật điện di bản thạch và nhuộm bằng ethidium bromide và chụp ảnh dưới tia UV. IV.1.3.3. Đối chứng Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn cần phải có những đối chứng sau: 1. Không có DNA/RNA: phản ứng PCR không có mạch khuôn DNA để kiểm soát trường hợp bị tạp nhiễm 2. DNA/mRNA của vật chủ: để chắc chắn axit nucleic mẫu cũng được khuếch đại và mồi không đặc hiệu với hệ gen của vật chủ 3. Đối chứng dương: phản ứng PCR có mạch khuôn DNA đặc hiệu với mồi 51
IV.1.4. Các hạn chế của phương pháp PCR 1. Phương pháp PCR thông thường không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. 2. Sự ngoại nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước 3. Các sai sót gây ra do taq polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì enzym gắn sai 1 nucleotic) IV.1.5. Các dạng PCR IV.1.5.1. PCR truyền thống Ứng dụng: PCR truyền thống (conventional PCR) hiện đang là một trong những phương pháp có tính nhạy cao được sử dụng rất phổ biến để phát hiện và xác định trình tự DNA của vi-rút, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng. Mẫu sử dụng: - Mẫu mô bệnh, huyết tương hay dung dịch thu từ vết lở loét - Lưu trữ mẫu: -20°C hay -70°C. - PCR có thể được thực hiện từ mẫu đúc parafin. Nhưng sản phẩm PCR không phù hợp cho việc giải trình tự về sau. - DNA khi đã tiếp xúc với formalin hơn 48 giờ sẽ không còn sử dụng cho PCR được nữa. Ưu điểm: - Phương pháp PCR truyền thống rất nhạy chỉ cần một số lượng DNA nhỏ là có thể khuếch đại và phát hiện. Phương pháp được sử dụng để phát hiện mầm bệnh ở mức rất thấp. - DNA là phân tử sinh học khá bền nên PCR có thể áp dụng với những mẫu chết không thể áp dụng các kỹ thuật nuôi cấy. - Thao tác thực hiện nhanh. - PCR được thực hiện với số lượng mẫu rất nhỏ (tối đa là 25 mg mẫu/phản ứng). Nhược điểm: - Dễ bị tạp nhiễm: do tính nhạy cao, lỗi thao tác - Đòi hỏi thêm phương pháp chẩn đoán khác để xác định tác nhân gây bệnh 52
IV.1.5.2. PCR phiên mã ngược Nguyên lý: PCR phiên mã ngược (reverse transcriptase PCR) là phương pháp PCR được sử dụng để khuếch đại, phân lập hay xác định thư viện RNA của mô hay tế bào. Để thực hiện RT-PCR trước hết RNA sau khi ly trích phải được phiên mã bằng men phiên mã ngược (Reverse transcriptase) để chuyển RNA thành cDNA (complementary DNA) rồi thực hiện PCR truyền thống với cDNA (xem hình 4.2). Hình 4.2. Nguyên lý RT-PCR Ứng dụng: là một trong những phương pháp có tính nhạy cao được sử dụng rất phổ biến để phát hiện và xác định trình tự RNA của vi-rút và vi khuẩn. Mẫu sử dụng: mẫu mô bệnh, huyết tương hay dung dịch thu từ vết lở loét, mẫu là mẫu tươi hay được lưu trữ ở -70 °C. Ưu điểm: là phương pháp nhạy và chuyên biệt để phát hiện RNA của vi-rút hay vi khuẫn trong mẫu bệnh phẩm dựa trên trình tự của gen 16s hay 18s. Nhược điểm: RNA bị phân hủy nhanh nên mẫu phải được thu và lưu trữ đúng qui cách. Thao tác ly trích RNA phức tạp và khó thực hiện hơn nhiều so với DNA. 53
IV.1.5.3. PCR thời gian thật Ứng dụng: PCR thời gian thật (real-time PCR) là dạng biến hoá của PCR được sử dụng để phát hiện trình tự và số lượng DNA hoặc RNA của mầm bệnh. Phương pháp: căn cứ trên sự phân cắt DNA theo chiều 5'-3' của DNA polymerase cắt mẫu dò được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang trong phản ứng PCR giúp xác định cường độ của chất đánh dấu và từ hệ số tương quan tính được hàm lượng DNA trong mẫu phân tích. Mẫu sử dụng: mẫu mô bệnh, huyết tương hay dung dịch thu từ vết lở loét, mẫu là mẫu tươi hay được lưu trữ ở -70 °C. Ưu điểm: phương pháp PCR thời gian thật rất nhạy và chuyên biệt. Cho phép xác định số lượng vi-rút nhiễm trong mô của bệnh phẩm. Qui trình thực hiện trong vòng (24 – 48 giờ). Nhược điểm: tốn kém, đòi hỏi thời gian và trình độ chuyên môn để thiết kế qui trình. IV.2. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG VỀ CHIỀU DÀI ĐOẠN GIỚI HẠN IV.2.1. Nguyên lý Kỹ thuật phân tích tính đa dạng về chiều dài đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphism-RFLP) dựa trên sự tách biệt từng đoạn DNA bằng các enzym giới hạn (restriction enzyme-RE). Sự di chuyển của DNA từ thạch đến màng thấm và sử dụng mẫu dò DNA qua phương pháp lai phân tử để phát hiện các đoạn DNA với trình tự đặc hiệu. Kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization) dựa trên nguyên lý là lai phân tử giữa mẫu dò DNA với các phân tử DNA được lưu giữ trên giá thể để dò tìm các phân tử sinh học đặc trưng. Kỹ thuật này có hiệu quả cao trong nghiên cứu phát hiện các đại phân tử sinh học có cấu trúc phân tử phức tạp. Nó có thể áp dụng cho mọi loại đại phân tử sinh học có khả năng gắn kết vào giá thể lưu giữ như màng nitrocellulose, màng nylon, màng giấy cellulose, nhưng vẫn duy trì được khả năng gắn kết với các nhóm chất hiển thị khác. IV.2.2. Phương pháp Phương pháp Southern được Giáo sư Edwin M. Southern xây dựng và thử nghiệm thành công vào năm 1975. Ở đây, quá trình lai phân tử xảy ra khi hai đoạn mạch đơn DNA bắt cặp và gắn kết với nhau trên nguyên tắc bổ xung cho nhau. Các bước tiến hành trong kỹ thuật này có thể được tóm tắt như sau: - DNA bộ gen được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bằng một hay nhiều enzym giới hạn (RE) và được phân tách bằng điện di trên bản gel. - DNA được biến tính ngay trên gel rồi được thấm truyền lên màng lai. Trong quá trình thấm truyền vị trí các đoạn DNA trên màng lai được giữ nguyên như trên bản gel. 54
- DNA cố định trên màng được đem lai với mẫu dò DNA có đánh dấu bằng phóng xạ hoặc hoá học. Sau quá trình lai người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp. - Cuối cùng người ta dùng kỹ thuật phóng xạ hoặc hoá học tự ghi để định vị các phân tử lai và hiển thị trên phim thành từng băng dạng vạch ngang. Việc phát hiện các phân tử trên màng được tiến hành thông qua kỹ thuật đánh dấu. Phổ biến nhất là gắn các nucleotide với các đồng vị phóng xạ 32P dạng 32P-dNTP. Ưu điểm lớn của phương pháp phóng xạ này là có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện được vết DNA ở mức ng (10-9 g) và thấp hơn. Tuy nhiên phương pháp đánh dấu phóng xạ đòi hỏi phòng thí nghiệm có những thiết bị kiểm tra và bảo đảm an toàn phóng xạ đồng bộ. Những năm gần đây kỹ thuật phi phóng xạ (non-radioactive) hay kỹ thuật đánh dấu lạnh (cold labelling) đang từng bước thay thế kỹ thuật phóng xạ. Trong đó nổi bật là kỹ thuật phát quang hoá học kích hoạt (Enhancing Chemical Luminecsence, ECL) và kỹ thuật sử dụng đánh dấu với digoxigenin (DIG). IV.2.3. Hệ thống phi phóng xạ DIG Hệ thống phi phóng xạ DIG là phương pháp đánh dấu và phát hiện axít nucleic rất nhạy bén và hữu hiệu. Hệ thống này mang nhiều tính ưu việt như an toàn, mẫu dò đánh dấu có độ bền cao và dung dịch lai có thể dùng lại vài lần. So với phương pháp đánh dấu bằng chất phóng xạ, phương pháp này cũng có thuận lợi như độ nhạy cao và phông nền sạch. Nhưng lại tránh được những bất lợi như sự rủi ro trong khi sử dụng chất phóng xạ, chất thải độc hại, thời gian hiện phim lâu, tính không bền của mẫu dò đã đánh dấu. Trong hệ thống DIG, mẫu dò là DNA, RNA hay các oligo được đánh dấu bằng cách gắn với digoxigenin (DIG). Đối với mẫu dò là DNA, yếu tố DIG-11-dUTP được dùng để đánh dấu và được gắn kết với phân tử DNA thông qua phản ứng PCR hay lai với các mồi ngẫu nhiên mang yếu tố đó (hình 4.3). Hình 4.3: Cấu trúc của Alkali-labile Digoxigenin (DIG) - dUTP Ở phương pháp thứ nhất (hình 4.4a), với DIG-dUTP có trong hỗn hợp phản ứng PCR, sản phẩm mẫu dò được tạo ra rất đặc hiệu và có độ nhạy cao. Chỉ cần 10 pg đối với DNA plasmit hoặc 10 ng đối với DNA genom là đủ để tạo ra mẫu dò lai Southern. Phương pháp đánh dấu DNA bằng PCR đặc biệt thuận lợi trong dò tìm bản gen đơn lẻ trên màng thấm hệ gen. 55
Trong phương pháp thứ hai (hình 4.4b), enzym Klenow sao chép khuôn mẫu DNA với sự có mặt của các đoạn 6 nucleotit ngẫu nhiên và DIG-dUTP. Trung bình cứ 20-25 nucleotit trên mạch DNA mới tổng hợp có một phân tử DIG gắn vào. Như vậy, mẫu dò tạo ra được đánh dấu đồng đều, rất nhạy, có thể dò tìm đích trong 0.10-0.03 pg DNA. Sản phẩm mẫu dò là tổ hợp của các đoạn có độ dài khác nhau. Không giống như đáng dấu bằng PCR, phương pháp này đỏi hỏi phải có khuôn mẫu DNA rất sạch. Tín hiệu từ mẫu dò sau khi đã lai với axit nucleic trên màng được phát hiện nhờ kỹ thuật hoá miễn dịch. Đó là phản ứng liên kết giữa kháng thể của Digoxigenin và Digoxigenin gắn trong mẫu dò. Tiếp theo, các phân tử liên kết này được nhìn thấy nhờ vào phản ứng với hợp chất tạo sắc hoặc phát quang. Các hợp chất tạo sắc tạo ra ra tín hiệu màu trực tiếp trên màng. Còn các hợp chất phát quang có độ nhạy cao thì sản sinh ra ánh sáng có thể ghi nhận lại trên phim X-quang giống như ở phương pháp đánh dấu bằng chất phóng xạ 32P hay 35S. IV.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật lai Southern Kỹ thuật lai Southern là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng được sử dụng nhiều trong các phân tích phân tử như: lập bản đồ giới hạn của một gen, phát hiện các đa hình độ dài của cùng một gen ở các chủng hay giữa các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn, phát hiện các đột biến mất đoạn/đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn, phát hiện sinh vật chuyển gen và đánh giá số lượng bản gen và điểm gắn của gen chuyển. (a) (b) Hình 4.4: Các phương pháp đánh dấu của DIG. (a) đánh dấu bằng PCR; (b) đánh dấu bằng các đoạn 6 nucletit ngẫu nhiên. 56
IV.2.5. Mẫu phân tích Mẫu có thể sử dụng là mẫu mô, máu hoặc mẫu ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm từ những vết thương của mẫu bệnh phẩm. IV.2.6. Ưu và nhược điểm IV.2.6.1. Ưu điểm: Rất chuyên biệt và có độ tin cậy cao IV.2.6.2. Nhược điểm: Mất thời gian để thực hiện (10 - 14 ngày). IV.3. KỸ THUẬT LAI IN SITU IV.3.1. Nguyên lý Kỹ thuật lai In situ (In-situ hybridization) được phát triển từ phép lai Southern blot, kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn DNA hoặc kháng thể) để lai với DNA, RNA hay protein ngay ở trong tế bào mà không cần tách chiết chúng. Người ta thường sử dụng mẫu mô được cố định bằng formalin như trong trường hợp cố định mẫu phân tích mô bệnh học. Mẫu dò trong lai In situ thường được đánh dấu bằng phương pháp hóa học (chất phát huỳnh quang). Các mẫu dò này được tổng hợp từ những nucleotide mang những liên kết hóa học đặc biệt. Các mẫu dò này sau khi lai sẽ được phát hiện nhờ kháng thể hoặc các protein khác nhận biết các liên kết hóa học của chúng. IV.3.2. Ứng dụng Phương pháp lai In-situ phát hiện được sự có mặt và vị trí axit nucleic của mầm bệnh trên mô giúp thiết lập sự liên quan giữa mầm bệnh và vật chủ. IV.3.3. Mẫu phân tích Mẫu mô cố định trong paraffin 57
IV.3.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp IV.3.4.1. Ưu điểm: Lai in-situ rất hữu hiệu trong việc xác định sự có mặt của mầm bệnh trên vết thương hay trong mô của vật chủ bị bệnh. Giúp thiết lập sự liên quan giữa mầm bệnh và vật chủ. IV.3.4.2. Nhược điểm: phương pháp lai in-situ khó thực hiện và đòi hỏi thời gian và trình độ chuyên môn để thiết kế qui trình. IV.4. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG IV 1. Shimkets, R. A. (2004). Methods in Molecular Biology. 2. Southern, S. A. and Herrington, C. S. (1998). In-situ hybridization. In: PCR In-Situ hybridization: A practical approach. 3. Yeary, T. J. (2004). A primer on Diagnostic Virology: Direct and Molecular-Based Detection of Viral Pathogenesis. 4. Watson, J. D., Gilman, M., Witkowski, J. and Zoller, M. (1998). DNA-Based Diagnosis of Genetic Disease. In: Recombinant DNA. 2nd Edition. 5. Eeles, R. A. and Stamps, A. C. (1993). Polymerase Chain Reaction (PCR). The technique and its applications, 3rd edition. 6. Flint, S. J., Enquist, L. W., Krug, R. M., Skalka, A. M. and Racaniello, V. R. (2000). Virus cultivation, Detection, and Genetics. In: Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis and Control. 7. Leutenegger, C. M. (2001). The Real-Time TaqMan PCR and Applications in Veterinary Medicine. 58