Hoạt tính chống oxy hóa của chitosan thủy phân bằng acid sulfuric

Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 4/2012<br /> <br /> THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br /> <br /> HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CHITOSAN THỦY PHÂN<br /> BẰNG ACID SULFURIC<br /> ANTIOXIDATIVE ACTIVITY OF CHITOSAN HYDROLYSATE PREPARED<br /> BY USING SULFURIC ACID<br /> Huỳnh Nguyễn Duy Bảo1, Phan Đình Thụy2<br /> Ngày nhận bài: 12/9/2012; Ngày phản biện thông qua: 22/11/2012; Ngày duyệt đăng: 15/12/2012<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Hoạt tính chống oxy hóa của chitosan thủy phân bằng acid sulfuric được đánh giá thông qua khả năng khử gốc tự<br /> do DPPH và tổng năng lực khử. Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ acid sulfuric và thời gian thủy phân có ảnh hưởng<br /> đáng kể đến hoạt tính chống oxy hóa, độ deacetyl và hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân. Chitosan thủy phân bằng acid<br /> sulfuric 250 mM trong 24 giờ ở 30 ± 2oC có độ deacetyl là 89,1 ± 0,3%, hiệu suất thu hồi là 67 ± 3% và hoạt tính chống<br /> oxy hóa cao nhất.<br /> Từ khóa: Chitosan, Chống oxy hóa, Độ deacetyl, Thủy phân<br /> <br /> ABSTRACT<br /> The antioxidative activity of chitosan hydrolyzed by sulfuric acid was evaluated by the DPPH radical scavenging<br /> activity and total reducing capacity. The results showed that sulfuric acid concentration and hydrolysis time significantly<br /> affected the antioxidant activity, degree of deacetylation and recovery of chitosan hydrolysate. Chitosan hydrolyzed by<br /> using 250 mM sulfuric acid for 24 hours at 30 ± 2°C had the highest antioxidative activity. The degree of deacetylation and<br /> recovery of chitosan hydrolysate prepared under this condition were 89.1 ± 0.3% and 67 ± 3%, respectively.<br /> Keywords: Chitosan, Antioxidant, Degree of deacetylation, Hydrolysis<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Chitosan là sản phẩm deacetyl hóa chitin, một<br /> polymer hữu cơ phổ biến trong thiên nhiên được tạo<br /> ra trung bình 20 g trong 1 năm/1 m2 bề mặt trái đất.<br /> Chitosan và dẫn xuất của chúng có rất nhiều ứng<br /> dụng trong các lĩnh vực khác nhau như nông nghiệp,<br /> công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y dược,... Nhờ<br /> có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn và khả<br /> năng tạo màng nên chitosan được ứng dụng để bảo<br /> quản trái cây, rau quả, thịt, cá, trứng, sữa và một số<br /> sản phẩm thực phẩm khác (Jeon và cộng sự, 2002).<br /> Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng<br /> ức chế một số loài vi sinh vật như Staphylococcus<br /> aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Proteus<br /> vulgaris, Alternaria sp., Penicillium sp. và Cladosporium sp.<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> <br /> (Balicka-Ramisz và cộng sự, 2005). Thời hạn bảo<br /> quản của một số loại trái cây, rau quả như lê, đào,<br /> kiwi, vải, dưa chuột, bí, ớt chuông, dâu tây, cà<br /> chua,… tăng lên khi chúng được phủ lớp màng<br /> chitosan bên ngoài. Trong trường hợp này, màng<br /> chitosan không chỉ có tác dụng ức chế sự phát<br /> triển của vi sinh vật mà nó còn có tác dụng làm<br /> chậm quá trình chín, kiểm soát sự chuyển ẩm, hạn<br /> chế tiếp xúc với oxy và ngăn ngừa phản ứng nâu<br /> hóa. Chất lượng cá hồi phi lê đông lạnh và thịt bò<br /> được cải thiện đáng kể khi được bọc bởi màng bao<br /> chitosan. Nghiên cứu của Darmadji và Izumimoto<br /> (1994) cho thấy chitosan có thể ngăn chặn quá trình<br /> oxy hóa ở thịt bò trong quá trình bảo quản lạnh. Tác<br /> dụng chống oxy hóa của chitosan cũng đã được thử<br /> <br /> TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo: Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang<br /> Phan Đình Thụy: Sinh viên Khóa 49 Ngành Công nghệ Chế biến Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang<br /> <br /> 10 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> nghiệm trên cá trích (Clupea harengus) nấu chín,<br /> bảo quản ở 40C trong 8 ngày, so sánh với các mẫu<br /> đối chứng sử dụng butylated hydroxyanisol (BHA)<br /> và butylated hydroxytoluene (BHT) (Kamil và cộng<br /> sự, 2002). Kết quả nghiên cứu của Jeon và cộng sự<br /> (2002) cho thấy cả ba mẫu chitosan có độ deacetyl<br /> (DA) và khối lượng phân tử (Mw) khác nhau<br /> (DA = 86,4%, Mw = 1,8 × 103 kDa; DA = 89,3%,<br /> Mw = 9,6 × 102 kDa; DA = 91,3%, Mw = 6,6 × 102 kDa)<br /> đều có hiệu quả ngăn chặn quá trình oxy hóa lipid<br /> trên cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua) và cá<br /> trích (C. harengus) bảo quản ở 4oC trong 12 ngày.<br /> Kim và Thomas (2007) đã nghiên cứu kéo dài thời<br /> hạn bảo quản của cá hồi bằng cách xử lý với chitosan có khối lượng phân tử 30, 90 và 120 kDa ở<br /> các nồng độ thay đổi từ 0,2 - 1%. Nhiều nghiên cứu<br /> cho thấy khối lượng phân tử và độ deacetyl có ảnh<br /> hưởng đáng kể đến hoạt tính chống oxy hóa của<br /> chitosan, chitosan có khối lượng phân tử thấp và độ<br /> deacetyl càng cao thì hoạt tính chống oxy hóa càng<br /> tăng (Xia và cộng sự, 2011).<br /> Việt Nam là nước xuất khẩu tôm nên có tiềm<br /> năng lớn về sản xuất và ứng dụng chitosan từ phế<br /> liệu chế biến tôm. Nhiều nghiên cứu sản xuất thành<br /> công chitin, chitosan từ phế liệu chế biến tôm ở Việt<br /> Nam và ứng dụng của chitosan sản xuất được vào<br /> bảo quản hạt giống, xử lý nước thải, bảo quản quản<br /> một số loại thực phẩm như thịt bò, mực, sữa, trứng<br /> gà, cà chua,... (Trung và cộng sự, 2011). Tuy nhiên,<br /> những nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của<br /> chitosan còn rất hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu này đã<br /> đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của chitosan thủy<br /> phân bằng acid sulfuric ở các nồng độ và trong các<br /> khoảng thời gian khác nhau để làm cơ sở thiết lập<br /> quy trình sản xuất chitosan có hoạt tính chống oxy<br /> hóa nhằm nâng cao giá trị sử dụng của chitosan.<br /> II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên vật liệu và hóa chất<br /> Chitosan sử dụng trong nghiên cứu này được<br /> chiết tách từ vỏ tôm thẻ chân trắng có các chỉ tiêu<br /> chất lượng như sau:<br /> - Màu sắc: trắng ngà;<br /> - Độ deacetyl: 80,66%;<br /> - Độ ẩm: 11,95%;<br /> - Hàm lượng tro: 0,92%;<br /> - Hàm lượng protein: 0,95%.<br /> <br /> Soá 4/2012<br /> Gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)<br /> có độ tinh khiết 85%, được sản xuất bởi công ty<br /> hóa chất Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ. Các hóa chất gồm<br /> NaOH, H2SO4 và CH3COOH có độ tinh khiết lần lượt<br /> là 99%; 96,5% và 99,9%, tất cả đều được sản xuất<br /> bởi công ty Hóa chất Guanghua, Trung Quốc.<br /> 2. Thủy phân chitosan bằng H2SO4<br /> Hòa tan 2g chitosan trong 100 ml dung dịch acid<br /> acetic 1% tạo thành dung dịch keo chitosan 2%.<br /> Mỗi mẫu thí nghiệm sử dụng 100 ml dung dịch keo<br /> chitosan 2% trộn với 100ml dung dịch acid H2SO4<br /> có nồng độ lần lượt là 100mM, 300 mM và 500mM.<br /> Các mẫu hỗn hợp sau khi phối trộn được khuấy<br /> đều rồi đưa đi thủy phân ở 30 ± 2oC trong khoảng<br /> thời gian từ 12 - 72 giờ. Hỗn hợp sau khi thủy phân<br /> được trung hòa bằng dung dịch NaOH có nồng độ<br /> tương ứng là 100 mM, 300 mM và 500 mM. Kết tủa<br /> chitosan tạo thành được tách ra khỏi hỗn hợp, rửa<br /> đến pH trung tính, sấy khô rồi đưa đi phân tích hoạt<br /> tính chống oxy hóa, độ deacetyl và hiệu suất thu hồi<br /> chitosan thủy phân.<br /> 3. Phương pháp phân tích<br /> - Hiệu suất thu hồi được xác định theo công<br /> thức sau:<br /> Hiệu suất thu hồi = (W/Wo) × 100 (%)<br /> Wo: khối lượng chitosan đem đi thủy phân (g).<br /> W: khối lượng chitosan thủy phân thu được (g).<br /> - Độ deacetyl của chitosan được xác định theo<br /> phương pháp của Alonso và cộng sự (1993).<br /> - Khả năng khử gốc tự do DPPH của chitosan<br /> được xác định theo phương pháp của Fu và cộng<br /> sự (2002).<br /> - Tổng năng lực khử của chitosan được xác<br /> định theo phương pháp của Oyaizu (1986).<br /> 4. Phương pháp xử lý số liệu<br /> Số liệu trình bày trong bài báo này là giá trị<br /> trung bình của 3 lần thí nghiệm. Sử dụng phần mềm<br /> Microsoft Excel 2003 để tính giá trị trung bình và<br /> vẽ đồ thị. Sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê<br /> (p < 0,05) của các giá trị trung bình được phân tích<br /> trên phần mềm thống kê R phiên bản 2.13.1.<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> 1. Hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân<br /> Hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân bằng acid<br /> sulfuric ở các nồng độ khác nhau theo thời gian<br /> được trình bày trên đồ thị hình 1.<br /> <br /> TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 11<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 4/2012<br /> <br /> Hình 1. Ảnh hưởng của nồng độ acid sulfuric và thời gian<br /> thủy phân đến hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân<br /> <br /> Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ acid sulfuric và thời gian<br /> thủy phân đến độ deacetyl của chitosan thủy phân<br /> <br /> Kết quả nghiên cứu ở đồ thị hình 1 cho thấy<br /> hiệu suất thu hồi chitosan giảm dần theo thời gian<br /> thủy phân. Khi tăng nồng độ acid sulfuric dùng để<br /> thủy phân đã làm giảm đáng kể hiệu suất thu hồi<br /> chitosan. Hiệu suất thu hồi chitosan sau 12 giờ thủy<br /> phân bằng acid sulfuric 250 mM chỉ còn 69 ± 4%,<br /> trong khi đó hiệu suất thu hồi ở các mẫu thủy phân<br /> bằng 150 mM và 50 mM lần lượt là 81 ± 2% và<br /> 89 ± 2%. Nguyên nhân là do trong môi trường acid<br /> sulfuric loãng, chitosan bị thủy phân cắt mạch<br /> polymer tạo ra các sản phẩm khác nhau bao gồm<br /> chitosan có khối lượng phân tử thấp, oligochitosan<br /> hoặc glucosamin (Zamani và Taherzadeh, 2010). Tỷ<br /> lệ giữa các thành phần này phụ thuộc vào nồng độ<br /> acid và thời gian thủy phân. Khi tăng nồng độ acid<br /> và kéo dài thời gian thủy phân, lượng oligochitosan<br /> và glucosamin tạo ra càng nhiều nên bị thất thoát<br /> trong quá trình kết tủa và rửa càng lớn, dẫn đến<br /> hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân giảm.<br /> <br /> Zamani và Taherzadeh (2010) đã chứng minh<br /> rằng quá trình deacetyl xảy ra đồng thời với quá<br /> trình thủy phân cắt mạch polymer của chitosan khi<br /> xử lý bằng acid sulfuric loãng. Kết quả nghiên cứu<br /> ở đồ thị hình 2 cho thấy độ deacetyl của chitosan<br /> tăng lên đáng kể sau 24 giờ thủy phân ở các nồng<br /> độ acid sulfuric khác nhau. Mức độ deacetyl của<br /> chitosan trong quá trình thủy phân phụ thuộc<br /> rất nhiều vào nồng độ acid sulfuric. Độ deacetyl<br /> của chitosan sau 24 giờ thủy phân bằng 50µM,<br /> 150µM và 250µM acid sulfuric đạt lần lượt là<br /> 85,3 ± 0,6%; 87,4 ± 0,4% và 89,1 ± 0,3%. Khi kéo<br /> dài thời gian thủy phân đến 48 giờ độ deacetyl của<br /> chitosan ở các mẫu đều không tăng thêm (p > 0,05).<br /> <br /> 2. Độ deacetyl của chitosan thủy phân<br /> Độ deacetyl của chitosan thủy phân bằng acid<br /> sulfuric ở các nồng độ khác nhau theo thời gian<br /> được trình bày trên đồ thị hình 2.<br /> <br /> 3. Hoạt tính chống oxy hóa của chitosan<br /> thủy phân<br /> Hoạt tính chống oxy hóa của chitosan được<br /> đánh giá dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH và<br /> tổng năng lực khử. Khả năng khử gốc tự do DPPH<br /> và tổng năng lực khử của chitosan thủy phân bằng<br /> acid sulfuric ở các nồng độ khác nhau theo thời gian<br /> được trình bày trên đồ thị hình 3.<br /> <br /> Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ acid sulfuric và thời gian thủy phân đến<br /> khả năng khử gốc tự do DPPH (a) và tổng năng lực khử (b) của chitosan thủy phân<br /> <br /> 12 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng khử<br /> gốc tự do DPPH (hình 3a) và tổng năng lực khử<br /> (hình 3b) của chitosan thủy phân bằng acid sulfuric<br /> tăng dần theo thời gian thủy phân và nồng độ acid<br /> sulfuric. Khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng<br /> năng lực khử của chitosan đạt cực đại sau 24 giờ<br /> thủy phân ở các nồng độ acid sulfuric khác nhau.<br /> Xie và cộng sự (2001) chứng minh rằng khả năng<br /> khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của<br /> chitosan phụ thuộc vào nhóm amino (-NH2) trong<br /> phân tử chitosan, số lượng nhóm amino trong phân<br /> tử chitosan càng nhiều thì khả năng khử gốc tự do<br /> DPPH và tổng năng lực khử của chitosan càng lớn.<br /> Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy khả năng<br /> khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của<br /> chitosan thủy phân phụ thuộc vào độ deacetyl. Độ<br /> deacetyl của chitosan càng cao thì khả năng khử<br /> gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử càng lớn.<br /> Từ kết quả nghiên cứu trên đề xuất quy trình<br /> sản xuất chitosan thủy phân có hoạt tính chống oxy<br /> hóa như sơ đồ hình 4.<br /> <br /> Soá 4/2012<br /> Thuyết minh quy trình:<br /> Hòa tan chitosan trong dung dịch acid acetic<br /> 1% tạo thành dung dịch keo chitosan 2%. Sau<br /> đó, trộn dụng dịch H 2SO 4 500 mM với dung dịch<br /> chitosan 2% theo tỷ lệ thể tích dung dịch H 2SO 4<br /> 500 mM/dung dịch chitosan 2% là 1/1. Hỗn hợp<br /> sau khi phối trộn được khuấy đều rồi đưa đi<br /> thủy phân ở ở nhiệt độ 30 ± 2 oC trong 24 giờ.<br /> Hỗn hợp sau khi thủy phân được điều chỉnh về<br /> pH = 8 bằng dung dịch NaOH 500 mM. Kết tủa<br /> chitosan tạo thành được lọc tách ra khỏi hỗn<br /> hợp, rửa đến pH trung tính, sấy khô thu được<br /> chitosan thủy phân có hoạt tính chống chống<br /> oxy hóa (hình 5).<br /> <br /> Chitosan<br /> <br /> Chuẩn bị dung dịch chitosan 2%<br /> trong acid acetic 1%<br /> <br /> Thủy phân bằng H2SO4 250 mM<br /> trong 24 giờ ở 30 ± 2oC<br /> <br /> Kết tủa bằng NaOH 500 mM<br /> ở pH = 8<br /> <br /> Lọc tách kết tủa<br /> <br /> Rửa kết tủa đến pH trung tính<br /> <br /> Sấy khô<br /> <br /> Chitosan thủy phân có hoạt tính<br /> chống oxy hóa<br /> Hình 4. Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan thủy phân có hoạt<br /> tính chống oxy hóa<br /> <br /> Hình 5. Sản phẩm chitosan thủy phân có hoạt tính chống<br /> oxy hóa<br /> <br /> IV. KẾT LUẬN<br /> Chitosan thủy phân bằng acid H2SO4 có hoạt<br /> tính chống oxy hóa. Điều kiện thủy phân thích hợp<br /> để thu được chitosan có hoạt tính chống oxy hóa là:<br /> - Nồng độ acid H2SO4: 250 mM;<br /> - Thời gian thủy phân: 24 giờ;<br /> - Nhiệt độ thủy phân: 30 ± 2oC.<br /> <br /> TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 13<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 4/2012<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Tiếng Việt<br /> 1.<br /> <br /> Trang Sĩ Trung, Trần Thị Luyến, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Hằng Phương, 2011. Chitin-chitosan từ phế liệu thủy sản và<br /> ứng dụng. NXB Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> Alonso, I. G., Peniche-Covas, C., Nieto, J. M., 1993. Determination of the degree of acetylation of chitin and chitosan by<br /> thermal analysis. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 28, 193-198.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> Balicka-Ramisz, A., Wojtasz-Pajak, A., Pilarczyk, B., Ramisz, A., Laurans, L., 2005. Antibacterial and antifungal activity of<br /> chitosan. ISAH - Warsaw, Poland, 2, 406-408.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> Darmadji, P., Izumimoto, M., 1994. Effect of chitosan in meat preservation. Meat Science, 38(2), 243-254.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Fu, H., Shieh, D., Ho, C., 2002. Antioxidant and free radical scavenging activities of edible mushrooms. Journal of Food<br /> lipids, 9, 35-46.<br /> <br /> 6.<br /> <br /> Jeon, Y. I., Kamil, J. Y. V. A., Shahidi, F., 2002. Chitosan as an edible invisible film for quality preservation of herring and<br /> Atlantic cod. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 20, 5167-5178.<br /> <br /> 7.<br /> <br /> Kamil, Y. V. V. A., Jeon, Y. J., Shahidi, F., 2002. Antioxidative activity of chitosans of different viscosity in cooked<br /> comminuted flesh of herring (Clupea harengus). Food Chemistry, 79, 69-77.<br /> <br /> 8.<br /> <br /> Kim, K. W., Thomas, R. L., 2007. Antioxidative activity of chitosans with varying molecular weights. Food Chemistry, 101,<br /> 308-313.<br /> <br /> 9.<br /> <br /> Oyaizu, M., 1986. Studies on products of browning reactions: antioxidative activities of products of browning reaction<br /> prepared from glucosamine. Japanese Journal of Nutrition, 44, 307-315.<br /> <br /> Tiếng Anh<br /> <br /> 10. Xia, W., Liu, P., Zhang, J., Chen, J., 2011. Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides. Food Hydrocolloids,<br /> 25 (2), 170-179.<br /> 11. Xie, W., Xu, P., Liu, Q., 2001. Antioxidant activity of water-soluble chitosan derivatives. Bioorganic & Medicinal Chemistry<br /> Letters, 11, 1699-1701.<br /> 12. Zamani, A., Taherzadeh, M. J., 2010. Production of low molecular weight chitosan by hot dilute sulfuric acid. BioResources,<br /> 5 (3), 1554-1564.<br /> <br /> 14 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG<br /> <br />