Khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa của dịch chiết củ cải trắng (Raphanus sativus L)

N. T. Thắm, P. K. Ngọc, N. T. M. Nguyệt, Đ. T. A. Đào, L. T. Hải, N. T. Hà, N. H. Cường / Khả năng…<br /> <br /> KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ CHỐNG OXY HÓA<br /> CỦA DỊCH CHIẾT CỦ CẢI TRẮNG (Raphanus sativus L.)<br /> Nguyễn Thị Thắm (1), Phạm Kim Ngọc (1), (3)<br /> Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2), Đống Thị Anh Đào (1)<br /> 1<br /> Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa TP. Hồ Chí Minh<br /> 2<br /> Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp TP. HCM<br /> 3<br /> Viện Kỹ thuật và Kinh tế biển, Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu<br /> Ngày nhận bài 07/6/2017, ngày nhận đăng 12/10/2017<br /> Tóm tắt: Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định hoạt tính kháng khuẩn và<br /> chống oxi hóa của dịch chiết củ cải trắng được chiết bằng dung môi ethanol 700. Khả<br /> năng kháng khuẩn của dịch chiết được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa<br /> thạch trên 4 chủng vi khuẩn Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas<br /> aeruginosa và Salmonella typhi. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết được xác định<br /> qua khả năng khử gốc tự do ABTS*. Kết quả cho thấy dịch chiết củ cải trắng<br /> (Raphanus sativus L.) được chiết bằng ethanol có khả năng kháng cả 4 chủng vi khuẩn<br /> thử nghiệm, khả năng kháng nhóm vi khuẩn gram âm cao hơn vi khuẩn gram dương<br /> với đường kính vòng kháng khuẩn dao động trong khoảng 8-20 mm trong khoảng nồng<br /> độ khảo sát từ 100-1600 mg/ml. Nồng độ tối thiểu để ức chế vi khuẩn thử nghiệm<br /> (MIC) của cao chiết dao động trong khoảng 20-40 mg/ml. Ngoài ra, cao củ cải trắng<br /> còn có khả năng khử gốc tự do ABTS* với giá trị IC50 là 7,074 g/ml.<br /> <br /> 1. Mở đầu<br /> Theo các tài liệu y học cổ truyền, củ cải trắng có vị ngọt hơi cay, đắng, tính bình,<br /> không độc, có tác dụng long đờm, trừ viêm… được dùng trong chữa trị khá nhiều bệnh<br /> đường hô hấp, ung thư, bệnh đường tiêu hóa [1].<br /> Một số nghiên cứu khoa học công bố gần đây ở nước ngoài cho thấy dịch chiết từ<br /> củ cải trắng trồng ở một số nước khác nhau có khả năng khử các gốc tự do, làm giảm các<br /> quá trình oxi hóa, vốn là nguyên nhân sâu xa gây ra nhiều loại bệnh tật ở người [2, 3, 4].<br /> Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của củ cải trắng cũng được đánh giá cao. Nước ép<br /> và dịch tr ch ly từ củ cải trắng bằng các dung môi khác nhau nước, methanol, ethanol,<br /> ethyl acetate, este dầu h a đã được xác định có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều<br /> loại vi khuẩn và nấm mốc khác nhau [5, 6]. Tuy nhiên, hoạt tính của dịch chiết phụ thuộc<br /> vào giống và đặc điểm nguồn gốc, điều kiện địa lý của vùng trồng.<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính chống oxi hóa và<br /> kháng khuẩn của dịch chiết từ củ cải trắng (Raphanus sativus L.) được thu hái tại huyện<br /> Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam.<br /> 2. Thực nghiệm<br /> 2.1. Thiết bị<br /> Máy đo quang học UV-Vis GENESYS 10S, buồng đếm Ika RV10, máy hút chân<br /> không DOA-P504-BN, tủ sấy PO Box-30605, tủ lắc LM-2575RD, máy cô quay IKR10.<br /> Email: kimngoc080283@gmail.com (P. K. Ngọc)<br /> <br /> 66<br /> <br /> Trường Đại học Vinh<br /> <br /> Tạp chí khoa học, Tập 46, Số 2A (2017), tr. 66-72<br /> <br /> 2.2. Nguyên liệu<br /> Củ cải trắng được thu hái vào tháng 2 năm 2016 tại trang trại thuộc huyện Đức<br /> Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam. Củ cải tươi sau khi thu hoạch được rửa sạch, cắt lát<br /> dày 1-1,2 cm, sấy ở 500C đến khi còn 6-7% ẩm. Củ cải khô sau đó được xay nh , lọt qua<br /> sàng 40 mesh và bảo quản trong túi PE, tránh ánh sáng ở -200C làm mẫu nghiên cứu.<br /> Dòng vi khuẩn thử nghiệm: Bacillus cereus (VTCC 1005), Staphylococcus<br /> aureus (ATCC 6538), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Salmonella typhi (ATCC<br /> 14028).<br /> Hóa chất sử dụng: môi trường MHA (Anh), MHB (Himedia), TSB (Pháp). Kháng<br /> sinh thương mại được dùng làm chất chứng dương gồm ampicillin (10 g/đĩa ,<br /> gentamycin (10 g/đĩa và tetracylin 30 g/đĩa được cung cấp bởi Công ty Nam Khoa.<br /> 2.3. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.3.1. Điều chế cao củ cải trắng<br /> Bột củ cải khô được trích ly bằng dung môi ethanol 70o với tỉ lệ bột: dung môi =<br /> 1:20 g/ml trong 4 giờ ở nhiệt độ 60oC. Dịch trích sau đó được lọc, cô quay đuổi dung môi<br /> hoàn toàn, thu được cao. Cao củ cải trắng chiết bằng ethanol 70o (gọi tắt là cao củ cải)<br /> được bảo quản trong lọ thủy tinh đậy kín ở 40C, tránh ánh sáng để sử dụng cho quá trình<br /> thí nghiệm.<br /> 2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn<br /> Môi trường: sử dụng môi trường MHA thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn.<br /> Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm: giống trước khi sử dụng được tăng sinh<br /> trên môi trường TSB trong 12 giờ ở 37oC, lắc 100 vòng/phút. Huyền phù vi khuẩn sau đó<br /> được ly tâm tách sinh khối và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độ đục tương đương<br /> 0,5 MC Farland. Huyền phù vi khuẩn này sau đó được pha loãng 100 lần bằng nước cất<br /> vô trùng để đạt mật độ 1,5 x 106 CFU/ml dùng trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng<br /> khuẩn [8].<br /> Chuẩn bị dịch kháng khuẩn: cao củ cải trắng được pha trong dung dịch DMSO<br /> 5% vô trùng thành các nồng độ 100, 200, 400, 800 và 1600 mg/ml. Kháng sinh đối<br /> chứng dương gồm ampicillin, gentamycin và tetracylin. Mẫu đối chứng âm là dung dịch<br /> DMSO 5%.<br /> Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bằng phương pháp khuếch tán trên<br /> đĩa thạch. Cho vào mỗi đĩa petri 25 ml môi trường MHA vô trùng (khoảng 40-50oC) và 1<br /> ml dịch vi khuẩn mật độ 1,5 x 106 CFU/ml, lắc đều, để yên khoảng 45 phút cho môi<br /> trường đông đặc. Mỗi đĩa petri được đặt 1 đĩa kháng sinh chứng dương và 6 đĩa giấy<br /> trắng đường kính 6 mm) vô trùng. Cho vào 5 đĩa trắng lần lượt 10 l dịch chiết đã pha<br /> (5 nồng độ) và 1 đĩa còn lại 10 l dung dịch DMSO 5% làm chứng âm. Thí nghiệm được<br /> lặp lại 3 lần. Các đĩa được ủ ở 32oC trong 16-20 giờ. Đường kính vòng ức chế được đo<br /> bằng thước đo đơn vị mm [9,10].<br /> Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimal Inhibitory Concentration) bằng<br /> phương pháp pha loãng trong ống nghiệm với môi trường sử dụng là MHB [11].<br /> 2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa<br /> Hoạt tính chống oxi hóa của cao được xác định thông qua khả năng khử gốc tự do<br /> ABTS* theo phương pháp của Re và cộng sự (1999) [12].<br /> 67<br /> <br /> N. T. Thắm, P. K. Ngọc, N. T. M. Nguyệt, Đ. T. A. Đào, L. T. Hải, N. T. Hà, N. H. Cường / Khả năng…<br /> <br /> 3. Kết quả và thảo luận<br /> 3.1. Khả năng kháng khuẩn của cao củ cải trắng<br /> Khả năng kháng khuẩn được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của<br /> vi khuẩn thông qua các vòng kháng khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch (hình 1, 2, 3 và 4).<br /> Đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết củ cải trắng được trình bày ở bảng 1.<br /> Bảng 1: Đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết củ cải trắng (mm)<br /> Dịch kháng khuẩn<br /> <br /> B.cereus<br /> <br /> 100 mg/ml<br /> <br /> 11,56 ± 0,80<br /> <br /> 9,94 ± 0,80<br /> <br /> 8,78 ± 0,67<br /> <br /> 11,39 ± 0,70<br /> <br /> 200 mg/ml<br /> <br /> 12,67 ± 0,50<br /> <br /> 10,24 ± 2,77<br /> <br /> 10,67 ± 0,50<br /> <br /> 13,00 ± 0,97<br /> <br /> 400 mg/ml<br /> <br /> 13,89 ± 1,05<br /> <br /> 11,94 ± 1,00<br /> <br /> 12,22 ± 0,44<br /> <br /> 13,89 ± 0,90<br /> <br /> 800 mg/ml<br /> <br /> 15,00 ± 0,50<br /> <br /> 13,22 ± 0,73<br /> <br /> 15,00 ± 0,70<br /> <br /> 15,22 ± 1,11<br /> <br /> 1600 mg/ml<br /> <br /> 16,00 ± 0,71<br /> <br /> 13,50 ± 0,86<br /> <br /> 17,89 ± 0,60<br /> <br /> 15,89 ± 1,08<br /> <br /> Ampicilin<br /> <br /> 8,67 ± 0,58<br /> <br /> 19,67 ± 0,58<br /> <br /> 0<br /> <br /> 15,33 ± 0,58<br /> <br /> Gentamycin<br /> <br /> 16,67 ± 1,15<br /> <br /> 13,00 ± 1,00<br /> <br /> 21,00 ± 0,00<br /> <br /> 15,00 ± 1,00<br /> <br /> Tetracylin<br /> <br /> 24,67 ± 1,15<br /> <br /> 18,00 ± 2,65<br /> <br /> 0<br /> <br /> 18,67 ± 1,12<br /> <br /> S.typhi<br /> <br /> P.aeruginosa<br /> <br /> S.aureus<br /> <br /> Hình 1: Khả năng kháng Bacillus cereus của dịch chiết củ cải trắng<br /> <br /> Hình 2: Khả năng kháng Pseudomonas aeruginosa của dịch chiết củ cải trắng<br /> <br /> 68<br /> <br /> Trường Đại học Vinh<br /> <br /> Tạp chí khoa học, Tập 46, Số 2A (2017), tr. 66-72<br /> <br /> Hình 3: Khả năng kháng Staphylococcus aureus của dịch chiết củ cải trắng<br /> <br /> Hình 4: Khả năng kháng Salmonella typhi của dịch chiết củ cải trắng<br /> (1): 1600mg/ml, (2): 800 mg/ml, (3): 400 mg/ml, (4): 200 mg/ml, (5): 100 mg/ml, (6):<br /> chứng âm DMSO 5%, (7): chứng dương gồm 3 loại (a) Ampicillin , (b) Gentamycin, (c)<br /> Tetracyclin<br /> Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết củ cải trắng có khả năng ức chế sự phát<br /> triển của cả 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Mức độ kháng phụ thuộc nồng độ của dịch<br /> chiết sử dụng. Hiệu quả kháng tốt nhất trên P.aeruginosa và thấp nhất với S.typhi. Ở<br /> nồng độ 1600 mg/ml, hiệu quả kháng của dịch chiết thấp hơn của tetracylin mức 30 g,<br /> tương đương với 10 g gentamycin và cao hơn 10 g ampicilin. Đặc biệt, hai loại kháng<br /> sinh ampicilin và tetracylin không có khả năng kháng chủng Pseudomonas aeruginosa,<br /> nhưng dịch chiết từ củ cải trắng lại kháng tốt. Ngay nồng độ dịch khá thấp 100 mg/ml,<br /> vòng kháng khuẩn thể hiện rất rõ, đường kinh kháng khuẩn đạt 8,78 ± 0,67 mm.<br /> Nồng độ ức chế tối thiểu MIC là nồng độ dịch chiết thấp nhất mà tại đó số lượng<br /> vi khuẩn không tăng theo thời gian nuôi cấy. Do đó, nồng độ ức chế tối thiểu càng thấp<br /> thì khả năng kháng khuẩn càng cao. Kết quả thực nghiệm trên dịch chiết củ cải trắng cho<br /> thấy giá trị MIC với S.typhi và P.aeruginosa là 40 mg/ml, với B.cereus và S.aureus là 20<br /> mg/ml.<br /> Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của S. Shukla và cộng sự (2011) khi<br /> nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của nước ép từ củ cải trắng Ấn Độ. Củ cải tươi được<br /> rửa sạch, ép lấy nước, lọc loại bã và cô giảm áp ở 35 ± 50C để thu cao. Hòa tan cao vào<br /> nước ở các nồng độ xác định dùng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn. Các chủng vi sinh<br /> được khảo sát gồm S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,<br /> Enterococcus faecalis. Mẫu đối chứng là kháng sinh ampicillin. Kết quả cho thấy nước<br /> 69<br /> <br /> N. T. Thắm, P. K. Ngọc, N. T. M. Nguyệt, Đ. T. A. Đào, L. T. Hải, N. T. Hà, N. H. Cường / Khả năng…<br /> <br /> ép từ củ cải trắng Ấn Độ có khả năng ức chế sự phát triển của cả 5 chủng vi sinh khảo<br /> sát, giá trị MIC xác định được dao động trong khoảng 0,078 - 0,625 mg/ml, trong đó hoạt<br /> tính ức chế 2 chủng E. coli và Enterococcus faecalis là tương đương với ampicillin, cao<br /> hơn ampicillin khi tác động lên Klebsiella pneumonia (MIC là 0,078 mg/ml so với 0,312<br /> mg/ml của ampicillin) [13].<br /> Đường kính vòng kháng khuẩn<br /> (mm)<br /> <br /> 20<br /> <br /> B.cereus<br /> P.aeruginosa<br /> <br /> 18<br /> <br /> S.typhi<br /> S.aureus<br /> <br /> 16<br /> 14<br /> 12<br /> 10<br /> 8<br /> 0<br /> <br /> 500<br /> <br /> 1000<br /> <br /> 1500<br /> <br /> 2000<br /> <br /> Nồng độ cao chiết (mg/ml)<br /> <br /> Hình 5: Khả năng kháng khuẩn của cao củ cải trắng với 4 chủng vi khuẩn khác nhau<br /> 3.2. Khả năng chống oxy hóa của cao củ cải trắng<br /> Hoạt tính chống oxy hóa của cao tương đương 1,3283 ± 0,033) mM TEAC/g.<br /> Khả năng khử gốc tự do ABTS* của cao củ cải trắng ở các nồng độ khác nhau được thể<br /> hiện ở hình 6. Kết quả cho thấy khả năng khử gốc ABTS* tỉ lệ thuận với nồng độ cao sử<br /> dụng theo phương trình y = 4,616 x + 17,47, trong đó y là giá trị OD, x là nồng độ dịch<br /> cao củ cải trắng. Giá trị IC50 đạt được ở mức 7,074 g/ml.<br /> 70<br /> y = 4,616x + 17,47<br /> R² = 0,980<br /> <br /> % độ giảm độ hấp thu<br /> <br /> 60<br /> 50<br /> 40<br /> 30<br /> 20<br /> 10<br /> 0<br /> 3,2<br /> <br /> 3,8<br /> <br /> 4,4<br /> <br /> 5,0<br /> <br /> 5,6<br /> <br /> 6,2<br /> <br /> 6,8<br /> <br /> 7,4<br /> <br /> 8,0<br /> <br /> Nồng độ cao (µg/ml)<br /> <br /> Hình 6: Khả năng khử gốc tự do ABTS* của cao củ cải trắng<br /> <br /> 70<br /> <br />