Hoàn thiện quy trình phát hiện bất thường nhiễm sắc thể trước chuyển phôi bằng kỹ thuật fish

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br /> <br /> HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHÁT HIỆN BẤT THƢỜNG<br /> NHIỄM SẮC THỂ TRƢỚC CHUYỂN PHÔI BẰNG KỸ THUẬT FISH<br /> Triệu Tiến Sang*; Trần Văn Khoa*; Nguyễn Thị Việt Hà*<br /> Nguyễn Đình Tảo*; Đỗ Minh Trung*; Đỗ Ngọc Ánh*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: phát hiện bất thường nhi m sắc thể (NST) trước chuyển phôi trên các phôi thụ tinh<br /> trong ống nghiệm (TTTON) góp phần nâng cao hiệu quả chuyển phôi và phôi làm tổ của các<br /> phôi chuyển. Đối tượng và phương pháp: 50 mẫu phôi dư được sinh thiết tại Trung tâm Công<br /> nghệ Phôi, Học viện Quân y. Sử dụng kỹ thuật FISH xác định bất thường số lượng NST của<br /> phôi. Kết quả: kỹ thuật FISH sau khi hoàn thiện đã chẩn đoán được 50 phôi; trong đó 21 phôi<br /> có lệch bội. Kết luận: đã hoàn thiện và áp dụng được quy trình phát hiện bất thường NST trước<br /> chuyển phôi trên các phôi TTTON.<br /> * Từ khóa: Thụ tinh trong ống nghiệm; Chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi; Lệch bội nhi m<br /> sắc thể.<br /> <br /> Having Process Detected Aneuploidy before Embryo Transfer by<br /> FISH Technique<br /> Summary<br /> Objectives: To detect aneuploidy before embryo transfer in IVF embryos contribute to<br /> improve embryo transfer and embryo implantation efficiency. Subjects and methods: 50 surplus<br /> embryos obtained at Embyonic Technology Center, Military Medical University. Using FISH<br /> technique for detection of aneuploidy of embryos. Results: FISH technique was applied<br /> successfully in detection of aneuploidy in 50 embryos, of which, 21 embryos were identified<br /> as aneuploidy. Conclusion: FISH technique was applied successfully in detection aneuploidy in<br /> embryos before embryo transfer.<br /> * Key words: IVF; Pre-implantation genetic diagnosis; Aneuploidy.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hiện nay, tỷ lệ vô sinh chiếm khoảng<br /> 5 - 10% các cặp vợ chồng trong độ tuổi<br /> sinh sản. Cùng với sự phát triển của khoa<br /> học, kỹ thuật TTTON (In Vitro Fertilization IVF) đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực<br /> hỗ trợ sinh sản và ngày càng phát triển<br /> rộng khắp nơi trên thế giới. Tuy nhiên,<br /> <br /> trong nhiều trường hợp, nguyên nhân khiến<br /> người phụ nữ không có thai sau khi được<br /> chuyển phôi là do phôi có bất thường về<br /> số lượng NST như vô nhi m, đơn nhi m,<br /> tam nhi m... Hiện tượng lệch bội NST ở<br /> phôi người trong quá trình điều trị bằng<br /> TTTON đã được nêu ra từ lâu và nhiều<br /> nghiên cứu cũng công nhận hiện tượng<br /> này xảy ra ở giai đoạn trước khi làm tổ.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Triệu Tiến Sang (trieusangk83@yahoo.com.vn)<br /> Ngày nhận bài: 10/12/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/02/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 07/03/2016<br /> <br /> 53<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br /> <br /> Vì vậy, trước khi cấy chuyển phôi bào<br /> cần chẩn đoán bất thường NST. PGD<br /> (Pre-implantation Genetic Diagnosis) là<br /> quá trình chẩn đoán di truyền trước làm tổ,<br /> kỹ thuật này giúp cho việc có thể chọn<br /> được tương đối chính xác những phôi<br /> không có bất thường về di truyền để cấy<br /> vào tử cung người mẹ. Từ đó, nâng cao tỷ<br /> lệ thành công của kỹ thuật TTTON, giúp<br /> cho ra đời các em bé khỏe mạnh. Vì vậy,<br /> chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm:<br /> Hoàn thiện quy trình phát hiện bất thường<br /> NST trước chuyển phôi bằng kỹ thuật FISH.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> . Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 50 tế bào (TB) phôi được sinh thiết từ<br /> các phôi dư (lưu trữ tại Trung tâm Công<br /> nghệ Phôi, Học viện Quân y).<br /> - Hóa chất kỹ thuật FISH:<br /> Sử dụng bộ kít Vysis MultiVysion PGT:<br /> có đầu dò đối với các NST 13, 18, 21,<br /> X và Y. Dung dịch nhược trương (1% Na<br /> citrate và 6 mg/ml HSA); dung dịch cố<br /> định (Carnoy 3:1); methanol 100%; dung<br /> dịch 0,4X SSC/0,3% NP40; 2X SSC/0,1%<br /> NP40; antiface II; cement (chất gắn lamen).<br /> - Thiết bị: kính hiển vi soi nổi, buồng lai,<br /> tủ ổn nhiệt, bể ổn nhiệt, kính hiển vi huỳnh<br /> quang.<br /> 2. Phƣơ g pháp ghi<br /> <br /> cứu.<br /> <br /> * Quy trình thụ tinh bằng phương pháp<br /> ICSI và quy trình sinh thiết TB phôi:<br /> Quy trình thụ tinh bằng phương pháp<br /> ICSI và quy trình sinh thiết các TB phôi<br /> ngày được tiến hành tại Trung tâm Công<br /> nghệ Phôi, Học viện Quân y. TB phôi sau<br /> khi sinh thiết được đặt lên đĩa sinh thiết,<br /> <br /> 54<br /> <br /> bảo quản trong các giọt dầu và chuyển<br /> sang Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học<br /> Quân sự, Học viện Quân y để tiến hành<br /> thực hiện kỹ thuật FISH.<br /> * Quy trình FISH:<br /> - Công đoạn cố định TB lên lam kính:<br /> chuẩn bị đĩa petri có nhỏ sẵn các giọt<br /> dung dịch. Quan sát dưới kính hiển vi soi<br /> nổi, hút một TB phôi, sau đó đặt vào giọt<br /> thứ nhất (giọt dung dịch PBS) để rửa<br /> sạch dầu (lớp dầu bảo quản TB phôi).<br /> Sau đó, hút chuyển các TB sang giọt thứ<br /> hai (dung dịch nhược trương). Ở giọt thứ<br /> hai, sau khoảng 5 phút, hút TB và đặt lên<br /> lam kính. Khi thấy vị trí có TB gần khô<br /> hoàn toàn, tiến hành nhỏ lần lượt từng<br /> giọt dung dịch cố định lên vòng tròn đã<br /> khoanh, mỗi giọt khoảng 2 µl. Giọt trước<br /> khô mới tiếp tục nhỏ giọt tiếp theo. Khi<br /> thấy hình ảnh nhân TB rõ ràng thì dừng<br /> việc nhỏ dung dịch cố định. Để tiêu bản<br /> khô ở nhiệt độ phòng.<br /> - Công đoạn lai đầu dò với TB bạch cầu<br /> và TB phôi: ngâm tiêu bản vào methanol<br /> trong 2 phút. Sau đó lấy ra để tiêu bản<br /> khô ở nhiệt độ phòng. Lấy mẫu dò ADN<br /> MultiVysion PGT từ tủ bảo quản -200C để<br /> ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng từ<br /> 5 - 10 phút. Nhỏ 3 µl mẫu dò lên vùng lai<br /> có chứa TB đã được đánh dấu. Đặt nhẹ<br /> nhàng lamen phủ lên vùng lai. Gắn rubber<br /> cement quanh vị trí mép lamen để tránh<br /> bay hơi dung dịch mẫu dò trong quá<br /> trình lai. Đặt lam mẫu vào buồng lai. Đặt<br /> chương trình: 730C trong 10 phút, 370C<br /> trong 3 giờ.<br /> - Công đoạn rửa tiêu bản sau lai: lấy<br /> tiêu bản ra khỏi buồng lai, nhẹ nhàng gỡ bỏ<br /> rubber cement và lamen. Nhúng tiêu bản<br /> vào cốc đựng dung dịch 0,4X SSC/0,3%<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br /> <br /> NP40 trong 2 phút. Dung dịch này phải<br /> đạt được 730C từ trước khi sử dụng. Sau<br /> đó, lấy tiêu bản ra, nhúng tiếp vào cốc<br /> đựng dung dịch 2X SSC/0,1% NP40 ở<br /> nhiệt độ phòng trong 1 phút. Lấy tiêu bản<br /> ra để khô hoàn toàn trong tủ ấm 370C<br /> (tránh ánh sáng).<br /> <br /> Trong quá trình thực hiện kỹ thuật,<br /> chúng tôi thấy công đoạn cố định TB lên<br /> lam kính hết sức quan trọng, cần đặc biệt<br /> chú ý tới bước nhỏ dung dịch Carnoy cố<br /> định lên vị trí có TB phôi. Nếu TB phôi bị<br /> bong khỏi lam trong quá trình thao tác thì<br /> kỹ thuật thất bại.<br /> <br /> - Công đoạn phân tích tín hiệu sau lai:<br /> sau khi lam khô, nhỏ 3 µl antifade II lên<br /> vùng lai và đậy lamen kính lên trên. Quan<br /> sát phân tích tín hiệu lai dưới kính hiển vi<br /> huỳnh quang với từng phin lọc thích hợp,<br /> đưa ra kết luận với từng mẫu phôi bào<br /> cụ thể.<br /> <br /> Các chú ý trong quá trình gắn TB lên<br /> lam kính: hút TB hết sức cẩn thận, nhẹ<br /> nhàng, tránh làm vỡ TB khi rửa trong giọt<br /> PBS 1X. Rửa sạch dung dịch dầu, nếu<br /> rửa không sạch dầu vẫn bám lên bề mặt<br /> TB phôi, do vậy không thể làm nhược<br /> trương để bộc lộ nhân TB. Khi đó, quá<br /> trình lai với các tín hiệu đầu dò sẽ thất<br /> bại. Dung dịch nhược trương phải đảm<br /> bảo được pha mới trong ngày, không quá<br /> 8 giờ trước khi sử dụng để tránh sai lệch<br /> nồng độ muối và pH. Nếu sai hỏng sẽ dẫn<br /> đến quá trình lai tín hiệu huỳnh quang<br /> không thành công.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả hoàn thiện quy trình kỹ<br /> thuật FISH trên TB phôi sinh thiết từ<br /> các phôi dƣ.<br /> Sử dụng kỹ thuật FISH để xác định những<br /> bất thường NST đã được thực hiện ở nhiều<br /> trung tâm nghiên cứu trên thế giới. Chúng<br /> tôi sử dụng bộ kít Vysis MultiVysion đã<br /> thương mại hóa và được nhiều trung tâm<br /> nghiên cứu trên thế giới sử dụng.<br /> Đối với quá trình chuẩn hóa quy trình<br /> FISH, sinh thiết từ các mẫu phôi dư được<br /> tổng số 58 TB phôi (có TB phôi ngày 3 và<br /> TB phôi ngày 5).<br /> Trước khi bước vào thực hiện kỹ thuật<br /> FISH để chuẩn hóa quy trình, tiến hành<br /> thử thao tác cố định TB lên lam kính đối<br /> với 5 TB phôi. Trong quá trình thao tác<br /> trên 5 TB phôi, 3/5 TB bị bong do nguyên<br /> nhân: lam kính sử dụng chưa đủ sạch<br /> nên TB khó bám dính vào lam, quá trình<br /> nhỏ dung dịch cố định là carnoy quá<br /> nhanh và nhiều. Sau khi rút kinh nghiệm,<br /> đã cố định được 2/5 TB phôi còn lại.<br /> <br /> Một chú ý nữa là khi bóc lam men ra<br /> khỏi lam kính cần bóc nhẹ nhàng, tránh<br /> làm mất TB phôi nếu TB phôi dính vào<br /> lamen. Keo gắn lamen phải đúng hang,<br /> sau khi gắn d dàng bóc ra sau lai, dung<br /> dịch lai không bị bay hơi sau khi ủ trong<br /> buồng lai.<br /> Trong quá trình tiến hành kỹ thuật<br /> FISH để chuẩn hóa quy trình trên 53/58<br /> TB phôi sinh thiết từ các phôi dư, có 3/50<br /> TB phôi không đưa ra được kết luận có<br /> hay không có lệch bội NST do tín hiệu<br /> lai xấu; còn lại 50/58 TB phôi có tín hiệu<br /> huỳnh quang phân tích được, kết quả FISH<br /> như sau: bình thường: 29 TB (58%); bất<br /> thường: 21 TB (42%).<br /> Đối với 50 mẫu TB phôi thu được kết<br /> quả lai, 21 mẫu cho tín hiệu bất thường<br /> ở các cặp NST 13, 18, 21, X, Y. Như vậy,<br /> <br /> 55<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br /> <br /> tỷ lệ lệch bội NST cao, chiếm tới 42%<br /> tổng số phôi được chẩn đoán. Còn lại 29<br /> mẫu phôi cho kết quả chẩn đoán bình<br /> thường với các cặp NST đang đánh giá<br /> chiếm 58%.<br /> Nghiên cứu của Munné và CS (2007)<br /> thực hiện trên 6.000 phôi, kết quả: 56% BN<br /> nữ < 35 tuổi với phôi có hình thái tốt ở giai<br /> đoạn phân chia có tỷ lệ bất thường về NST,<br /> tỷ lệ này tăng theo độ tuổi người mẹ [6].<br /> Nghiên cứu của Rubio và CS (2013)<br /> sử dụng kỹ thuật FISH 9 đầu dò 13, 15,<br /> 16, 17, 18, 21, 22 và XY nghiên cứu trên<br /> 265 phôi ngày 3 của 91 phụ nữ không có<br /> phôi làm tổ liên tiếp (tuổi trung bình 35,2),<br /> kết quả: tỷ lệ lệch bội NST là 57,3% [5].<br /> <br /> Kết quả của chúng tôi tương đồng với<br /> nghiên cứu của Munné, Sandalinas và<br /> Cohen thực hiện trên 1.600 phôi: hầu hết<br /> dị bội NST xuất hiện ở các cặp NST 21,<br /> 22, 16, 15; trong khi các cặp NST giới tính<br /> 13, 18 ít gặp hơn [6].<br /> Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ lệch<br /> bội NST trên phôi bào khá cao ở các cặp<br /> NST 13, 18, 21, X, Y. Do vậy, cần sàng<br /> lọc những bất thường này trước chuyển<br /> phôi nhằm hạn chế trẻ sinh ra mang dị tật<br /> bẩm sinh, đặc biệt là nhóm có nguy cơ cao.<br /> Chúng tôi thu được một số hình ảnh lai<br /> như sau:<br /> <br /> Nguy n Thị Hương và CS nghiên cứu<br /> 127 phôi ngày 3 bằng kỹ thuật FISH 5 đầu<br /> dò, kết quả: tỷ lệ lệch bội NST là 46,4% [1].<br /> Như vậy, kết quả về tỷ lệ lệch bội của<br /> chúng tôi khác với một số tác giả khác, do<br /> khác về việc chọn mẫu nghiên cứu, số<br /> lượng mẫu và số lượng NST được đánh<br /> giá trong mỗi nghiên cứu.<br /> <br /> (a)<br /> <br /> Bảng 1: Các dạng bất thường thu được<br /> sau khi phân tích kết quả lai.<br /> Số ƣợng<br /> <br /> Tỷ lệ %<br /> <br /> Patau<br /> <br /> 4<br /> <br /> 19,0<br /> <br /> Edwards<br /> <br /> 2<br /> <br /> 9,5<br /> <br /> Down<br /> <br /> 7<br /> <br /> 33,3<br /> <br /> Turner<br /> <br /> 1<br /> <br /> 4,8<br /> <br /> Klinefelter<br /> <br /> 1<br /> <br /> 4,8<br /> <br /> Bất thường khác<br /> <br /> 6<br /> <br /> 28,6<br /> <br /> Tổng số<br /> <br /> 21<br /> <br /> 100<br /> <br /> Hội chứng<br /> <br /> Kết quả phân tích trên 50 TB phôi: tỷ lệ<br /> phôi cho kết quả trisomy 21 cao nhất (33,3%),<br /> tiếp đến là tỷ lệ phôi trisomy 13 (19%),<br /> NST 18 và NST giới tính ít gặp bất thường.<br /> <br /> 56<br /> <br /> (b)<br /> <br /> Hình 1: Kết quả FISH của các phôi bào<br /> E8 và E30 không có bất thường ở cặp<br /> NST 13, 18, 21 và cặp NST giới tính.<br /> (a) Phôi E8 có cặp NST giới tính XX;<br /> (b) Phôi E30 có cặp NST giới tính XY.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br /> <br /> Phân tích dưới kính hiển vi huỳnh<br /> quang thấy: 2 tín hiệu màu đỏ (red) ứng<br /> với 2 NST 13, 2 tín hiệu màu xanh lá cây<br /> (green) ứng với 2 NST 21, 2 tín hiệu màu<br /> xanh lơ (aqua) ứng với 2 NST 18. Bên<br /> cạnh đó, tín hiệu màu xanh da trời (blue)<br /> ứng với NST X và tín hiệu màu vàng<br /> (gold) ứng với NST Y. Như vậy, với phôi<br /> (a) cặp NST giới tính là XX vì có 2 tín<br /> hiệu màu xanh da trời (blue), phôi (b) cặp<br /> NST giới tính là XY vì có 1 tín hiệu màu<br /> xanh da trời (blue) và 1 tín hiệu màu vàng<br /> (gold). Như vậy, với các phôi bào có số<br /> lượng tín hiệu thu được giống như trên,<br /> kết quả chẩn đoán đưa ra sau khi tiến<br /> hành kỹ thuật FISH là phôi bào không có<br /> <br /> bất thường về số lượng các cặp NST 13,<br /> 18, 21, X, Y.<br /> <br /> Hình 2: Kết quả FISH phôi bào E2 mang<br /> 3 NST ở các cặp NST 13, 18, 21 và<br /> NST giới tính X.<br /> <br /> Hình 3: Kết quả FISH của phôi bào E38<br /> mang 3 NST số 21.<br /> <br /> Sau khi chính thức đưa quy trình FISH<br /> đã chuẩn hóa vào chẩn đoán tiền làm tổ<br /> ở phôi của BN thực hiện IVF, những phôi<br /> được chẩn đoán bằng FISH có kết quả<br /> bình thường, sẽ được cấy chuyển vào tử<br /> cung người mẹ. Điều đó giúp tăng khả<br /> năng mang thai của bà mẹ và trẻ sinh ra<br /> được khỏe mạnh.<br /> Trong các phôi bào chúng tôi phân tích<br /> bằng kỹ thuật FISH, ngoài những phôi<br /> bào có kết quả bình thường đối với cặp<br /> NST 13, 18, 21, X, Y, chúng tôi còn thu<br /> được một số hình ảnh phôi bất thường<br /> như sau:<br /> <br /> Quan sát phân tích thấy phôi bào ở hình 2 có 3 tín hiệu màu đỏ (red), 3 tín hiệu màu<br /> xanh lá cây (green), 3 tín hiệu màu xanh lơ (aqua) và 3 tín hiệu với màu xanh da trời (blue).<br /> Như vậy, TB phôi này có 3 NST 13, 3 NST 18, 3 NST 21 và cặp NST giới tính là XXX.<br /> TB phôi trên hình 3 có 2 tín hiệu màu xanh lơ, 2 tín hiệu màu đỏ, 2 tín hiệu màu<br /> xanh da trời và 3 tín hiệu màu xanh lá cây. Như vậy, phôi bào có bất thường ở NST<br /> 21, có tới 3 NST 21. Trẻ sinh ra sẽ mắc hội chứng Down.<br /> <br /> 57<br /> <br />