Hoạt tính diệt và xua đuổi muỗi vằn (Aedes aegypti) của tinh dầu quả hồ tiêu (Piper nigrum L.)

Chia sẻ: Liễu Yêu Yêu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu "Hoạt tính diệt và xua đuổi muỗi vằn (Aedes aegypti) của tinh dầu quả hồ tiêu (Piper nigrum L.)" nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc hướng tới sử dụng tinh dầu quả hồ tiêu trong kiểm soát, hạn chế sự phát triển và lây lan bệnh của muỗi vằn. Kết quả cho thấy, hiệu suất của tinh dầu quả hồ tiêu tăng theo thời gian chưng cất và đạt 0,83% sau 180 phút. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Hoạt tính diệt và xua đuổi muỗi vằn (Aedes aegypti) của tinh dầu quả hồ tiêu (Piper nigrum L.)

HOẠT TÍNH DIỆT VÀ XUA ĐUỔI MUỖI VẰN (AEDES AEGYPTI) CỦA TINH DẦU QUẢ HỒ TIÊU (PIPER NIGRUM L.) Trần Thanh Hùng1, Nguyễn Thị Quỳnh Dung1 1. Viện Phát triển Ứng dụng, Trường Đại học Thủ Dầu Một TÓM TẮT Muỗi vằn (Aedes aegypti) là vật trung gian của nhiều loại bệnh nguy hiểm ở người. Các loại thuốc hóa học hiện nay được sử dụng để kiểm soát muỗi vằn tiềm ẩn những tác động xấu đến môi trường và sức khỏe con người. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành chiết xuất tinh dầu quả hồ tiêu (Piper nigrum L.) và khảo sát hoạt tính diệt và xua đuổi muỗi vằn của tinh dầu này nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc hướng tới sử dụng tinh dầu quả hồ tiêu trong kiểm soát, hạn chế sự phát triển và lây lan bệnh của muỗi vằn. Kết quả cho thấy, hiệu suất của tinh dầu quả hồ tiêu tăng theo thời gian chưng cất và đạt 0,83% sau 180 phút. Tinh dầu quả hồ tiêu có hiệu quả trong diệt muỗi vằn trưởng thành, với nồng độ 16 µg/cm3 gây ra tỷ lệ chết 97,78% số cá thể xử lý sau 1 giờ. Tinh dầu quả hồ tiêu cũng thể hiện tác động xua đuổi mạnh đối với muỗi vằn trưởng thành, ở nồng độ 3 µg/cm3 có khả năng xua đuổi 81,41% số cá thể xử lý sau 1 giờ. Các nghiên cứu tiếp theo cần được thực hiện để sử dụng hiệu quả tinh dầu quả hồ tiêu trong kiểm soát muỗi vằn, bảo vệ sức khỏe con người và môi trường. Từ khóa: hoạt tính diệt muỗi, hoạt tính xua đuổi muỗi, muỗi vằn, quả hồ tiêu, tinh dầu. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Hồ tiêu (Piper nigrum L.) là một loài thực vật chứa tinh dầu thuộc họ hồ tiêu (Piperaceae), có quả được sử dụng làm gia vị và làm thuốc ở nhiều nước trên thế giới. Hồ tiêu còn được sử dụng trong mục đích bảo quản và kiểm soát sinh học (Srivastava và nnk, 2017). Các chiết xuất và tinh dầu quả hồ tiêu được chứng tỏ có hoạt tính kháng nhiều loài côn trùng khác nhau như sâu khoang (Spodoptera litura), mọt đỏ (Tribolium castaneum), mọt đậu nành (Acanthoscelides obtectus), và muỗi Culex (Culex quinquefasciatus) (Fan và nnk, 2011; Nath và nnk, 2006; Srivastava và nnk, 2017). Muỗi vằn (Aedes aegypti) là vật trung gian của nhiều loại bệnh nguy hiểm ở người như sốt xuất huyết, zika và sốt vàng da. Do đó, kiểm soát muỗi vằn là một biện pháp quan trọng trong việc ngăn ngừa các loại bệnh này. Các chất diệt và xua đuổi muỗi đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát muỗi vằn, và sử dụng thuốc hóa học để diệt và xua đuổi muỗi thành là biện pháp chủ yếu hiện nay. Đây là biện pháp được xem là hiệu quả cao, tuy nhiên trong những năm gần đây đã phát sinh những vấn đề đáng lo ngại do các tác động xấu của chúng đối với môi trường và sức khỏe của con người cũng như hiện tượng phát sinh ngày càng nhiều các quần thể muỗi kháng thuốc (Kalita và nnk, 2013; Pavela, 2015; Senthil-Nathan, 2019). Các hợp chất tự nhiên vừa có hiệu lực tốt vừa thân thiện môi trường đã được đề xuất như là một biện pháp thay thế (Kalita và nnk, 2013; Nerio và nnk, 2010). 229
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh hoạt tính diệt và xua đuổi muỗi vằn (Ae. aegypti) của tinh dầu chiết xuất từ quả cây hồ tiêu (P. nigrum) trồng ở Bình Dương nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho các biện pháp sử dụng tinh dầu này trong việc kiểm soát muỗi vằn, hạn chế sự phát triển, lan truyền của bệnh do muỗi gây ra. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chuẩn bị mẫu vật Quả hồ tiêu tươi được thu hái từ những cây hồ tiêu trưởng thành trồng ở Xã Tân Hiệp, huyện Phú Giáo, tỉnh Bình Dương. Tên khoa học được kiểm tra bằng phương pháp so sánh hình thái sử dụng tài liệu Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ (2003) và được chuẩn hóa dựa trên Cơ sở dữ liệu The Plant List (theplantlist.org). Mẫu thực vật được lưu tại Phòng thí nghiệm Sinh học, trường Đại học Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương. Trứng muỗi vằn được cung cấp bởi Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh. Trứng muỗi được cho vào các hộp nhựa (Ø 15x7,5 cm) chứa nước sạch đã khử Clo và được phủ một lớp vải màn để tạo điều kiện cho nở thành bọ gậy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Bọ gậy nở từ trứng được nuôi bằng gan lợn chín và được thay nước sạch hàng ngày. Muỗi trưởng thành được nuôi bằng dung dịch đường 10% trong lồng (Ø 40x40x40 cm) được phủ một lớp vải màn. Bọ gậy 4 ngày tuổi và muỗi trưởng thành 5 ngày tuổi được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Chiết xuất tinh dầu quả hồ tiêu Quả hồ tiêu được rửa sạch, để ráo nước ở nhiệt độ phòng, và sau đó được xay nhuyễn tạo nguyên liệu để thu nhận tinh dầu. Tinh dầu được chiết xuất theo phương pháp lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nước sử dụng bộ thiết bị chưng cất tinh dầu Clevenger Apparatus với bình cầu thủy tinh 6000 mL. Lượng tinh dầu quả hồ tiêu được ghi nhận qua các khoảng thời gian chưng cất 30, 60, 120, và 180 phút. Hiệu suất tinh dầu được tính dựa trên khối lượng tươi của mẫu vật. Tinh dầu được làm khô bằng Na2SO4 khan và được bảo quản trong lọ thủy tinh tối màu ở nhiệt độ -20oC đến khi sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng muỗi vằn. Khảo sát hoạt tính diệt muỗi vằn trưởng thành của tinh dầu quả hồ tiêu Đối tượng được sử dụng để khảo sát trong thí nghiệm này là muỗi vằn trưởng thành 5 ngày tuổi. Các nghiệm thức được bố trí trong lọ nhựa trong suốt. Tinh dầu được pha loãng trong ethanol tuyệt đối với các nồng độ khác nhau 1 - 16 μg/cm3. Đối chứng âm sử dụng ethanol tuyệt đối. 30 µL mỗi dung dịch tinh dầu và đối chứng được dàn lên đĩa giấy thấm (d = 3 cm). Các đĩa giấy thấm dung dịch tinh dầu hoặc ethanol được gắn trên phần nắp lọ và để bay hơi tự nhiên 1 phút. Sau đó, nắp lọ được gắn lên mỗi lọ đã chứa sẵn 15 cá thể muỗi vằn trưởng thành được ngăn cách với nắp lọ bằng lớp vải màn để muỗi không tiếp xúc với giấy thấm. Lọ thí nghiệm và đối chứng được bao bọc kín bằng màng nylon. Tỷ lệ chết của muỗi được ghi nhận sau 1 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Khảo sát hoạt tính xua đuổi muỗi vằn trưởng thành của tinh dầu quả hồ tiêu Các nghiệm thức được bố trí trong hệ thống thí nghiệm xua đuổi muỗi được thiết kế gồm hai hộp nhựa trong suốt được nối với nhau bằng một đường ống nhựa có chất liệu tương tự. 230
Ống nối này được ngăn ở giữa bởi 2 vách ngăn trượt tạo thành 1 buồng nhỏ là nơi cho muỗi vào để tiến hành thí nghiệm. Tinh dầu được pha trong ethanol với các nồng độ khác nhau 1,2 – 3,0 µg/cm3 và 50 µL mỗi dung dịch này được nhỏ lên đĩa giấy thấm (d = 5 cm). Sau khi để khô tự nhiên 1 phút, mỗi đĩa giấy thấm tinh dầu được đặt vào một hộp của hệ thống. Hộp còn lại của hệ thống được cho vào một đĩa giấy thấm 50 µL ethanol đã để khô tự nhiên 1 phút. Sau khi 30 cá thể muỗi vằn trưởng thành được cho vào buồng nhỏ ở ống nối, vách ngăn được kéo lên để cho muỗi có thể di chuyển về mỗi hộp. Số lượng muỗi ở mỗi hộp được ghi nhận sau 1 giờ xử lý. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Hiệu lực xua đuổi muỗi được tính theo công thức H = [(% muỗi trong hộp không có tinh dầu - % muỗi trong hộp có tinh dầu)/(100 - % muỗi trong hộp có tinh dầu)] x 100 (Tripathi et al., 2004). Xử lý số liệu: Các thí nghiệm được thiết kế lặp lại 3 lần, và giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SE) được trình bày. Phương pháp phân tích phương sai một nhân tố (One-way ANOVA) và phương pháp so sánh nhiều cặp Bonferroni (Bonferroni's Multiple Comparison Test) được sử dụng để phân tích sự khác biệt giữa các nghiệm thức sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hiệu suất của tinh dầu quả hồ tiêu: Tinh dầu quả hồ tiêu có màu vàng, trong suốt, có mùi thơm đặc trưng, dịu nhẹ, và có tỷ trọng 0,82 g/mL. Hiệu suất thu nhận tinh dầu quả hồ tiêu tăng dần theo thời gian chưng cất được ghi nhận ở hình 1. Trong khoảng thời gian từ 30 phút đến 60 phút hàm lượng tinh dầu tăng từ 0,5% đến 0,69% với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Hiệu suất thu tinh dầu quả hồ tiêu ở 120 và 180 phút lần lượt là 0,76 và 0,83%, cao hơn nhưng không có ý nghĩa thống kê so với hiệu suất tinh dầu thu nhận được ở thời gian 60 phút (P > 0,05). ns , 1.0 ns ns 0.8 , HiÖu suÊt tinh dÇu (%) * 0,83 0,76 0.6 , 0,69 0,50 0.4 , , 0.2 , 0.0 0 30 60 90 120 150 180 210 Thêi gian ch-ng cÊt (phót) Hình 1. Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hiệu suất thu nhận tinh dầu quả hồ tiêu. “ns” chỉ sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05); “*” chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P < 0,05 được xác định bằng phương pháp so sánh nhiều cặp Bonferroni. Các nghiên cứu trước cũng chứng tỏ hàm lượng tinh dầu thu được tăng theo thời gian chưng cất, tuy nhiên khi quá trình chưng cất kéo dài thì hàm lượng có thể tăng không đáng kể hoặc giảm (Nguyễn Thiện Chí và nnk, 2016; Thien Hien Tran và nnk, 2019). Hiệu suất tinh dầu tiêu trắng 231
tăng mạnh trong khoảng thời gian 60 – 120 phút với hiệu suất cao nhất tại 120 phút và sau đó hiệu suất tinh dầu giảm dần (Thien Hien Tran và nnk, 2019). Hàm lượng tinh dầu lá trầu không (Piper betel L.) tăng mạnh khi thời gian chưng cất tăng cho đến thời gian 240 phút và sau đó hàm lượng tinh dầu tuy thu được nhiều hơn nhưng không đáng kể (Nguyễn Thiện Chí và nnk, 2016). Hoạt tính diệt muỗi vằn của tinh dầu quả hồ tiêu: Kết quả khảo sát hoạt tính diệt muỗi vằn trưởng thành của tinh dầu quả hồ tiêu được thể hiện ở hình 2. Tỷ lệ chết của muỗi trưởng thành sau 1 giờ xử lý tăng dần theo nồng độ của tinh dầu quả hồ tiêu và có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức (P < 0,0001) khi sử dụng phương pháp phân tích ANOVA trong khi đối chứng âm không có tác động gây chết đối với muỗi vằn trưởng thành. Ở nồng độ 1 µg/cm3 tỷ lệ chết của muỗi trưởng thành thấp nhất (28,89%). Tỷ lệ chết của muỗi trưởng thành tăng mạnh từ 44,44% đến 95,56% tương ứng nồng độ tinh dầu tăng từ 2 µg/cm3 đến 8 µg/cm3. Nồng độ 16 µg/cm3 gây ra tỷ lệ chết của muỗi trưởng thành cao nhất với 97,78% số cá thể chết sau 1 giờ xử lý nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa so với tỷ lệ muỗi chết ở nồng độ tinh dầu 8 µg/cm3 (P < 0,05). ns * 97,78 100 95,55 *** 80,00 80 Tû lÖ chÕt cña muçi (%) 60 * 44,44 *** 40 28,89 20 0,00 0 0 1 2 4 8 16 3 Nång ®é tinh dÇu (µg/cm ) Hình 2. Tỷ lệ chết của muỗi vằn trưởng thành ở các nồng độ khác nhau của tinh dầu quả hồ tiêu sau 1 giờ xử lý. “ns” chỉ sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05); “*” chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P < 0,05; “***” chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P < 0,001 được xác định bằng phương pháp so sánh nhiều cặp Bonferroni. Các nghiên cứu trước đã chứng tỏ hoạt tính diệt muỗi của dịch chiết quả hồ tiêu. Dịch chiết quả hồ tiêu (Piper nigrum) được cho thấy có hiệu quả đối với ấu trùng của hai loài muỗi Ae. albopictus và Culex quinquefasciatus với giá trị nồng độ gây chết 90% (LC90) lần lượt là 6,8 và 8,4 ppm (Nath và nnk, 2006). Dịch chiết ethanol của quả hồ tiêu (P. nigrum) cũng có hiệu quả diệt ấu trùng tuổi 3 – 4 của muỗi vằn (Ae. aegypti) với giá trị LC50 = 7,12 ppm (Santiago et al., 2015). 232
Hoạt tính xua đuổi muỗi vằn của tinh dầu quả hồ tiêu (Piper nigrum L.): Tỷ lệ phân bố của muỗi vằn trưởng thành trong hệ thống xua đuổi muỗi và hiệu lực xua đuổi muỗi của tinh dầu quả hồ tiêu ở các nồng độ khác nhau sau 1 giờ xử lý được trình bày ở bảng 1. Kết quả cho thấy, tỷ lệ phần trăm muỗi vằn trưởng thành phân bố ở hộp có xử lý tinh dầu giảm dần theo nồng độ tinh dầu quả hồ tiêu và thấp hơn có ý nghĩa thống kê (P < 0,001) so với tỷ lệ muỗi vằn phân bố trong hộp không có xử lý tinh dầu. Hiệu lực xua đuổi muỗi vằn trưởng thành sau 1 giờ xử lý tăng theo nồng độ của tinh dầu và thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức (P < 0,01) khi phân tích ANOVA. Ở nồng độ 1,2 µg/cm3, tinh dầu quả hồ tiêu có hiệu lực xua đuổi muỗi thấp nhất (38,89%). Khi tăng nồng độ tinh dầu đến 1,8 µg/cm3, hiệu lực xua đuổi muỗi đạt 56,93 %, cao hơn không có ý nghĩa thống kê so với hiệu lực xua đuổi muỗi gây ra bởi nồng độ tinh dầu 1,2 µg/cm3 (Bảng 1). Tinh dầu quả hồ tiêu ở nồng độ 2,4 – 3,0 µg/cm3 biểu hiện tác động xua đuổi cao với hiệu lực xua đuổi đạt 78,33 - 81,41%, cao hơn có ý nghĩa so với các nồng độ còn lại (P < 0,05) (Bảng 1). Bảng 1. Tỷ lệ phân bố của muỗi vằn và hiệu lực xua đuổi muỗi vằn của tinh dầu quả hồ tiêu ở các nồng độ khác nhau sau 1 giờ xử lý Nồng độ tinh dầu Tỷ lệ phân bố của muỗi vằn (%) Hiệu lực xua đuổi (%) (µg/cm3) Hộp không có tinh dầu Hộp có tinh dầu 1,2 62,22 ± 2,22a 37,78 ± 2,22a, *** 38,89 ± 5,56a a a, *** 1,8 70,00 ± 1,92 30,00 ± 1,92 56,93 ± 3,94a 2,4 82,22 ± 1,11b 17,78 ± 1,11b, *** 78,33 ± 1,67b 3,0 84,45 ± 2,22b 15,56 ± 2,22b, *** 81,41 ± 3,21b Chú thích: Giá trị trung bình ± SE trong mỗi cột được theo sau bởi các chữ cái khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05), “***” chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P < 0,001 giữa tỷ lệ phân bố muỗi vằn trong hộp có tinh dầu so với hộp không có tinh dầu ở mỗi nồng độ tinh dầu được xác định bằng phương pháp so sánh nhiều cặp Bonferroni. Tinh dầu quả hồ tiêu cũng được chứng tỏ có hoạt tính xua đuổi mạnh bởi nghiên cứu trước. Tinh dầu quả hồ tiêu ở Thái Lan có tác động xua đuổi mạnh đối với trưởng thành của 4 loài muỗi Ae. aegypti, Ae. albopictus, Anopheles dirus và C. quinquefasciatus với hiệu lực xua đuổi dao động từ 2,3 – 8 giờ (Tawatsin và nnk, 2006). Tinh dầu này cũng biểu hiện tác động xua đuổi đẻ trứng mạnh đối với loài muỗi Ae. aegypti với hiệu lực xua đuổi 82% (Tawatsin và nnk, 2006). Tinh dầu quả hồ tiêu (Piper nigrum L.) biểu hiện tác động diệt và xua đuổi mạnh đối với muỗi vằn trưởng thành. Với nồng độ 16 µg/cm3, tinh dầu quả hồ tiêu gây ra tỷ lệ chết 97,78% số cá thể xử lý sau 1 giờ, và ở nồng độ 3 µg/cm3, tinh dầu này có khả năng xua đuổi 81,41% số cá thể xử lý sau 1 giờ. Các nghiên cứu tiếp theo cần được thực hiện để sử dụng hiệu quả tinh dầu quả hồ tiêu trong kiểm soát muỗi vằn, bảo vệ sức khỏe con người và môi trường. KẾT LUẬN Tinh dầu quả hồ tiêu (Piper nigrum L.) biểu hiện tác động diệt và xua đuổi mạnh đối với muỗi vằn trưởng thành. Với nồng độ 16 µg/cm3, tinh dầu quả hồ tiêu gây ra tỷ lệ chết 97,78% số cá thể xử lý sau 1 giờ, và ở nồng độ 3 µg/cm3, tinh dầu này có khả năng xua đuổi 81,41% số cá thể xử lý sau 1 giờ. Các nghiên cứu tiếp theo cần được thực hiện để sử dụng hiệu quả tinh dầu quả hồ tiêu trong kiểm soát muỗi vằn, bảo vệ sức khỏe con người và môi trường. 233
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Thiện Chí, Nguyễn Thị Ngọc Châm , Phạm Khánh Ngọc , Đỗ Duy Phúc , Dương Tùng Kha và Nguyễn Thị Thu Thủy (2016). Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá trầu không (Piper betel L.), họ hồ tiêu (Piperaceae). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, (45), 28-32. 2. Fan, L. S., Muhamad, R., Omar, D., & Rahmani, M. (2011). Insecticidal Properties of Piper nigrum Fruit Extracts and Essential Oils against Spodoptera litura. International Journal of Agriculture & Biology, 13(4). 3. Phạm Hoàng Hộ (2003). Cây cỏ Việt Nam. TP. Hồ Chí Minh: Nhà xuất bản Trẻ. 4. Kalita, B., Bora, S., & Sharma, A. K. (2013). Plant essential oils as mosquito repellent-a review. IJRDPL, 3, 143-150. 5. Đỗ Tất Lợi (2003). Những cây thuốc và vị thốc Việt Nam. Hà Nội: Nhà xuất bản Y học. 6. Nath, D. R., Bhuyan, M., & Goswami, S. (2006). Botanicals as mosquito larvicides. Defence Science Journal, 56(4), 507.26 7. Nerio, L. S., Olivero-Verbel, J., & Stashenko, E. (2010). Repellent activity of essential oils: a review. Bioresource technology, 101(1), 372-378. 8. Pavela, R. (2015). Essential oils for the development of eco-friendly mosquito larvicides: a review. Industrial crops and products, 76, 174-187. 9. Santiago, V. S., Alvero, R. G., & Villaseñor, I. M. (2015). Aedes aegypti larvicide from the ethanolic extract of Piper nigrum black peppercorns. Natural product research, 29(5), 441-443. 10. Senthil-Nathan, S. (2019). A Review of Resistance Mechanisms of Synthetic Insecticides and Botanicals, Phytochemicals, and Essential Oils as Alternative Larvicidal Agents Against Mosquitoes. Frontiers in Physiology, 10. 11. Srivastava, A. K., & Singh, V. K. (2017). Biological action of Piper nigrum-the king of spices. European Journal of biological research, 7(3), 223-233. 12. Tawatsin, A., Asavadachanukorn, P., Thavara, U., Wongsinkongman, P., Bansidhi, J., Boonruad, T., ... & Mulla, M. S. (2006). Repellency of essential oils extracted from plants in Thailand against four mosquito vectors (Diptera: Culicidae) and oviposition deterrent effects against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Southeast Asian journal of tropical medicine and public health, 37(5), 915 13. Tran, T. H., Ngo, T. T. Q., Ngan, T. T. K., Lam, T. D., Phat, D. T., Linh, H. T. K., ... & Toan, T. Q. (2019). Manufacturing process for extracting essential oils from white pepper (piper nigrum l.) by hydrodistillation technique. In Solid State Phenomena (Vol. 298, pp. 89-93). Trans Tech Publications Ltd. 14. Tripathi, A. K., Prajapati, V., Ahmad, A., Aggarwal, K. K., & Khanuja, S. P. (2004). Piperitenone oxide as toxic, repellent, and reproduction retardant toward malarial vector Anopheles stephensi (Diptera: Anophelinae). Journal of Medical Entomology, 41(4), 691-698. 234