Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật ARMS-PCR kết hợp điện di tự động để xác định đa hình gen MTHFR ở bệnh nhân tiền sản giật

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

1
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày việc hoàn thiện kỹ thuật ARMS-PCR kết hợp điện di tự động để xác định đa hình gen MTHFR ở bệnh nhân tiền sản giật; Mô tả một số đa hình gen MTHFR (C677T và A1298C) ở bệnh nhân tiền sản giật.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật ARMS-PCR kết hợp điện di tự động để xác định đa hình gen MTHFR ở bệnh nhân tiền sản giật

vietnam medical journal n01 - MAY - 2019 tôi thấp hơn kết quả của Lâm Tiến Tùng [1] TÀI LIỆU THAM KHẢO nhóm ROPI có tỉ lệ bệnh nhân ngứa là 16,67%, 1. Lâm Tiến Tùng (2016). So sánh hiệu quả vô nhóm BUPI là 13,33%, có thể do trong nghiên cảm và các tác dụng không mong muốn khi gây tê cứu tác giả sử dụng thêm morphin trong hỗn tủy sống bằng liều thấp của bupivacain với ropivacain ở nguồi cao tuổi, Luận văn thạc sỹ y hợp gây tê tủy sống cho bệnh nhân. học, Đại học y Hà Nội. - Các tác dụng không mong muốn khác: 2. F. A. Dar, M. B. Mushtaq and U. M. Khan Trong và sau phẫu thuật, chúng tôi không gặp (2015). Hyperbaric spinal ropivacaine in lower bệnh nhân nào đau lưng, đau đầu, run, tê bì limb and hip surgery: A comparison with chân, dị ứng thuốc tê, ngộ độc thuốc tê… hyperbaric bupivacaine. J Anaesthesiol Clin Pharmacol, 31 (4), 466-470 V. KẾT LUẬN 3. E. Erturk, C. Tutuncu, A. Eroglu et al (2010). Clinical comparison of 12 mg ropivacaine and 8 mg Gây tê tủy sống với các liều thuốc tê ropivacain bupivacaine, both with 20 microg fentanyl, in spinal 5mg, 6mg và 7mg phối hợp với fentanyl đều anaesthesia for major orthopaedic surgery in không ảnh hưởng đến tuần hoàn, hô hấp của geriatric patients. Med Princ Pract, 19 (2), 142-147. bệnh nhân, tỷ lệ tác dụng không mong muốn 4. Y. Y. Lee, W. D. Ngan Kee, K. Muchhal và cộng sự (2005). Randomized double-blind comparison of thấp và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống ropivacaine-fentanyl and bupivacaine-fentanyl for kê giữa ba nhóm. Tỷ lệ gặp các tác dụng không spinal anaesthesia for urological surgery. Acta mong muốn của ba nhóm ROPI 7, ROPI 6 và Anaesthesiol Scand, 49(10), 1477-1482. ROPI 5 tương ứng là: Tụt huyết áp (10% so với 5. D. A. McNamee, A. M. McClelland, S. Scott et al (2002). Spinal anaesthesia: comparison of 6,6% và 0%); nôn, buồn nôn (3,3% so với 3,3% plain ropivacaine 5 mg ml(-1) with bupivacaine 5 và 0%); ngứa (13,3% so với 13,3% và 6,7%). mg ml(-1) for major orthopaedic surgery. Br J Anaesth, 89 (5), 702-706 HOÀN CHỈNH QUY TRÌNH KỸ THUẬT ARMS-PCR KẾT HỢP ĐIỆN DI TỰ ĐỘNG ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN MTHFR Ở BỆNH NHÂN TIỀN SẢN GIẬT Nguyễn Thị Trang*, Vũ Tố Giang* TÓM TẮT 33 WITH PRE-ECLAMPSIA Theo ước tính của WHO và Uniceft, mỗi năm có According to WHO and UNICEF estimates, about khoảng 585.000 phụ nữ tử vong khi sinh liên quan đến 585,000 women die of childbirth in a pregnancy and thai nghén và sinh đẻ, trong đó 90% các ca tử vong childbirth each year, of which 90% of these deaths này xảy ra ở các nước đang phát triển. Đứng thứ hai occur in developing countries. Second among the trong số những nguyên nhân gây tử vong, tiền sản giật causes of death, pre-eclampsia (TSG) is a complex (TSG) là một tình trạng bệnh lý phức tạp thường xảy ra medical condition that usually occurs in the second ở nửa sau của thai kỳ. Đối tượng nghiên cứu gồm 50 half of a pregnancy. Subjects of the study include 50 mẫu ADN của bệnh nhân tiền sản giật và 50 mẫu ADN DNA samples of pre-eclampsia patients and 50 DNA của thai phụ bình thường được sử dụng để hoàn chỉnh samples of normal pregnant women used to complete quy trình và xác định đa hình gen C677T và đa hình the process and identify polymorphism of C677T gene A1298C gen MTHFR. Sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR để and A1298C MTHFR gene polymorphism. Use ARMS- xác định các đa hình gen. Nghiên cứu thu được tỉ lệ PCR technique to identify gene polymorphisms. The phát hiện đa hình MTHFR C677T ở nhóm bệnh nhân là study obtained the rate of detection of MTHFR C677T 54% và đa hình MTHFR A1298C là 60%. polymorphism in patients group of 54% and MTHFR Từ khóa: MTHFR, tiền sản giật, đa hình, ARMS-PCR A1298C polymorphism was 60%. Keywords: MTHFR, pre-eclampsia, polymorphism, SUMMARY ARMS-PCR. COMPLETE THE ARMS-PCR TECHNICAL I. ĐẶT VẤN ĐỀ PROTOCOL FOR USE TO DETERMINE Theo ước tính của WHO và Uniceft, mỗi năm MTHFRGEN POLYMORPHISM IN PATIENTS có khoảng 585.000 phụ nữ tử vong khi sinh liên quan đến thai nghén và sinh đẻ, trong đó 90% *Trường Đại học Y Hà Nội các ca tử vong này xảy ra ở các nước đang phát Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Trang triển [1]. Theo thống kê của WHO, các nguyên Email: trangnguyen@hmu.edu.vn nhân chính gây tử vong là băng huyết (41%), Ngày nhận bài: 2.3.2019 tiền sản giật (21,3%), nhiễm khuẩn (18,8%)[1]. Ngày phản biện khoa học: 16.4.2019 Đứng thứ hai trong số những nguyên nhân gây Ngày duyệt bài: 23.4.2019 tử vong, tiền sản giật (TSG) là một tình trạng 122
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 478 - THÁNG 5 - SỐ 1 - 2019 bệnh lý phức tạp thường xảy ra ở nửa sau của 2. Mô tả một số đa hình gen MTHFR (C677T thai kỳ (theo quy định là sau tuần thứ 20 của và A1298C) ở bệnh nhân tiền sản giật. quá trình mang thai). Tỷ lệ mắc tiền sản giật thay đổi tùy theo từng II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU khu vực trên thế giới. Theo nghiên cứu của Sibai 2.1. Đối tượng nghiên cứu (1995), ở Hoa Kỳ, tỉ lệ mắc bệnh trong số các - Nhóm bệnh gồm bệnh nhân được xác định thai phụ là 5-6% [2]. Tại Việt Nam, nghiên cứu tiền sản giật tại bệnh viện Phụ Sản Hà Nội và của Trần Thị Khảm (2008) là 3,2% [3]. Những nhóm chứng gồm thai phụ bình thường. biến chứng nguy hiểm mà TSG gây ra cho thai - Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Tư phụ là chảy máu, rau bong non, suy gan suy vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội trong thận, sản giật, phù phổi cấp và những biến thời gian từtừ tháng 7/2016 đến tháng 2/2019. 2.2.1. Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu chứng gây ra cho thai nhi như thai kém phát - Huyết áp ≥ 140/90mm Hg sau tuần 20 của triển trong tử cung, đẻ non, thai chết lưu… thai kỳ. Những năm gần đây, với sự phát triển của - Protein niệu ≥ 300 mg/24 giờ hoặc Protein / sinh học phân tử, các nhà khoa học đã kiểm tra Creatinin niệu ≥ 0,3. hơn 70 gen sinh học đại diện cho các quá trình 2.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ: Những thai phụ sinh lý khác nhau nhằm tìm ra mối liên hệ giữa có tình trạng bệnh lý sau không được chọn làm biến đổi gen và bệnh tiền sản giật. Trong đó, đối tượng nghiên cứu: biến đổi gen MTHFR liên quan đến nồng độ - Bị tăng huyết áp, bệnh tim mạch, bệnh ung homocysteine máu, đặc biệt là nồng độ folate thư, mắc các bệnhnội tiết tự miễn có hệ thống huyết thanh được nhiều tác giả lựa chọn nghiên khi đang mang thai. cứu. Tuy nhiên, trên những chủng tộc người - Bị nhiễm trùng đặc biệt, nhiễm trùng thần khác nhau, các nhà khoa học thu được các kết kinh, có tiền sử chấn thương sọ não, các bệnh quả trái chiều [4]. thoái hóa hệ thần kinh, u não. Việc xác định các đột biến gen liên quan đến - Có các bất thường ở thai, Rh- tiền sản giật sẽ giúp phát hiện sớm nguy cơ tiến - Có các thói quen xấu (thuốc lá, rượu, ma túy). triển bệnh và đưa ra hướng điều trị thích hợp. - Thai phụ không đồng ý tham gia nghiên cứu. Ngoài vấn đề xác định các đa hình/đột biến gen 2.2.3. Cỡ mẫu nghiên cứu: 50 mẫu ADN MTHFR liên quan đến tiền sản giật, thì việc phát của bệnh nhân tiền sản giật và 50 mẫu ADN của triển một kỹ thuật sinh học phân tử trong y học thai phụ bình thường được sử dụng để hoàn là rất cần thiết. Kỹ thuật điện di tự hiện mới chỉnh quy trình và xác định đa hình gen C677T được đưa vào sử dụng ở Việt Nam và chưa có và đa hình A1298C gen MTHFR. công bố nào về ứng dụng kỹ thuật này trong xác 2.3.Phương pháp nghiên cứu: Mẫu máu định các đa hình/đột biến gen. Mục tiêu của ngoại vi của 20 bệnh nhân TSG được tách chiết nghiên cứu gồm: ADN bằng kit ADN-express (Lytech, Nga), sau đó 1. Hoàn thiện kỹ thuật ARMS-PCR kết hợp sử dụng kit ARMS (Lytech, Nga) để nhân gen điện di tự động để xác định đa hình gen MTHFR PCR theo mồi đặc hiệu và tiến hành điện di tự ở bệnh nhân tiền sản giật. động để xác định kiểu gen của từng bệnh nhân. Bảng 1. Trình tự cặp mồi của các đa hình C677T (Ala222Val)và A1298C (Glu429Ala) gen MTHFR. Chiều dài Kích thước sản Gen Trình tự mồi (µM) phẩm (bp) 677-Common F: 0,4 407 5’-CCAGCCACTCACTGTTTTAGTTCAGGC-3’ 677-C: C677T 0,4 407 5’-TTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGCGC-3’ 677-T: 0,4 407 5’-TTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGCGT-3’ 1298-Common F: 0,5 593 5’-GAAGAAGTTTGCATGCTTGTGGTTG-3’ A1298C 1298-A: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’ 0,5 593 1298-C: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’ 0,5 593 2.4. Xử lý số liệu: Sau khi nhân gen PCR tiến hành điện di trên máy điện di tự động Qsep100TM. Các số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS16.0 123
vietnam medical journal n01 - MAY - 2019 2.5. Đạo đức trong nghiên cứu 3.1. Tách chiết AND: 100 mẫu nghiên cứu - Nghiên cứu được tiến hành sau khi được phép được tách ADN bằng phương pháp ADN-express, của hội đồng đạo đức trường đại học Y Hà Nội. tuy nhiên chúng tôi giảm thể tích máu và dung - Cam kết tiến hành nghiên cứu với tinh thần dịch tách ADN so với protocol hướng dẫn của trung thực, số liệu nghiên cứu chưa từng được hãng. Cụ thể, lượng máu ngoại vilà 200µl và công bố dưới bất kỳ hình thức nào. dung dịch tách AND là 200µl, thay vì 550µl máu ngoại vi và 550 µl dung dịch tách AND như trong III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU protocol. Tiến hành kiểm tra độ tinh sạch đạt 3.1. Hoàn thiệnkỹ thuật ARMS-PCR kết hợp chuẩn thu được kết quả sau: điện di tự động để xác định đa hình gen MTHFR Bảng 2. Kết quả đo nồng độ tinh sạch ADN theo phương pháp ADN-express Mẫu Nồng độ ADN (ng/µl) Độ tinh sạch Nhóm bệnh: Trung bình 352,7 1,83 Thấp nhất 106,3 1,75 Cao nhất 419,8 1,94 Nhóm chứng: Trung bình 385,9 1,9 Thấp nhất 213,4 1,78 Cao nhất 516,4 1,95 Nhận xét: Lượng ADN thu được từ các mẫu tương đối cao và ổn định. 3.2. Tỷ lệ xuất hiện kiểu gen C677T và A1298C Bảng 3. Tỉ lệ xuất hiện các kiểu gen C677T và A1298C C677T CC CT TT C T 23 18 9 18 Nhóm bệnh(n=50) 32(64,0%) (46,0%) (36,0) (18,0) (36,0 %) 27 23 0 27 23 Nhóm chứng(n=50) (54,0) (46,0) (0,0%) (54,0) (46,0) P 0,007 0,0084 0,0001 0,004 0,0002 0,73 (0.33 – 0,66 (0.30 23,12 (1.31 0,33 (0.29 1,88 OR (95%CI) 1.59) – 1.47) – 409.15) – 0.99) (1.01 – 3.50) A1298C AA AC CC A C 20 26 4 33 17 Nhóm bệnh (n=50) (40,0%) (52,0%) (8,0%) (66,0%) (34,0) 39 11 Nhóm chứng 0 45 5 (78%) (22%) P 0,005 0,003 0,0016 0,0001 0,0005 0,19 (0.08 – 3,84 (1.61 9,77 (0.51 0,24 (0.11 4,17 (1.97 OR 0.45) – 9.16) – 186.53) – 0.51) – 8.83) Nhận xét: Xét nghiệm gen C677T ở nhóm đồng hợp CC và 11 người có kiểu gen dị hợp đột bệnh nhân, có 23 bệnh nhân có kiểu gen đồng biến AA (22%), không phát hiện đối tượng mang hợp CC, chiếm tỉ lệ 46%, 18 bệnh nhân có kiểu đồng hợp AC trong nhóm nghiên cứu. gen dị hợp đột biến CT (36%) và 9 bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp đột biến TT (18%). Như vậy IV. BÀN LUẬN số bệnh nhân mang gen đột biến là 27, chiếm Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR 54%. Trong khi đó ở nhóm chứng, 27 người kết hợp điện di tự động để xác định đa hình gen (54%) có kiểu gen đồng hợp CC và 23 (46%) MTHFR ở bệnh nhân tiền sản giật. Chúng tôi người có kiểu gen dị hợp đột biến CT, không nhận thấy kỹ thuật này đơn giản, tiết kiệm thời phát hiện đối tượng mang đồng hợp TT trong gian, giảm giá thành, cho hình ảnh rõ ràng, nhóm nghiên cứu. chính xác. Xét nghiệm gen A1298C ở nhóm bệnh nhân, 4.1. Mô tả đa hình MTHFR C677T ở bệnh có 30 bệnh nhân (60%) mang gen đột biến, nhân tiền sản giật. Phân tích kết quả điện di trong đó 26 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp đột sau khi tiến hành ARMS-PCR trên 50 mẫu ADN biến AC (52%) và 4 bệnh nhân có kiểu gen đồng của 50 bệnh nhân tiền sản giật, nhận thấy tỷ lệ hợp đột biến CC (8%)có 20 bệnh nhân có kiểu xuất hiện đa hình khá cao ở nhóm này với 27 gen đồng hợp AA , chiếm tỉ lệ 40%, Trong khi đó trường hợp (54%), cụ thể có 9 trường hợp mang ở nhóm chứng, 39 người (78%) có kiểu gen kiểu gen đồng hợp tử đột biến, chiếm 18%, 18 124
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 478 - THÁNG 5 - SỐ 1 - 2019 trường hợp mang alen đột biến, chiếm 36%, số các tác giả trên vẫn đề nghị nên tiến hành cá thể không mang đột biến là 23, chiếm 46%. nghiên cứu xác định đa hình gen A1298C ở bệnh Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành mô tả đa nhân có tiền sử tiền sản giật, góp phần phát hiện hình gen MTHFR C677T ở bệnh nhân tiền sản giật mối liên quan của đa hình này với các yếu tố gây tại Việt Nam. Cho đến nay, đây là nghiên cứu đầu tiền sản giật. tiên ở nước ta về vấn đề này. Do đó, chưa có kết quả nào của các tác giả trong nước để so sánh. V. KẾT LUẬN Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đa Hoàn thiện thành công kỹ thuật ARMS-PCR hình gen MTHFR C677T ở đối tượng bệnh nhân kết hợp điện di tự động để xác định đa hình gen tiền sản giật nhưng thu được kết quả khác nhau MTHFR ở bệnh nhân tiền sản giật. tùy từng nghiên cứu. Chedraui và cộng sự (2014) Về đa hìnhMTHFR C677T có 27 bệnh nhân [5] kết luận có mối liên quan giữa đa hình gen (54%) mang gen, trong đó 18 trường hợp (36%) C677T gen MTHFR với tiền sản giật. Wu X và mang dị hợp tử và 9 trường hợp (18%) mang cộng sự (2015) thực hiện nghiên cứu trên 7398 đồng hợp đột biến. Tỉ lệ này ở nhóm chứng là bệnh nhân tiền sản giật và 11230 thai phụ bình 46%, không tìm thấy đối tượng mang gen đồng thường, kết quả đã chứng minh đa hình C677T hợp. Về đa hình MTHFR A1298C, có 30 bệnh gen MTHFR có liên quan đến tiền sản giật [6]. nhân (60%) mang gen, 26 trường hợp (52%) Kết quả thu được đã không nhận thấy sự mang dị hợp tử và 4 trường hợp (8%) mang khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa đa hình đồng hợp đột biến. Chỉ có 11 trường hợp (22%) C677T gen MTHFR ở nhóm bệnh và nhóm tại nhóm chứng phát hiện đột biến gen thể dị chứng. Cụ thể tần số của kiểu gen CC ở 3 nhóm hợp, không phát hiện đồng hợp đột biến. lần lượt là 58,6%, 64,1% và 57,1% và đồng hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO tử biến đổi TT (9,0%, 5,1% và 5,4%). Không có 1. Unicef. Tỷ lệ tử vong mẹ đang giảm tại các nước sự khác biệt đáng kể về tần số allen của T có thu nhập trung bình nhưng phụ nữ tại các nước (25,2%, 20,5% và 24,1% đối với cả 3 nhóm). Từ có thu nhập thấp vẫn đang bị tử vong trong thời đó, họ kết luận sự đa hình của MTHFR C677T kỳ mang thai và trong khi sinh con. [online]. Available at:https:// www.unicef.org/ vietnam/vi/ không có vai trò chính trong sự phát triển của media_7456.html [Accessed 15 August 2016]. chứng tiền sản giật hoặc rau bong non ở người 2. Sibai B.M and Mohamed (1995). Pre eclampsia Phần Lan [7]. and eclampsia. Gynecology and Obs (Sciarra) 1995 Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ xuất (3), 1-14. hiện đa hình C677T gen MTHFR ở nhóm bệnh 3. Trần Thị Khảm (2008). Nghiên cứu một số chỉ số hóa sinh và huyết học ở sản phụ tiền sản giật nhân tiền sản giật khá cao. Tuy nhiên, đây là tại Bệnh viện phụ sản Trung ương từ 7/2006 đến nghiên cứu thiên về hoàn chỉnh quy trình kỹ 6/2008, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ chuyên khoa thuật, thực hiện với cỡ mẫu bé. Vậy nên kết quả II, Trường Đại học Y Hà Nội. này chưa thể khẳng định được mối liên quan 4. Williams, P. J., & Pipkin, F. B. (2011). The genetics of pre-eclampsia and other hypertensive giữa đa hình gen C677T gen MTHFR với tiền sản disorders of pregnancy. Best practice & research giật trên đối tượng người Việt Nam. Clinical obstetrics & gynaecology, 25(4), 405-417. 4.2. Mô tả đa hình MTHFR A1298C ở 5. Chedraui, P., Salazar-Pousada, D., Villao, A., bệnh nhân tiền sản giật. et al (2014). Polymorphisms of the Khi phân tích đa hình A1298C gen MTHFR ở methylenetetrahydrofolate reductase gene (C677T and A1298C) in nulliparous women complicated 20 bệnh nhân tiền sản giật, nhận thấy tỷ lệ xuất with preeclampsia. Gynecological Endocrinology, hiện đột biến ở nhóm bệnh nhân này cũng khá 30(5), 392-396. cao, cụ thể có 4 trường hợp mang kiểu gen đồng 6. Wu, X., Yang, K., Tang, X., et al (2015). Folate hợp tử đột biến, chiếm 8%, 26 trường hợp mang metabolism gene polymorphisms MTHFR C677T and A1298C and risk for preeclampsia: a meta- dị hợp alen đột biến, chiếm 52%, còn lại 20 analysis. Journal of assisted reproduction and (40%) trường hợp không bị đột biến. genetics, 32(5), 797-805. Các nghiên cứu trên thế giới: Klai và cộng sự 7. Jääskeläinen, E., Keski-Nisula, L., Toivonen, (2011) nghiên cứu trên 203 bệnh nhân tiền sản S., et al (2006). MTHFR C677T polymorphism is not associated with placental abruption or giật, kết quả cho thấy có mối liên quan giữa đa preeclampsia in Finnish women. Hypertension in hình gen A1298C gen MTHFR với sự gia tăng pregnancy, 25(2), 73-80. nồng độ homosystein trong huyết thanh [8]. Tuy 8. Klai, S., Fekih-Mrissa, N., El Housaini, S., et al nhiên, rất nhiều nghiên cứu khác chỉ ra rằng, đa (2011). Association of MTHFR A1298C hình gen A1298C gen MTHFR không có mối liên polymorphism (but not of MTHFR C677T) with elevated homocysteine levels and placental quan trực tiếp đến tiền sản giật như nghiên cứa vasculopathies. Blood Coagulation & Fibrinolysis, của Wu X và cộng sự (2015) [6]. Mặc dù vậy, 22(5), 374-378. 125