Giáo trình Vi sinh vật học part 6

Chia sẻ: Afasg Agq | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

214
lượt xem 62
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Điều ngạc nhiên là một số vi khuẩn lactic (và cả các vi khuẩn lên men khác) khi sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng chứa máu có thể tạo thành các xitocrom và thậm chí có thể tiến hành quá trình phosphorin hóa chuỗi hô hấp. Vì vi khuẩn lactic thiếu năng lực tổng hợp các pocphirin nên khi các pocphirin được bổ sung vào môi trường thì một số vi khuẩn lactic có thể tạo thành các sắc tố hem tương ứng. Vi khuẩn lactic được coi như những kẻ què quặt về trao đỗi chất. ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Vi sinh vật học part 6

158 những số lượng khá lớn cao nấm men, dịch cà chua, dịch đường sữa hoặc thậm chí cả máu nữa. Điều ngạc nhiên là một số vi khuẩn lactic (và cả các vi khuẩn lên men khác) khi sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng chứa máu có thể tạo thành các xitocrom và thậm chí có thể tiến hành quá trình phosphorin hóa chuỗi hô hấp. Vì vi khuẩn lactic thiếu năng lực tổng hợp các pocphirin nên khi các pocphirin được bổ sung vào môi trường thì một số vi khuẩn lactic có thể tạo thành các sắc tố hem tương ứng. Vi khuẩn lactic được coi như những kẻ què quặt về trao đỗi chất. Có thể rằng do hậu quả của sự chuyên hóa sinh trưởng trong sữa hoặc trên những môi trường giàu chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng, chúng đã mất đi khả năng tổng hợp nhiều chất trao đỗi. Trong khi đó chúng lại có khả năng mà đa số các vi khuẩn khác không có, đó là khả năng sử dụng lactose. Khả năng này nhiều vi khuẩn đường ruột (ví dụ Escherichia coli) cũng có. Lactose không có mặt trong giới thực vật, nó được các động vật có vú tạo thành và tiết ra cùng với sữa hoặc được hấp thu vào cùng với sữa. Việc sử dụng được lactose cũng có thể được xem như một sự thích nghi với các điều kiện tồn tại trong đường ruột của động vật có vú. Lactose là một đisaccarit, trước khi đi vào các con đường phân giải hexose nó phải được phân cắt : β- Galactozidase Lactose + H2O D-glucose + D-galactose Sau khi được phosphorin hóa galactose được chuyển thành glucosephosphate. Do có sự sản sinh một lượng lớn lactat nên môi trường dinh dưỡng cần phải được trung hòa. Thường người ta dùng cacbonat canxi. Trên một môi trường thạch dinh dưỡng có bổ sung cacbonat canxi có thể nhận ra sự tạo thành acid qua các vòng trong suốt bao quanh các khuẩn lạc. Nơi sống chủ yếu của các vi khuẩn lactic là sữa và những nơi sản xuất và chế biến sữa, thực vật nguyên vẹn hoặc đang tự phân hủy, cũng như đường ruột và niêm mạc của người và động vật. Do tạo thành một lượng lớn lactat và do tính chịu chua mà dưới các điều kiện môi trường thích hợp các vi khuẩn lactic phát triển nhanh, vì vậy có thể dễ dàng phân lập các vi khuẩn lactic trên các môi trường dinh dưỡng chọn lọc.
159 2. Lên men lactic đồng hình Vi khuẩn lactic lên men đồng hình tạo thành toàn bộ hoặc gần như toàn bộ là lactat. Chúng phân giải glucose qua con đường EM, chứa các enzyme cần thiết, kể cả alđolase và chuyển dihydro tách ra trong quá trình loại dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate sang piruvat : Glucose 2 Piruvat 2 NADH 2 NAD 2 Lactat Việc xuất hiện D-, L+ hay DL- lactat là phụ thuộc vào tính chuyên hóa không gian của enzyme vận chuyển lactat-đedihydrogenase và vào sự có mặt của một lactat-racemase. Chỉ một phần nhỏ piruvat được loại cacboxil và chuyển thành acetate, ethanol, CO2 và acetoin. Việc tạo thành các sản phẩm phụ phụ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của oxi. 3. Lên men lactic dị hình Vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con đường EM là alđolase và triosephosphate-isemerase. Đoạn phân giải glucose đầu tiên chỉ xảy ra qua con đường pentosephosphate, tức là qua glucose-6-phosphate, 6-phosphogluconat và ribulose-5-phosphate (hình). Chất này nhờ một epimerase được chuyển thành xilulose-5-phosphate và nhờ phosphoketolase được phân giải trong một phản ứng phụ thuộc taminpirophosphate làm xuất hiện glyceraldehyt-3-phosphate và acetilphosphate. Các tế bào Leuconostoc mesenteroides không sinh trưởng và được rửa sạch đã lên men glucose thành lactat, ethanol và CO2 theo một tỉ lệ gần như tương đương: → CH3 - CHOH - COOH + CH3 - CH2 - OH + CO2 C6H12O6 ở các cơ thể này acetilphosphate bị khử qua acetil-CoA và acetaldehit thành ethanol. Các vi khuẩn lên men dị hình khác chuyển một phần hoặc
160 toàn bộ acetilphosphate thành acetate, trong đó liên kết phosphate giàu năng lượng được chuyển sang ADP và được sử dụng dưới dạng ATP. Dihydro thừa trong trường hợp này được truyền cho glucose làm xuất hiện manit. Glyceraldehyt-3-phosphate được chuyển qua piruvat thành lactat. Ribose được L. mesenteroides lên men thành lactat và acetate. *Lên men lactic dị hình ở Bifidobacterium Vi khuẩn lactic dị hình Bifidobacterium bifidum có dạng chữ V hay chữ Y (bifidus tiếng Hi Lạp có nghĩa là bị chia đôi, bị phân cắt), là thành viên trong khu hệ đường ruột của trẻ sơ sinh, trước hết là các trẻ nuôi bằng sữa mẹ. Vi khuẩn này cần N-acetilglucosemin chỉ có trong sữa người mà không có trong sữa bò. Các đại diện thuộc chi Bifidobacterium là những vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt, không chịu khí và cần một khí quyển chứa CO2 (10% CO2) để sinh trưởng. Bifidobacterium chuyển hóa glucose theo phương trình : → 2 CH3 - CHOH - COOH 2 C6H12O6 + 3 CH3 - COOH Bifidobacterium lên men glucose qua con đường phụ phosphoketolase, không chứa aldolase cũng như glucose-6-phosphat- dehydrogenase, song lại chứa các phosphoketolase hoạt động, phân giải fructose-6-phosphat và xilulose-6-phosphat thành acetilphosphate và eritro-4-phosphate hoặc glixeraldehyt-3-phosphate. Hexose được chuyển hóa theo con đường sau đây :
161 Hình 6.4: Lên men lactic dị hình :1. Glucose-6-phosphat-dehydrogenase 2. Phosphogluconat-dedihydrogenase 3. Epimerase ; 4. Phosphoketolase 4. ứng dụng của lên men lactic Nếu để dung dịch đường không khử trùng chứa cả các nguồn nitơ phức tạp và các chất sinh trưởng một cách tự nhiên trong trong điều kiện kị khí hoặc dưới dạng lớp cao thì các vi khuẩn lactic sẽ nhanh chóng phát triển ở phía bên trong. Chúng làm giảm pH xuống dưới 5 và qua đó ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn kị khí khác là bọn không có khả năng sinh trưởng ở độ chua này. Trong các môi trường làm giàu này nhóm vi khuẩn nào phát triển được là tuỳ thuộc vào các điều kiện đặc biệt. Nhờ đặc tính bảo quản và khử trùng dựa trên nguyên tắc acid hóa mà các vi khuẩn lactic
162 được sử dụng, trong nông nghiệp, trong nội trợ, trong ngành sản xuất và chế biến sữa. 4.1.Thức ăn ủ chua. Vi khuẩn lactic phân bố trên các nguyên liệu thực vật giữ một vai trò to lớn trong việc bảo quản thức ăn gia súc. Để tạo điều kiện cho lên men lactic xảy ra, lá các loại cây lấy củ hoặc cỏ ... được nén chặt trong các hầm ủ, thêm rỉ đường để nâng cao tỉ lệ C/N và tạo độ chua ban đầu bằng cách thêm acid formic hay acid vô cơ. 4.2.Dưa là một sản phẩm của quá trình lên men lactic. Bắp cải được cắt nhỏ, trộn và bóp với muối ăn 2-3%. Trong điều kiện yếm khí, lên men lactic sẽ xảy ra một cách tự nhiên, lúc đầu bởi Leuconostoc - với sự tạo thành CO2, và về sau có sự tham gia của Lactobacillus plantarum. 4.3.Các sản phẩm sữa. Sữa có một thành phần dinh dưỡng cao, chứa nhiều nước và giàu các muối khoáng, protein (chủ yếu là cazein), mỡ bơ, đường (đặc biệt là lactose) và các vitamin. Ở trong bầu vú của động vật thì nó là vô trùng, nhưng khi đi ra khỏi núm vú thì sữa bị nhiễm bởi khu hệ bình thường của động vật, sau đó được bổ sung thêm bởi các vi sinh vật khác từ người vắt sữa, máy hoặc bình chứa. Là một môi trường gần như hoàn hảo nên sữa rất mẫn cảm với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Khi để sữa ở trong phòng nhiều loại vi khuẩn sẽ lên men lactose tạo thành acid và làm thay đổi tính chất và kiến trúc của sữa. Quá trình này có thể xảy ra tự nhiên hoặc được con người bắt chước như trong qnầ trình sản xuất phomat hoặc iagua. Trong các giai đoạn sớm của lên men sữa lactose bị tấn công nhanh bởi Streptococcus lactis và Lactobacillus spp. Sự tiết acid lactic và sự giảm pH làm protein của sữa bị đông lại thành cục vón (curd). Sự đông cũng làm tách riêng phần dịch đường sữa (whey) ở trên bề mặt. Cục vón cũng có thể được tạo nên nhờ tác dụng của vi sinh vật hoặc nhờ một enzyme (rennin) lấy từ dạ dày bê. Một lít sữa nặng 1032g bao gồm 902g nước và 130g chất khô trong đó chứa 49g lactose; 39g chất béo (là những giọt mỡ đường kính 1-8 μm gồm glixerit và các chất tan trong lipit, như colesterol và các vitamin A, D, E, K; 32,7g protein mà chủ yếu là cazein; 9g chất khoáng (gồm phosphate, xitrat, KCl, NaCl và MgCl2). *Sữa chua (sữa bơ). Sữa chua là sản phẩm của sự lên men sữa lỏng bằng sự để chua ngẫu nhiên dưới tác động của nhiều vi khuẩn sinh acid
163 lactic khác nhau (như Streptococcus lactis hay S. cremoris), hoặc của một số lượng ít hơn nhiều các vi khuẩn gây thơm (như Streptococcus diacetylacis, Betacoccus citrovorus) hoặc bằng việc cấy vào sữa đã đun nóng các giống vi khuẩn thuần khiết. Khi lên men diễn ra, lactose được chuyển hoá thành acid lactic, acid này sẽ ngưng kết cazein ở pH 4-5. Sữa đông, đặc, có vị chua, tùy theo vùng có tên gọi khác nhau. Sữa chua được làm từ sữa đầy đủ (chứa ít nhất 3% mỡ của sữa) thường được trộn với bột sữa đã vớt váng nhằm làm tăng hàm lượng chất rắn toàn phần và cải thiện cấu trúc gel protein. ở một số nước, sữa chua cũng được sản xuất từ sữa cừu, sữa trâu, sữa tuần lộc hoặc sữa ngựa. Kem chua được sản xuất bởi một quá trình rất giống quy trình dùng để sản xuất sữa chua chỉ trừ việc kem cà phê đã được sử dụng làm nguyên liệu thô. *Iagua. Iagua được làm từ các loại sữa chứa các hàm lượng mỡ khác nhau bằng cách lên men nhờ các giống đặc biệt. Nó có một độ đông đặc mịn giống như gel, một độ chua rõ rệt và hương vị dễ chịu, khác biệt rõ ràng với loại sữa chua bình thường. Iagua được sản xuất bằng cách cấy vào sữa đã khử trùng Pasteur đồng nhất khoảng 1,5-3% các vi khuẩn lactic ưa nhiệt (giống hỗn hợp của một hoặc nhiều chủng như Streptococcus thermophilus hay Lactobacillus bulgaricus) và sau đó giữ ở 42-45oC trong khoảng 3 giờ. Độ quánh mịn được hình thành trong thời gian này. Sản phẩm cuối cùng có vị chua (độ chua 40-60oSH). Phần quan trọng trong hương thơm đặc biệt của iagua là các hợp chất cacbonyl với đixetyl và acetaldehit chiếm ưu thế. Một loại igua đặc biệt có tên là sữa aciđophilus được sản xuất nhờ Lactobacillus acidophilú. Việc thêm đường và hoa quả vào iagua (iagua hoa quả) làm tăng đáng kể sức tiêu thụ sản phẩm này. *Kefia và Kumis. Kefia và Kumis là các loại đồ uống chứa rượu giàu CO2, nhiều bọt. Khu hệ vi sinh vật bao gồm nấm men Torula (chịu trách nhiệm đối với quá trình lên men rượu) và các vi khuẩn Streptococcus lactis và Lactobacillus caucaticus (chịu trách nhiệm đối với lên men lactic). Các hạt kefia dùng để sản xuất kefia chứa các cục sữa đông cộng với các vi khuẩn kefia. Kumis được làm từ sữa ngựa hay sữa dê do các giống kumis thuần khiết (Thermobacterrium bulgaricus và nấm men Candida) . Cả hai đồ uống làm từ sữa này đều là các sản phẩm địa phương của vùng Caucasus và các vùng thảo nguyên Turkestan. Kefia chứa acid lactic (0,5- 1%), một số lượng rượu đáng kể (0,5-2%), CO2 và một số sản phẩm phân giải cazein sinh ra từ hoạt động phân giải protein của nấm men. *Phomat. Phomat là sản phẩm thu được từ sữa đông bằng cách loại bỏ dịch đường sữa và bằng cách làm chín cục vón khi có mặt một khu hệ
164 vi sinh vật đặc biệt. Có nhiều loại phomat với hình dạng và kích thước khác nhau. được xếp thành nhóm dựa vào loại sữa sử dụng (bò, dê, cừu), sự tạo thành cục vón (dùng acid, dùng rennin hay dùng cả hai), kiến trúc hay độ đặc, và hàm lượng chất béo. Trong từng nhóm, các loại phomat riêng biệt được đặc trưng bởi hương thơm. Sự sản xuất phomat về cơ bản bao gồm hai công đoạn : sự tạo thành cục vón và quá trình làm chín. *Sự tạo thành cục vón Hàm lượng chất béo của sữa được điều chỉnh tới mức độ mong mnốn, và khi cần, hàm lượng protein cũng được điều chỉnh. Các chất phụ gia bao gồm muối canxi nhằm cải thiện sự ngưng kết protein và kiến trúc của phomat, nitrat để kìm hãm khu hệ vi khuẩn kị khí hình thành bào tử và các sắc tố tạo màu. Sữa thô hoặc sữa đã khử trùng được trộn trong một bể ở nhiệt độ 15-59oC với một loại giống khởi động (vi khuẩn lactic hay vi khuẩn propionic, nấm sợi, như Penicillium camemberti, P. candidum, P. roqueforti , các vi khuẩn mang sắc tố màu vàng hoặc màu đỏ như Bacterium linens, cùng các cầu khuẩn và nấm men) và sữa sẽ đông lại thành một khối bán lỏng mềm, cụcvón, sau lên men lactic, được nối tiếp bằng sự bổ sung rennin hoặc một tổ hợp nào đó mà thông thường nhất là tổ hợp giữa acid và rennin. Gel protein này sẽ được cắt thành các hình khối nhỏ trong lúc đang được đun nóng rồi sau đó được khuấy nhẹ. Dịch đường sữa được loại bỏ còn phần cục vón chứa mỡ thì được chuyển sang quá trình làm rắn. Khi độ rắn mong muốn đã đạt được, cục vón được chuyển sang quá trình làm chín. *Làm chín Quá trình làm chín phụ thuộc vào thành phần khối phomat, đặc biệt là hàm lượng nước, khu hệ vi sinh vật và các điều kiện bên ngoài như nhiệt độ và độ ẩm của các phòng làm chín. Sự chín của phomat mềm xảy ra từ ngoài vào trong, vì thế trong giai đoạn đầu sẽ có một phần vỏ chín và một phần lõi chưa chín. Sự chín không đồng đều xảy ra là do có sự chênh lệch về pH. ở bên trong khối phomat, pH thấp vì có mặt acid lactic. ở ngoài vỏ, các loài nấm sợi đặc trưng phát triển thích hợp hơn ở các pH cao đã nâng pH lên nhờ phản ứng loại CO2 từ các amino acid. Sự chín ở phomat cứng xảy ra đồng đều trên toàn bộ khối phomat. Sự tạo thành vỏ chỉ là kết quả của sự khô bề mặt, điều này có thể tránh được nhờ việc bao gói khối phomat trong các màng plastic thích hợp trước khi quá trình làm chín bắt đầu. Thời gian làm chín thay đổi tùy trường hợp, kéo dài từ vài ngày đối với phomat mềm tới vài tháng thậm chí vài
165 năm đối với các loại phomat cứng. Sản lượng trên 100 kg sữa nước là 8 kg phomat cứng và tới 12 kg phomat mềm. Mọi thành phần của phomat đều chịu sự biến đổi về mặt sinh hoá học ở các mức độ khác nhau trong quá trình làm chín. Lactose được phân giải thành acid lactic nhờ lên men lactic đồng hình. Trong loại phomat cheđa chẳng hạn, pH giảm từ 6,55 xuống 5,15 tính từ lúc bổ sung giống khởi động cho tới khi đúc thành khuôn. Khi có mặt vi khuẩn propionic (như trong trường hợp của phomat Emmental), acid lactic được chuyển hóa tiếp tục thành acid propionic, acid acetic, và CO2 theo phản ứng : 3 CH3CHOHCOOH → 2 CH3CH2COOH + CH3COOH + CO2 + H2O Tỉ lệ giữa acid propionic và acid acetic bị ảnh hưởng bởi thế oxi hóa khử của phomat và tỉ lệ này sẽ thấp khi có mặt muối nitrat chăng hạn. Phương thức và mức độ phân giải mỡ của sữa phụ thuộc vào khu hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình làm chín phomat. Sự giải phóng các acid béo, đặc biệt là các acid ảnh hương đến hương thơm của phomat phụ thuộc vào tính đặc hiệu của các lipase. Ngoài các acid béo tự do, 2-alkanon và 2-alkanol cũng được tạo thành như các sản phẩm phụ của sự β-oxi hoá các acid béo. Nấm sợi, đặc biệt là Penicillium roqueorti, sử dụng β-ketoaxyl-CoA đeaxylase (tiodihydroase) và β-ketoacid đecacboxylase để cung cấp các hợp chất điển hình cho hương thơm của các phomat bán mềm. Sự phân giải protein thành các amino acid xảy ra qua các peptit như ìà các sản phẩm trung gian. Tùy thuộc vào loại sữa mà 20-40% cazein được chuyển hoá thành các dẫn xuất protein hòa tan trong đó 5-15% là các acid amin. Phạm vi pH 3-6 là tối ưu đối với hoạt tính proteinase của Penicillium roqueorti. Sự phân giải protein bị ảnh hưởng mạnh bởi hàm lượng muối chứa trong phomat. Hàm lượng amino acid là 2,6-9% phần chất rắn của phomat và là phần quan trọng trong hương thơm của phomat. Những lỗi trong quá trình làm chín có thể tạo nên những peptit có vị đắng. Các amino acid được chuyển hóa tiếp tục. Trong giai đoạn sớm của sự làm chín, với pH thấp, chúng bị loại CO2 thành các amino. Trong giai đoạn muộn, với pH cao, các phản ứng oxi hoá chiếm ưu thế. Sự phân giải protein không chỉ đóng góp vào sự tạo thành hương thơm, nó còn ảnh hưởng đến kiến trúc của phomat. Khi phomat mềm bị làm chín quá mức, sự phân giải protein có thể dẫn đến việc dịch hóa gần như toàn bộ khối phomat.
166 Câu hỏi ôn tập chương 8 1. Trong tế bào, quá trình đường phân diễn ra ở đâu ? Phản ứng này khác nhau như thế nào khi không có mặt oxy và khi có mặt oxy ? 2. Phân tử nào mở đầu con đường đường phân ? Khi đường phân hoàn thành, phân tử nào còn lại. Bao nhiêu ATP được tạo thành ở mức độ phosphoril hóa cơ chất ? Con số ATP được tạo thành là bao nhiêu, và vì sao con số này lại khác với tổng số ATP được tạo thành ? Bao nhiêu ATP sẽ được tạo thành bổ sung nếu oxy có mặt ? 3. Khi nguông glucose là không hạn chế thì cái gì sẽ là nhân tố giới hạn trong phản ứng đường phân ? 4. Hai cơ chế tái tạo NAD+ là những cơ chế nào ? Chúng khác nhau ở chỗ nào ? Đâu là một quá trình hiếu khí và đâu là một quá trình kị khí ? 5. Lên men khác hô hấp oxy hóa chỗ nào khi xét về phương diện các chất nhận điện tử và sự sản sinh năng lượng ? 6. Sự trao đổi điện tử để tạo nên ATP khác nhau như thế nào trong các trường hợp NADH được tạo thành trong đường phân, NADH được tạo thành trong chu trình acid citric, và FADH2 được tạo thành trong chu trình acid citric ? 7. Hiệu quả của việc phân giải hiếu khí hoàn toàn một phân tử glucose ở vi khuẩn là bao nhiêu ? So sánh với hiệu quả của một mình đường phân? 8. Hiệu ứng Pasteur có gặp ở các vi khuẩn lên men lactic đồng hình không ? Vì sao ? 9. Giải thích tại sao ở một số nấm men, như Rhodotorula hay Geotrichum, khi thừa nguồn C, đồng thời thiếu N và P thì lipit lại được tích lũy ? 10. Cho ví dụ về những trường hợp lên men ở vi khuẩn trong đó có sự tạo thành nhiều hơn 2 mol ATP trên một mol glucose bị phân hủy.
144 Chương 8 Các quá trình lên men I. Con đường Embden-Meyerhof (EM) : Bước chuyển hóa chung cho các quá trình lên men Lên men là một quá trình oxi hóa-khử cân bằng nội sinh, trong đó một số nguyên tử của nguồn năng lượng (chất cho điện tử) trở nên có tính khử hơn, trong khi một số nguyên tử khác trở nên oxi hóa hơn, còn năng lượng thì được sinh ra nhờ sự phosphorin hóa cơ chất. Con đường trao đồi chất chung đối với sự lên men glucose là con đường đường phân, cũng còn được gọi là con đường Embden-Meyerhof. Đường phân được chia thành ba bước chính, mỗi bước gồm một số phản ứng riêng biệt do enzyme xúc tác. Bước một gồm các phản ứng chuẩn bị, không có các phản ứng oxi hóa và cũng không giải phóng năng lượng, song lại dẫn đến việc tạo ra hai phân tử trung gian quan trọng, glixeraldehit-3-phosphate (GAP). Trong bước hai, sự oxi hóa-khử xảy ra, năng lượng được dự trữ dưới dạng ATP và hai phân tử piruvat được tạo thành. Trong bước ba, một phản ứng oxi hóa-khử thứ hai xảy ra và các sản phẩm lên men (chẳng hạn ethanol và CO2, hoặc acid lactic), sẽ được tạo thành. Trong sự tạo thành hai phân tử acid 1,3 điphosphoglixeric có hai phân tử NAD+ bị khử thành NADH. Tuy nhiên, một tế bào chỉ chứa một lượng nhỏ NAD+, và nếu như toàn bộ NAD+ bị chuyển thành NADH thì phản ứng oxi hóa glucose sẽ bị đình chỉ; sự oxi hóa tiếp tục chỉ có thể xảy ra khi một phân tử NAD+ có mặt để tiếp nhận các điện tử vừa được giải phóng ra. Sự "tắc đường" này có thể được khắc phục trong lên men bằng cách oxi hóa NADH trở lại thành NAD+ nhờ các phản ứng khử piruvat thành một trong hàng loạt các sản phẳm lên men khác nhau. Trong trường hợp của nấm men, piruvat bị khử thành ethanol với sự giải phóng CO2. ở các vi khuẩn lactic, piruvat bị khử thành acid lactic. Nhiều con đường khử piruvat cũng gặp ở các vi sinh vật nhân sơ khác, song kết quả thật sự đều giống nhau, tức là NADH phải được hồi phục lại thành dạng oxi hóa, NAD+, để cho các phản ứng thu nhận năng lượng của lên men có thể tiếp tục. Là một coenzyme dễ khuếch tán, NADH có thể tách khỏi GAP-dedihydrogenase, gắn vào một enzyme khác, (chẳng hạn lactat-dedihydrogenase, enzyme khử piruvat thành acid lactic), rồi lại lập tức khuếch tán trở lại sau khi NADH đã được oxi hóa thành NAD+ để lặp lại chu trình một lần nữa.
145 Trong bất kỳ một phản ứng thu năng lượng nào, sự oxi hóa bao giờ cũng phải được cân bằng với sự khử và phải có một chất nhận nào đó đứng chờ sẵn để nhận một điện tử vừa được tách ra. Trong trường hợp này, sự khử NAD+ tại một bước trong con đường đường phân sẽ được cân bằng bởi sự oxi hóa nó tại một bước khác. (Các) sản phẫm cuối cùng cũng phải nằm trong trạng thái cân bằng oxi hóa-khử với cơ chất ban đầu, tức là glucose. Bảng 6.1: Các quá trình lên men phổ biến ở vi sinh vật Kiểu lên men Phản ứng tổng thể Vi sinh vật thực hiện Hexose → 2 Ethanol + 2 CO2 Lên men rượu Nấm men Zymomonas Hexose → 2 Lactat + 2 H+ Lên men lactic Streptococcus đồng hình Một số Lactobacillus Hexose → Lactat + Ethanol + Lên men lactic dị Leuconostoc CO2 + H+ hình Một số Lactobacillus Lactat → Propionat + Acetate Acid propionic Propionibacterium Clostridium propionicum + CO2 Hexose → Ethanol + 2,3- Acid hỗn hợp Các vi khuẩn đường ruột Escherichia, Salmonella, Butandiol + Xucxinat + Lactat Shigella, Klebsiella, + Acetate + Focmat + H2 + Enterobacter CO2 Hexose → Butirat + Acetate + Acid butiric Clostridium butyricum H2 + CO2 Hexose → Butanol + Acetate Butanol Clostridium acetobutylicum + Aceton + Ethanol + H2 + CO2 Ethanol + Acetate + CO2 → Caproat Clostridium kluyveri Caproat + Butirat + H2 Fructose → 3 Acetate + 3 H+ Homoacetic Clostridium aceticum Acetobacterium 4 H2+ 2 CO2 + H+ → Acetate + 2 H2O Acetate + H2O → CH4 + Sinh methane Methanothrix Methanosarcina − HCO 3 II. Tính đa dạng của lên men Bảng 6.1 trình bày một số kiểu lên men chính được phân loại dựa trên các sản phẩm được tạo thành. Đó là các quá trình lên men rượu, acid lactic, acid propionic, acid hỗn hợp, acid butiric và acid homoacetic. Có nhiều quá trình lên men được phân loại dựa trên cơ chất được lên men
146 thay vì các sản phẩm. Chẳng hạn, nhiều vi khuẩn kị khí tạo thành bào tử (chi Clostridium) lên men các amino acidvới sự sản sinh acetate, amoniac và H2. Các loài Clostridium khác, như C. acidiurici và C. purinolyticum lên men các purin như xantin hoặc ađenin với sự tạo thành acetate, focmat, CO2, và amoniac. Còn những bọn kị khí khác thì lên men các hợp chất thơm. Chẳng hạn, vi khuẩn Pelobacter acidigallici lên men hợp chất thơm phloroglucinol (1,3,5-benzenetriol, C6H6O3) theo con đường sau : Phloroglucinol (C6H6O3) +3 H2O → 3 acetate- + 3H+, ΔGo' = -142,5 kJ/phản ứng Nhiều quá trình lên men không thông thường chỉ được thực hiện bởi một nhóm rất hạn chế các vi khuẩn kị khí, và trong một sồ trường hợp chỉ bởi một vi khuẩn duy nhất. Một số ví dụ được nêu trên bảng 6.2. Nhiều trong số các vi khuẩn này có thể được xem như các chuyên gia về trao đổi chất vì chúng có khả năng phân giải một hoặc nhiều cơ chất mà các vi khuẩn khác không phân giải được. Bảng 6. 2: Một số quá trình lên men không thông thường Kiểu lên men Phản ứng cân bằng Vi sinh vật thực hiện tổng thể 2 C2H2 + 3 H2O → Ethanol + Pelobacter acetylenicus Acetylen Acetate + H+ Glycerin Acetobacterium spp. − 4 Glycerin + 2 HCO 3 → + 7 Acetate + 5 H + 4 H2O 2 C6H4(OH)2 + 6 H2O → 4 Clostridium spp. Resocxinol (một hợp chất Acetate + Butirat + 5 H+ thơm) Xinamat (một 2C9H7O2 + 2 H2O → C9H9O2 + Acetovibrio multivorans hợp chất thơm) Benseat + Acetate + H+ C6H6O3 + 3 H2O → Phlorogluxinol Pelobacter masiliensis (một hợp chất 3 Acetate + 3 H+ Pelobacter acidigallici thơm) 10 C4H12N2 + 26 H2O → 6 Các vi khuẩn kị khí gram Putresxin Acetate + 7 Butirat + 20 NH4+ + dương không sinh bào tử, 16 H2 + 13 H+ chưa phân loại Xitrat + 2 H2O → Focmat + 2 Bacteroides sp. Xitrat − Acetate + HCO 3 + H+ Aconitat + H++ 2 H2O → 2 CO2 Acidaminococcus Aconitat fermentans + 2 Acetate + H2 + 4 Glioxilat +3 H + 3 H2O → 6 Vi khuẩn gram âm chưa Glioxilat
147 CO2 + 5 H2 + Glicolat phân loại Xucxinat + H2O → Propionat + Propionigenium Xucxinat modestum − HCO 3 Oxalat + H2O → Focmat + Oxalobacter formigenes Oxalat − HCO 3 Malonat + H2O → Acetate + Malonomonas rubra Malonat Sporomusa malonica − HCO 3 III. Lên men không có sự phosphorin hóa cơ chất Với một số cơ chất, năng lượng sinh ra không đủ để ghép đôi với sự tổng hợp ATP trực tiếp nhờ phosphorin hóa cơ chất, tuy nhiên các hợp chất này vẫn trợ giúp sinh trưởng lên men của một cơ thể nào đó. Trong những trường hợp này sự phân giải cơ chất được gắn liền với những bơm ion được dùng để tạo nên một građien proton hoặc natri qua màng. Ví dụ về kiểu này có các quá trình lên men của Propionigenium modestum hoặc Oxalobacter formigenes, cả hai đều gắn sự lên men các acid đicacboxilic với các bơm ion sinh năng lượng liên kết với màng. Propionigenium modestum thực hiện phản ứng sau đây : Xucxinat2- + H2O → Propionat- + HCO3- , ΔGo' = -20,5 kJ/phản ứng Phương trình tổng thể này thu không đủ năng lượng tự do để ghép đôi với sự tổng hợp ATP trực tiếp nhờ phosphorin hóa cơ chất, tuy nhiên nó lại được dùng làm phản ứng thu năng lượng duy nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn. Sở dĩ như vậy là vì sự loại CO2 khỏi xucxinat
148 Hình 6.1: Lên men liên kết với bơm ion ở vi khuẩn (năng lượng thu được không qua phosphorin hóa cơ chất) (qua metilmalonil-CoA và đecacboxilase liên kết với màng bởi Propionigenium modestum đã được ghép đôi với sự xuất Na+ qua màng tế bào chất. Một ATPse chuyển vị Na+ nằm trên màng của P. modestum sử dụng građien này để hoạt hóa sự tổng hợp ATP. Oxalobacter formigenes thực hiện sự lên men oxalat : Oxalat2- + H2O → Focmat- + HCO3- , ΔGo' = -26,7 kJ/phản ứng ở pH trung tính, oxalat tồn tại dưới dạng ion hóa oxalat-, và sự loại cacboxil thành focmat- tiêu thụ một proton. Sau đó sự xuất focmat- khỏi tế bào sẽ tạo nên một động lực nhờ proton (proton motive force = PMF) có khả năng ghép đôi với sự tổng hợp ATP nhờ một ATPase chuyển vị proton nằm trên màng.
149 Điều thú vị và độc đáo trong trao đỗi chất của cả Propionigenium modestum lẫn Oxalobacter formigenes nằm ở chỗ sự tổng hợp ATP xảy ra không cần cả phosphoril hóa cơ chất lẫn chuỗi vận chuyển điện tử; tuy nhiên, sự tạo thành ATP theo cơ chế hóa thẩm vẫn xảy ra dựa vào một bơm Na+/H+ kết hợp với sự loại CO2 khỏi các acid hữu cơ. Điều cần rút ra từ những sự lên men này là : các phản ứng, dù chỉ thu được dưới 31,8 kJ, con số cần thiết để tạo thành một ATP, hoặc không có khả năng ghép đôi với sự phosphorin hóa cơ chất, cũng không thể lập tức bị coi là không có khả năng trợ giúp sinh trưởng cho một vi khuẩn. Nếu như phản ứng có thể ghép đôi được với một građien ion thì sự sản sinh ATP vẫn có khả năng xảy ra và do vậy vẫn có sinh trưởng (Hình 6.1). IV. Hiện tượng cộng dưỡng (syntrophy) Trong vi sinh vật học có nhiều ví dụ về hiện tượng cộng dưỡng, một hiện tượng mà hai sinh vật khác nhau có thể cùng nhau phân giải một chất nào đó - và bảo toàn năng lượng của quá trình phân giải đến mức không cơ thể nào trong hai cơ thể đó một mình có thể làm được. Trong đa số trường hợp, bản chất của một phản ứng cộng dưỡng có liên quan tới khí dihydro (H2) sinh ra bởi một trong hai đối tác và được tiêu thụ bởi đối tác kia. Do vậy, cho đến nay, cộng dưỡng cũng còn được gọi là sự chuyển H2 liên loài. Kẻ tiêu thụ H2 có thể là bất kỳ một cơ thể nào trong số các vi khuẩn khử sunfat, lên men homoacetate, và vi khuẩn sinh methane. Hãy xem xét trường hợp cộng dưỡng liên quan tới quá trình lên men ethanol thành acetate và sự sản sinh methane sau đó. Như có thể thấy trên hình 2, bọn lên men ethanol thực hiện một phản ứng không thuận lợi về mặt năng lượng tự do (ΔGo' dương). Tuy nhiên, H2 được sinh ra bởi đối tác lên men rượu lại là một chất cho điện tử đầy giá trị đối với quá trình hình thành methane do một vi khuẩn sinh methane thực hiện. Và khi cộng hai phản ứng lại thì phản ứng tổng thể sẽ là một phản ứng toả nhiệt và có thể trợ giúp sinh trưởng của cả hai đối tác trong hỗn hợp cộng dưỡng. Lên men ethanol 2CH3CH2OH + 2H2O → 4H2 + 2CH3COO- +2H+ +19,4 kJ /phản ứng Sinh methane → CH4 + 2H2O 4H2+ CO2 - 130,7 kJ/phản ứng Phản ứng cộng dưỡng - → CH4 + 2CH3COO 2CH3CH2OH + CO2 - 111,3 kJ/phản ứng
150 Một ví dụ khác của hiện tượng cộng dưỡng là sự oxi hóa butirat thành acetate cộng với H2 bởi vi khuẩn cộng dưỡng oxi hóa acid béo Syntrophomonas: Butirat- + 2H2O → 2acetate- + H+ + 2H2 , ΔGo' = +48,2 kJ/phản ứng Sự biến đổi năng lượng tự do của phản ứng này rất không thuận lợi và trong ống giống thuần khiết, Syntrophomonas không thể mọc được trên butirat. Song nếu H2 vừa sinh ra trong phản ứng được tiêu thụ ngay bởi một cơ thể đối tác (như một vi khuẩn sinh methane) thì Syntrophomonas lại sinh trưởng rất tốt trong ống giống cấy chung với bọn tiêu thụ H2. V. Lên men rượu nhờ nấm men và vi khuẩn Ethanol là một trong số các sản phẩm lên men phổ biến nhất gặp ở vi sinh vật. Bản thân thực vật và nhiều loài nấm cũng tích lũy ethanol dưới các điều kiện kị khí. Vi sinh vật sản sinh ethanol chủ yếu là nấm men, đặc biệt là các chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae. Giống như đa số nấm, nấm men là những cơ thể hô hấp hiếu khí, nhưng khi vắng mặt không khí chúng sẽ lên men hiđrat cacbon thành ethanol và CO2. Nhiều vi khuẩn kị khí và hiếu khí cũng tạo thành ethanol như các sản phẩm chính hoặc sản phẩm phụ khi lên men các hexose hoặc pentose. 1. Sự tạo thành ethanol nhờ nấm men Sự lên men glucose thành ethanol và CO2 nhờ Saccharomyces cerevisiae diễn ra theo con đường Embden-Meyerhof. Sự chuyển hóa piruvat thành ethanol gồm hai bước. Trong bước một, piruvat được loại CO2 thành acetaldehit nhờ piruvat-đecacboxilase với sự tham gia của tiaminpirophosphate. Trong bước sau, acetaldehit bị khử thành ethanol nhờ alcohol-đedihydrogenase chứa NADH. Glucose 2 Piruvat 2CO2 2NADH 2NAD 2 Acetaldehyt 2Ethanol
151 Bằng sự chuyền H này, dihydro tách ra do triosephosphate- dehydrogenase xúc tác sẽ được tiêu thụ, nhờ vậy trạng thái oxi hóa-khử sẽ được cân bằng. 2. Các dạng phương trình Neuberg Các phương pháp và phát hiện của Carl Neuberg về lên men rượu không chỉ có ý nghĩa lịch sử. Ông đã khám phá ra rằng, không chỉ glucose mà cả piruvat cũng được nấm men lên men và acetaldehit xuất hiện như một sản phẩm trung gian có thể bị bắt giữ bởi dihydrosulfit. Dihydrosulfit vốn không độc đối với nấm men. Nếu bổ sung dihydrosulfit vào một môi trường chứa glucose đang được nấm men lên men thì acetaldehit sẽ bị kết tủa do tạo thành phức chất : + NaHSO3 → CH3- CHOH -SO3Na CH3-CHO Lúc đó glycerin sẽ xuất hiện như một sản phẩm lên men mới, đồng thời hiệu suất ethanol và CO2 sẽ giảm xuống. Lên men với sự có mặt của dihydrosulfit đã được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất glycerin. Nguyên lý của nó là, acetaldehit bị bắt giữ, và do vậy không thể hoạt động như một chất nhận điện tử được nữa. Lúc này, thay cho acetaldehit, dihydroxiacetonphosphate được sử dụng làm chất nhận điện tử và bị khử thành glycerin-3-phosphate rồi tiếp tục bị loại phosphate để trở thành glycerin. Phương trình phản ứng diễn ra như sau : Glucose + Dihydrosulfit → Glycerin + Acetaldehit-sulfit + CO2 Phương trình lên men cải biến này được gọi là dạng lên men Neuberg 2. Khi bổ sung các chất kiềm (NaHCO3, Na2HPO4) thì glycerin cũng được tạo thành vì acetaldehit bị chuyển thành ethanol và acetate qua phản ứng hóa hai, và do vậy không còn hoàn thành được chức năng của một chất nhận điện tử. Phương trình lên men có tên là dạng lên men Neuberg 3 và được viết như sau : Glucose + 2H2O → Ethanol + Acetate + 2Glycerin + 2CO2 Dạng lên men thông thường được Neuberg gọi là dạng lên men 1.
152 3. Hiệu ứng Pasteur Hiệu ứng Pasteur là sự ức chế lên men rượu (hay quá trình đường phân) bởi oxi (tức là bởi hô hấp hiếu khí). Sự chuyển sang hô hấp không những làm giảm sự tạo thành ethanol và CO2 mà còn làm giảm sự hấp thụ đường. Có hai cơ chế chịu trách nhiệm đối với hiện tượng này. Một mặt, đó là sự cạnh tranh ADP và phosphate vô cơ giữa hai quá trình phosphorin chuỗi hô hấp và phosphorin hóa cơ chất. Sự loại dihydro xảy ra trong phản ứng oxi hóa glyceraldehyt-3-phosphate cần ADP và phosphate vô cơ (Pvc) : → 3-phosphoglicerate + Glyceraldehyt-3-phosphate + NAD + Pvc H NAD + ATP Do vậy, sự chuyển hóa cơ chất (glucose) qua con đường EM phụ thuộc vào sự có mặt của ADP và phosphate. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sự phosphorin hóa chuỗi hô hấp cũng cạnh tranh ADP và phosphate để phát sinh ATP. Lúc đó nồng độ nội bào của ADP và phosphate giảm, và hậu quả là, sự chuyển hóa glucose và do vậy, sự tạo thành ethanol cũng sẽ giảm. Khi dùng đinitrophenol (DNP) để làm bất hoạt phosphorin hóa chuỗi hô hấp, ADP và phosphate lại trở nên có sẵn đối với phản ứng loại dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate, bởi vậy người ta thấy ngay trong điều kiện thóang khí, sự tiêu thụ glucose (cho lên men) vẫn tăng. Cơ chế thứ hai chịu trách nhiệm đối với hiệu ứng Pasteur là cơ chế điều hoà bằng enzyme dị lập thể. Hình 3 tóm tắt những quan hệ điều hòa chủ chốt trong hiệu ứng này. Trong điều kiện thoáng khí, sự lên men rượu chỉ tạo thành một vài ATP tính trên mỗi phân tử glucose. Để duy trì sự cung cấp năng lượng, tế bào phải sử dụng nhiều glucose. Tỉ lệ của ATP/AMP trong trường hợp này rất thấp. Trái lại, khi oxi xâm nhập vào môi trường, ATP được tạo thêm rất nhiều nhờ sự quá trình phosphorin hóa chuỗi hô hấp. Enzyme chìa khóa dị lập thể điều hòa sự sử dụng glucose trong nấm men lên men rượu là phosphofructokinase. Đó là enzyme không thuận nghịch đầu tiên của con đường EM. Nó xúc tác cho sự phosphorin hóa fructose-6-phosphate thành fructose-1,6-điphophat nhờ ATP và bị kìm hãm dị lập thể bởi ATP. Sự kìm hãm theo cơ chế liên kết ngược này làm tăng nồng độ glucose-6-phosphate trong tế bào do tính thuận nghịch của phản ứng enzyme trước đó. Glucose-6-phosphate kìm hãm dị lập thể hexokinase, kìm hãm cả sự hấp thu glucose, do đó làm giảm sự tiêu thụ đường này.
153 Trong khi ATP kìm hãm dị lập thể phosphofructokinase thì AMP lại hoạt hóa nó. Bởi vậy một tỉ lệ ATP/AMP thấp như trong lên men lại kích thích sự hấp thu và sự trao đổi glucose. Hoạt tính của phosphofructokinase cũng bị kìm hãm bởi xitrat. Nhờ chất hiệu ứng âm tính thứ hai này mà tác dụng kìm hãm của ATP được tăng cường, trái lại các ion amôn lại kích thích enzyme này. Sự điều hòa mô tả ở trên có thể được chứng minh dễ dàng khi người ta đo nồng độ nội bào của glucose, glucose-6-phosphate, fructose-6- phosphate, fructose-1,6-diphosphate và các triose-phosphate trước và sau khi chuyển từ điều kiện nuôi kị khí sang điều kiện nuôi hiếu khí. Ngay sau khi được thông khí, nồng độ glucose-6-phosphate và fructose-6-P của tế bào tăng nhanh, còn nồng độ của fructose-1,6-diphosphate và các triose- phosphate lại giảm mạnh. ở đây, phosphofructosekinase hoạt động như một cái van được điều chỉnh bởi các ađenilat cũng như các chất trao đỗi trung gian khác. Nếu van bị đóng, các chất trao đổi nằm phía trên van sẽ bị ứ đọng, còn các chất nằm bên dưới van được tiếp tục chuyển hóa và do vậy, nồng độ giảm đi. Hiệu ứng Pasteur cũng gặp ở vi khuẩn (chẳng hạn, ở E. coli) và ở mô động vật. Nguyên tắc điều hòa là giống nhau, chỉ có những khác biệt về loại chất hiệu ứng. Chẳng hạn, ở E. coli, không phải AMP mà ADP mới là chất hiệu ứng dương. Những cơ chế cơ bản của trao đỗi chất thì rất giống nhau, còn các cơ chế điều hòa thì thường có tính đặc hiệu loài và đặc hiệu chủng. 4.Kỹ thuật sản xuất ethanol nhờ nấm men Các loài nấm men dùng trong sản xuất ethanol là các nấm đơn bào mang nhiều đặc điểm phong phú về sinh trưởng và phát triển. Các loài được quan tâm trước hết trong sản xuất công nghiệp là Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum (carslbergensis), Schizosaccharomyces pombe và Kluyveromyces sp. Ngoài ra, nhiều biến chủng bắt nguồn từ các nấm men này đã được tạo ra nhờ kỹ thuật di truyền. Các tính chất mong muốn của một quá trình sản xuất ethanol công nghiệp phụ thuộc nhiều vào việc lựa chọn chủng vi sinh vật dùng trong lên men. Các chủng này phải có một năng suất sản phẩm cao trên một đơn vị cơ chất được sử dụng, một tốc độ lên men cao, tính chịu cồn cần thiết, khả năng sống sót ở nhiệt độ cao, tính bền trong các điều kiện lên men và tính chịu pH thấp.
154 Khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau phụ thuộc vào loài. Nói chung, các cơ thể này có khả năng sinh trưởng và lên men ethanol có hiệu quả ở các giá trị pH giữa 3,5-6,0 và nhiệt độ từ 28-35oC. Hiện nay người ta quan tâm nhiều đến việc tạo ra các thể đột biến khuyết hô hấp từ nấm men nhờ việc sử dụng các tác nhân hóa học như các thuốc nhuộm hoặc các hợp chất làm biến tính protein. Các biến chủng này chứa ADN ti thể đã bị biến đổi theo hướng ức chế sự tạo ra các enzyme cần thiết cho sự trao đổi chất hiếu khí và do vậy thích hợp với sự tổng hợp rượu. 5. Hiệu suất lên men Nấm men, dưới điều kiện kị khí chuyển hoá glucose thành ethanol trước hết bằng con đường Embden-Meyerhof. Phản ứng thật sứ bao gồm sự tạo thành 2 mol ethanol, 2 mol CO2 và 2 mol ATP trên mỗi mol glucose được lên men. Do vậy, về mặt trọng lượng mỗi gam glucose về lý thuyết có thể tạo ra 0,51 g rượu. Tuy nhiên sản lượng đạt được trong lên men thực tế thường không vượt quá 90-95% con số lý thuyết. Sở dĩ như vậy là vì một phần chất dinh dưỡng đã được sử dụng để tổng hợp sinh khối mới và cho các phản ứng liên quan tới sự duy trì tế bào. Cũng còn có các phản ứng phụ xảy ra (thường dẫn tới Glycerin và sucxinat) tiêu thụ tới 4-5% cơ chất tổng số. Nếu loại trừ được các phản ứng này thì sản lượng ethanol có thể tăng thêm được 2,7%. Một nồng độ nhỏ oxi cần phải được cung cấp cho nấm men lên men vì đây là thành phần cần thiết trong sự sinh tổng hợp các chất béo chưa bão hòa và các lipit. Thông thường oxi được giữ trong dịch lên men ở nồng độ 0,05-0,1 mm Hg tính theo áp suất oxi. Bất cứ nồng độ nào nằm trên giới hạn đó đều sẽ kích thích sinh trưởng, vi phạm đến sự tạo thành ethanol (hiệu ứng Pasteur). Các nhu cầu tương đối của các chất dinh dưỡng được dùng trong sự tổng hợp ethanol tỉ lệ thuận với các thành phần chính của tế bào nấm men. Chúng bao gồm C, O, N, và H. Thấp hơn một chút là P, S, K và Mg dùng để tổng hợp các thành phần thứ yếu. Các muối vô cơ (như Mn, Co, Cu, Zn) và các nhân tố sinh trưởng hữu cơ (acid amin, acid nucleic, và các vitamin) được yêu cấu dưới dạng vết. Nhiều loại nguyên liệu dùng để sản xuất rượu ở quy mô lớn (như rỉ đường mía hay actiso Jerusalem) ngoài hiđrat C còn cung cấp toàn bộ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng của nấm men. Trong một số trường hợp, người ta cũng đưa thêm vào một số chất dinh dưỡng bổ sung như các muối amôn, phosphate K hay nguồn cao ngô rẻ tiền.