Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và sinh lý của tảo silic Entomoneis sp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Huỳnh Như

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN SỰ

SINH TRƯỞNG VÀ SINH LÝ CỦA TẢO SILIC

Entomoneis sp.

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Huỳnh Như

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN SỰ

SINH TRƯỞNG VÀ SINH LÝ CỦA TẢO SILIC

Entomoneis sp.

Chuyên ngành: Sinh thái học

Mã số: 8420120

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN ĐỨC HƯNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do chính bản thân tôi thực hiện, các

số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn chính xác, trung thực và chưa

từng có ai công bố. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những kết quả đã nêu

trong luận văn này.

Tác giả

Nguyễn Huỳnh Như

LỜI CẢM ƠN

Để có được kết quả như ngày hôm nay, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân

thành tới Ban chủ nhiệm Khoa cùng các quý thầy cô trong Khoa Sinh học - Trường

Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học và

thực hiện công tác nghiên cứu.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS Nguyễn Đức Hưng - người đã tận tình

hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn đến em Nguyễn Văn Duy cùng các em

sinh viên ở phòng thí nghiệm Sinh học - Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên -

Trường Đại học Sài Gòn đã hết lòng giúp đỡ và chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm cho

tôi thực hiện đề tài.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tất cả những người thân trong gia

đình, bạn bè cùng lớp đã giúp đỡ, động viên tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần

để tôi có thể hoàn thành đề tài của mình.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 3 năm 2019

HỌC VIÊN

Nguyễn Huỳnh Như

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục từ viết tắt

Danh mục hình

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 4

1.1. Tổng quan về tảo silic ............................................................................................. 4

1.1.1. Đặc điểm về hình thái và cấu tạo tế bào ....................................................... 4

1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng .................................................................................... 5

1.1.3. Các hình thức sinh sản .................................................................................. 8

1.1.4. Sự thích ứng phù du của tảo silic ................................................................ 10

1.1.5. Tính sinh thái của một số tảo silic tiêu biểu ............................................... 10

1.1.6. Vai trò của tảo silic ..................................................................................... 11

1.2. Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tảo silic ....... 12

1.2.1. Ánh sáng ..................................................................................................... 12

1.2.2. Nhiệt độ ....................................................................................................... 12

1.2.3. Thành phần dinh dưỡng .............................................................................. 13

1.2.4. Độ mặn ........................................................................................................ 14

1.2.5. Yếu tố pH .................................................................................................... 15

1.3. Tổng quan về chi tảo Entomoneis ........................................................................ 16

1.3.1. Vị trí phân loại chi tảo Entomoneis ............................................................ 16

1.3.2. Lược sử nghiên cứu về vi tảo ...................................................................... 17

1.3.3. Ứng dụng thực tiễn của một số loài thuộc chi tảo Entomoneis .................. 20

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 21

2.1. Thời gian, địa điểm và vật liệu nghiên cứu .......................................................... 21

2.1.1. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 21

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 21

2.1.3. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 21

2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 22

2.2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu ................................................................. 22

2.2.2. Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm, môi trường và nguồn giống ........................ 22

2.2.3. Định danh phân tử tảo Entomoneis sp. bằng mã vạch ADN ...................... 23

2.2.4. Xác định mật độ tế bào tảo silic Entomoneis sp. ........................................ 26

2.2.5. Xác định thời gian thế hệ và tốc độ tăng trưởng ......................................... 28

2.2.6. Đo hiệu suất lượng tử tối đa của quang hệ II .............................................. 29

2.2.7. Xác định pH của dịch nuôi tảo .................................................................... 30

2.2.8. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 30

2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 31

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 32

3.1. Kết quả phân tích trình tự vùng gen rbcL-3P của Entomoneis sp. ....................... 32

3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số và khuếch đại vùng gen rbcL-3P bằng

kĩ thuật PCR ............................................................................................... 32

3.1.2. Kết quả phân tích trình tự sau khi hiệu chỉnh ............................................. 33

3.1.3. Xây dựng cây phát sinh chủng loài đối với trình tự rbcL-3P ..................... 35

3.2. Ảnh hưởng của mật độ ban đầu đến sự sinh trưởng của tảo silic Entomoneis

sp. trong môi trường F/2 ............................................................................ 36

3.2.1. Đường cong tăng trưởng của tảo silic Entomoneis sp. ............................... 36

3.2.2. Màu sắc dịch nuôi tảo silic Entomoneis sp. trong môi trường F/2 ............. 39

3.2.3. Tốc độ tăng trưởng, năng suất sinh khối của Entomoneis sp. .................... 40

3.3. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và sinh lý của Entomoneis sp. ................ 42

3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của Entomoneis sp. ....................... 42

3.3.2. Sự biến thiên pH qua các ngày với giá trị pH ban đầu khác nhau .............. 48

3.3.3. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất lượng tử tối đa của Entomoneis sp. ....... 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 53

PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

STT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

BM Biomass productivity Năng suất sinh khối 1

bp Base pair Cặp Base 2

Thời gian phân chia mỗi Division per day 3 Dd ngày

Variable chlorophyll fluorescence/ Hiệu suất lượng tử tối đa Fv/ Fm 4 maximal chlorophyll fluorescence của quang hệ II

N Ngày 5

OD Optical density Mật độ quang 6

PSII Photosystem II Quang hệ II 7

Standard Deviation Độ lệch chuẩn 8 SD

SEM Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử quét 9

Doubling time 10 td Thời gian thế hệ

11 tb Tế bào

Growth rate Tốc độ tăng trưởng 12 μ

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc vỏ tảo silic ..................................................................................... 4

Hình 1.2. Các pha tăng trưởng của tảo ......................................................................... 6

Hình 1.3. Sơ đồ biểu diễn sự thay đổi huỳnh quang .................................................... 8

Hình 1.4. Vòng đời của tảo silic với sinh sản vô tính và hữu tính ............................... 9

Hình 2.1. Hình thái tảo Entomoneis sp., thanh thước tỉ lệ ứng với 10 μm ................ 21

Hình 2.2. Sơ đồ mô tả các bước nghiên cứu trong đề tài ........................................... 22

Hình 2.3. Thiết bị thu sinh khối tảo ........................................................................... 23

Hình 2.4. Sơ đồ thiết kế mồi để khuếch đại trình tự gen rbcL-3P ............................. 24

Hình 2.5. Thiết bị buồng đếm hồng cầu xác định mật độ tảo .................................... 27

Hình 2.6. Mối tương quan tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ hấp thụ ................... 28

Hình 2.7. Thiết bị đo hiệu suất lượng tử tối đa của quang hệ II ................................ 30

Hình 2.8. Thiết bị đo pH ............................................................................................ 30

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của ADN bằng Nanodrop ............................ 32

Hình.3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng rbcL-3P của tảo silic

Entomoneis sp. (1) và thang ADN chuẩn (2) ........................................... 33

Hình 3.3. Kết quả tra cứu bằng kĩ thuật BLAST trên GenBank ................................ 34

Hình 3.4. Mô hình cây phát sinh của Entomoneis sp. phân tích bằng trình tự

vùng gen rbcL-3P trong nghiên cứu này ................................................. 36

Hình 3.5. Đường cong tăng trưởng của Entomoneis sp. ở các mật độ ban đầu

khác nhau ................................................................................................. 38

Hình 3.6. Màu sắc dịch nuôi Entomoneis sp. từ ngày 1 đến ngày 14 ........................ 40

Hình 3.7. Màu sắc dịch nuôi qua các ngày dưới ảnh hưởng của các mức pH

khác nhau (từ trái sang phải mức pH tăng dần từ 6,0 - 8,5) .................... 44

Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng của tảo Entomoneis sp. với các giá trị pH

khác nhau ................................................................................................. 45

Hình 3.9. Tốc độ tăng trưởng và năng suất sinh khối của Entomoneis sp. dưới

các giá trị pH ban đầu khác nhau ............................................................. 47

Hình 3.10. Giá trị pH thay đổi qua các ngày .............................................................. 49

Hình 3.11. Chỉ số Fv/ Fm thay đổi qua các ngày ....................................................... 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Danh sách các chất dinh dưỡng cần thiết cấu tạo nên tảo silic ................... 14

Bảng 2.1. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại trình tự rbcL-3P ................ 25

Bảng 2.2. Chu kì nhiệt khuếch đại trình tự rbcL-3P .................................................. 25

Bảng 3.1. Kết quả BLAST vùng gen rbcL-3P các mẫu tương đồng trên cơ sở

dữ liệu của ngân hàng gen quốc gia Hoa Kì ............................................ 35

Bảng 3.2. Mật độ tế bào tảo silic Entomoneis sp. dưới ảnh hưởng của các mật

độ ban đầu khác nhau ............................................................................... 37

Bảng 3.3. Mật độ tế bào cực đại của tảo silic Entomoneis sp. trong môi trường

DAM và F/2 ............................................................................................. 39

Bảng 3.4. Tốc độ tăng trưởng, thời gian phân chia mỗi ngày, thời gian thế hệ

và năng suất sinh khối của Entomoneis sp. ở các mật độ khác nhau ....... 40

Bảng 3.5. Mật độ tế bào của Entomoneis sp. với các giá trị pH khác nhau ................ 42

Bảng 3.6. Tốc độ tăng trưởng, năng suất sinh khối và thời gian phân chia của

tảo silic Entomoneis sp. dưới tác động của pH khác nhau ...................... 46

Bảng 3.7. Giá trị pH biến thiên qua các ngày .............................................................. 48

Bảng 3.8. Chỉ số Fv/ Fm thay đổi qua các ngày với pH ban đầu khác nhau ............... 50

1

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Vi tảo ở biển là những loài tảo đơn bào sống trôi nổi trong nước, có khả năng

quang hợp tạo ra chất hữu cơ. Vì vậy, vi tảo được xem là một mắt xích quan trọng

trong chuỗi thức ăn tự nhiên và giữ vai trò như hệ thống lọc sinh học giúp ổn định

các thông số môi trường.

Trong nuôi trồng thủy sản, vi tảo vô cùng quan trọng bởi nó là nguồn thức ăn

cho động vật phù du, các loại ấu trùng, động vật thân mềm ăn lọc, cá bột và một số

loài cá trưởng thành. Nếu thiếu vi tảo, mọi nguồn lợi hải sản không thể tồn tại vì

không có nguồn thức ăn hữu cơ ban đầu [1]. Ngoài ra, nó còn góp phần bảo vệ môi

trường nuôi thủy sản bằng cách tiêu thụ bớt lượng muối khoáng dư thừa hoặc được

nuôi trồng công nghiệp để tạo ra nguồn thức ăn nuôi tôm hay thuốc bổ trợ giàu

protein, vitamine, carotenoid, astaxanthine, các acid béo không bão hòa và vi khoáng

dùng cho người,…

Trong số các loài vi tảo biển, tảo silic chiếm khoảng 60% - 70% về thành phần

loài và sinh khối [1]. Vì vậy, sự phân bố của tảo silic thường phản ánh khá đầy đủ xu

thế chung của toàn bộ sinh vật phù du. Vỏ silic của tảo rất bền và không bị phân hủy

sau khi tảo chết, số lượng lớn các mảnh vỏ này dần tích lũy ở đáy các thủy vực tạo

thành lớp diatomid dày. Diatomid là loại nguyên liệu xốp, nhẹ, mịn được khai thác

và sử dụng trong vận chuyển chất lỏng nitroglycerin, làm vật liệu lọc, xử lý ô nhiễm

môi trường, vật liệu cách nhiệt, làm chất phụ gia trong sản xuất kem đánh răng, xi

măng, phân bón,…[2]. Các tầng diatomid còn là cơ sở để xác định tuổi của lớp địa

tầng và lịch sử của vỏ Trái đất từ cuối kỷ Jura cho đến nay. Ngày nay, vật liệu từ tảo

silic cung cấp nhiều mặt hàng khác nhau từ sơn móng tay, vật liệu xây dựng, nhiên

liệu sinh học và kiểm soát dịch hại.

Ngoài ra, tảo silic còn nhiều ứng dụng khác như khám phá dầu, kiểm tra pháp

y, chỉ thị môi trường, tạo mô hình sinh học, kiểm tra độc tính và dinh dưỡng của các

hệ sinh thái dưới nước [3]. Đặc biệt, các loài trong chi tảo Entomoneis có giá trị kinh

tế lớn, ứng dụng trong ngành dược phẩm, thực phẩm và được chứng minh có nguồn

acid eicosapentaenoic (EPA) và acid arachidonic (ARA, 20:4ω6) cao [4]. Vì vậy, chi

2

tảo này rất có tiềm năng trong sản xuất EPA và ARA nhưng hiện nay có rất ít tài liệu

nghiên cứu về các loài trong chi này.

Từ lâu, nhiều tác giả trên thế giới cũng như Việt Nam đã quan tâm đến sự phân

bố và phân loại tảo silic phù du ở biển. Có rất nhiều công trình nghiên cứu về sự sinh

trưởng, hoạt động sinh lý, sinh khối, thành phần dinh dưỡng cũng như các yếu tố lí

học ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tảo silic. Ngày nay, việc đốt nhiên liệu hóa

thạch cũng như thay đổi mục đích sử dụng đất đã làm tăng khoảng 30% lượng khí

carbon dioxide. Khí này vào đại dương kết hợp với nước làm tăng nồng độ ion hydro

và đại dương trở nên có tính acid hơn. Vào năm 2100, giá trị pH có thể giảm 0,5 đơn

vị. Acid hóa đại dương có thể gây nhiều tác động lớn đến vòng đời của một số loài

cá, các loài động vật có vỏ, gây thiệt hại kinh tế toàn cầu và có thể gây xáo trộn toàn

bộ hệ thống sinh học biển [5]. Nhìn chung, khi giá trị pH giảm thì độ phong phú của

loài cũng giảm và thành phần loài có nhiều thay đổi sâu sắc. Từ những lí do trên,

luận văn “Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và sinh lý của tảo silic

Entomoneis sp.” được thực hiện.

2. Đối tượng nghiên cứu

Tảo silic Entomoneis sp. được phân lập ở rừng ngập mặn Cần Giờ và đang lưu

giữ tại phòng thí nghiệm Sinh học - Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên - Trường Đại

học Sài Gòn. Loài này đã được nuôi cấy trên môi trường nước biển nhân tạo (DAM),

được khảo sát ảnh hưởng của chất kháng sinh - kháng nấm đến sự sinh trưởng [6].

3. Mục tiêu nghiên cứu

1. Định danh tảo silic Entomoneis sp.

2. Khảo sát được ảnh hưởng của mật độ ban đầu đến sự sinh trưởng và sinh lý

của tảo silic Entomoneis sp.

3. Xác định được giá trị pH thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh lý của tảo

silic Entomoneis sp.

4. Nội dung nghiên cứu

1. Tách chiết ADN tổng số tảo silic Entomoneis sp., sử dụng gen chỉ thị rbcL-3P,

xây dựng và phân tích cây phát sinh loài.

2. Xây dựng đường cong tăng trưởng, tốc độ tăng trưởng, năng suất sinh khối

3

của tảo silic Entomoneis sp. với các mật độ ban đầu khác nhau.

3. Khảo sát ảnh hưởng của các giá trị pH khác nhau đến mật độ tế bào, hiệu

suất lượng tử tối đa của quang hệ II (Fv/ Fm).

5. Đóng góp của luận văn

Cung cấp dẫn liệu về sự sinh trưởng, sinh lý cũng như ảnh hưởng của pH đến

tảo silic Entomoneis sp. phục vụ cho việc học tập, nghiên cứu cơ bản và nuôi trồng

thủy sản.

Cung cấp những tài liệu cần thiết để tiến hành các nghiên cứu di truyền sâu hơn

về tảo silic Entomoneis sp.

4

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về tảo silic

1.1.1. Đặc điểm về hình thái và cấu tạo tế bào

Tảo silic là loại tảo đơn bào cỡ hiển vi, ở nhiều loài các tế bào nối với nhau

thành chuỗi dài, một số sống riêng lẻ, một số ít loài dùng chất keo tiết ra bám vào các

vật thể khác sống cố định, do tác động cơ học bị đứt gãy trôi đi sống phù du [1].

Các loài tảo silic khác biệt nhau bởi hình dạng và kết cấu hoa vân trên vỏ do đó

căn cứ vào đặc điểm này chia nó thành hai nhóm: nhóm tảo silic trung tâm và nhóm

tảo silic lông chim. Nhóm tảo silic trung tâm (Centrales): Vân hoa trên mặt vỏ tế bào

sắp xếp theo dạng tỏa tia từ một điểm hoặc nhiều điểm làm trung tâm, không di

động. Nhóm tảo silic lông chim (Pennales): Vân hoa trên mặt vỏ tế bào sắp xếp theo

dạng đối xứng hai bên đối với trục dài hoặc tuyến giữa của mặt vỏ như dạng lông

chim, có hoặc không có khả năng di động [1].

Tảo silic có nhiều hình dạng khác nhau: hình hộp tròn, hình trụ, hình trứng,

hình que, hình cong chữ S,…Vỏ của tảo như cái hộp gồm hai nắp úp lồng vào nhau.

Vỏ trên (Epitheca) lớn, vỏ dưới (Hypotheca) nhỏ. Mặt của vỏ trên và dưới là mặt vỏ

(Valve). Phần vỏ thân của hộp là vòng vỏ (Girdle), phần vỏ trên và vỏ dưới lồng vào

nhau là đai nối (Connesting band) hoặc đai vòng (Hình 1.1) [1].

Hình 1.1. Cấu trúc vỏ tảo silic [1]

Tùy theo từng loài, tế bào có mặt vỏ hình tròn, hoặc hình bầu dục,…và do đó

có ba trục khác nhau:

5

- Trục dài (Apical axis) còn gọi là trục đỉnh là chiều dài của mặt vỏ. Tế bào có

mặt vỏ hình tròn thì trục dài cũng là đường kính, tế bào có mặt vỏ hình bầu dục thì

trục dài là chiều dài của hình bầu dục.

- Trục rộng (Transapical axis) còn gọi là trục cắt đỉnh là chiều rộng của mặt vỏ.

Tế bào có mặt vỏ hình tròn thì trục rộng và trục dài bằng nhau và bằng đường kính,

tế bào có mặt vỏ hình bầu dục thì trục rộng là chiều rộng của hình bầu dục.

- Trục cao (Pervalvar axis) còn gọi là trục xuyên là chiều cao từ mặt vỏ trên tới

mặt vỏ dưới của tế bào.

Vỏ tế bào tảo silic được cấu tạo bởi hợp chất silic và pectin. Tùy theo mức độ

nhiều hay ít của hợp chất silic mà vỏ tế bào dày cứng như ở những loài sống sát đáy

hoặc vỏ tế bào mỏng manh như ở các loài hoàn toàn sống phù du. Hầu như vỏ tế bào

của các loài tảo silic đều có cấu tạo hoa vân rất tinh vi, dưới dạng những lỗ nhỏ và

những buồng nhỏ [1].

Thành phần các chất trong tế bào tảo silic gồm nhân (nucleus) thường nằm ở

trung tâm tế bào. Trong tế bào tảo silic còn có trung thể (centrosome) do H L Smith

quan sát thấy đầu tiên ở chi tảo Surirella là một hạt nhỏ, đường kính 1,5 - 2µm, nằm

ở phần lõm của nhân hình thận. Chất nguyên sinh của tế bào tảo silic thường là khối

lớn ở giữa tế bào, từ đó các sợi nối lớp chất nguyên sinh ở sát thành vỏ tế bào. Xen

kẽ giữa các sợi chất nguyên sinh có thể thấy những hạt dầu nhỏ và không bào. Thể

sắc tố thường phân bố ở sát mặt vỏ hoặc mặt vòng vỏ tế bào. Hình dáng và số lượng

của chúng khác nhau tùy từng loài. Thông thường ở những tế bào tảo silic đang sống

có màu nâu vàng do những sắc tố chlorophyll, phycoxanthin, phaeophin và diatomin

tạo nên [1].

1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng

- Sự sinh trưởng của tảo silic được nuôi cấy trong điều kiện thực nghiệm

thường chia thành 5 pha (Hình 1.2) [7]

6

Hình 1.2. Các pha tăng trưởng của tảo [7]

+ Pha tiềm phát: Tảo thích nghi dần với môi trường, enzyme cảm ứng được

hình thành cùng với các chất chuyển hóa liên quan đến sự phân chia và cố định

carbon nên tốc độ tăng trưởng của quần thể diễn ra chậm.

+ Pha lũy thừa: Tảo hấp thụ chất dinh dưỡng mạnh, số lượng tảo silic tăng

rất nhanh, tỉ lệ thuận với thời gian và tăng theo hàm logarit:

Ct = C0.emt

Ct: số lượng tế bào tại thời điểm t

C0: số lượng tế bào tại thời điểm 0

m: tốc độ tăng trưởng

t: thời gian

+ Pha giảm tốc độ tăng trưởng: Tốc độ tăng trưởng của quần thể tảo vẫn diễn

ra nhưng chậm lại khi chất dinh dưỡng cạn kiệt và các yếu tố bên ngoài như ánh

sáng, pH, CO2 không còn phù hợp.

+ Pha cân bằng: Tốc độ tăng trưởng của quần thể tảo được cân bằng, mật độ

tế bào đạt cực đại và số lượng tương đối ổn định.

+ Pha suy vong: Tảo không thể duy trì sự tăng trưởng và mật độ tế bào giảm

nhanh vì chất lượng nước suy giảm và chất dinh dưỡng cạn kiệt.

7

Do đó, để thu được sinh khối cao và chất lượng cần duy trì môi trường trong

giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân. Hơn nữa, giá trị dinh dưỡng của tảo thấp hơn

khi nuôi cấy vượt quá ba pha do giảm khả năng tiêu thụ chất dinh dưỡng, thành phần

dinh dưỡng của môi trường không đủ và các chất chuyển hóa độc hại được tạo ra.

- Sự sinh trưởng của tảo liên quan chặt chẽ đến quá trình quang hợp. Định vị

trên màng thylacoit có những phân tử sắc tố có khả năng điều khiển quá trình quang

hợp, phát lại nhiệt hay phát huỳnh quang. Huỳnh quang chủ yếu được phát ra từ

chlorophyll a của PSII. Huỳnh quang diệp lục đã được sử dụng để đánh giá thực

trạng cấu trúc và chức năng của màng thylacoit. Nó phản ánh hoạt động của các quá

trình khởi nguyên như sự hấp thụ ánh sáng, sự phân bố và vận chuyển năng lượng

cũng như phản ánh trực tiếp hiệu suất của phản ứng quang hóa trong PSII. Các phản

ứng quang hóa này phụ thuộc vào trạng thái oxi hóa khử của chất nhận điện tử đầu

tiên của PSII và của các phức hệ vận chuyển điện tử khác của màng [8]. Để nghiên

cứu ảnh hưởng của pH lên hoạt động của bộ máy quang hợp của Entomoneis nuôi ở

các giá trị pH khác nhau, tác giả sử dụng phương pháp đo huỳnh quang diệp lục.

Huỳnh quang phát ra bởi PSI khá nhỏ. Tuy nhiên, ở Cyanobacteria sự phát huỳnh

quang của PSI và phycobilisomes thì nhiều hơn [9]. Phân tử chlorophyll hấp thụ ánh

sáng chuyển sang trung tâm phản ứng (P680) sau đó truyền điện tử cho Quinnone A

(QA) và trung tâm phản ứng bị oxi hóa. Huỳnh quang nhỏ nhất được xác định (Fo).

Khi các trung tâm phản ứng đóng lại, chất nhận điện tử (QA) bị khử hoàn toàn và

huỳnh quang lớn nhất được xác định (Fm). Huỳnh quang biến thiên (Fv) được sử

dụng để đánh giá hiệu suất lượng tử của phản ứng quang hóa trong quá trình quang

hợp. Giá trị Fv/ Fm được xác định bằng cách đo hiệu suất huỳnh quang tăng từ

huỳnh quang tối thiểu đến huỳnh quang tối đa và giá trị này thường giảm với các

stress môi trường (Hình 1.3). Mức độ stress cũng như khả năng phục hồi của bộ máy

quang hợp phụ thuộc vào từng loài, trạng thái sinh lý và điều kiện môi trường.

8

Hình 1.3. Sơ đồ biểu diễn sự thay đổi huỳnh quang [9]

1.1.3. Các hình thức sinh sản

Các loài tảo silic thường có vòng đời lưỡng tính và dạng lưỡng bội thường

chiếm ưu thế hơn dạng đơn bội. Trong quá trình phân bào, nội chất lớn dần, hai

mảnh vỏ tách ra theo trục dọc đường trung tuyến, mỗi nửa nội chất nhận một mảnh

vỏ của tế bào mẹ rồi tổng hợp mảnh vỏ thứ hai. Vỏ mới rất mỏng, sau dày dần lên.

Sinh sản vô tính bằng hình thức phân đôi sẽ dần dần làm giảm kích thước của tế bào

vì sau một lần phân chia thì mỗi tế bào con được thừa hưởng một nắp vỏ của tế bào

mẹ [1] (Hình 1.4).

Tốc độ phân chia tế bào của tảo silic tùy theo từng loài và phụ thuộc vào môi

trường, nhiều loài tế bào thường tiến hành phân chia vào ban đêm, cũng có những

loài tế bào phân chia cả vào ban ngày. Trong những điều kiện môi trường thuận lợi

đặc biệt, nhất là nhiệt độ và hàm lượng muối dinh dưỡng, mỗi giờ tế bào có thể phân

chia xong một lần [1].

Tảo silic có thể tạo ra các giao tử sau khi chúng đạt đến kích thước tối thiểu và

chúng lấy lại kích thước tối đa bằng cách hình thành bào tử sinh trưởng. Bào tử sinh

trưởng hình thành sau khi hợp nhất tinh trùng và trứng [1][3].

9

Hình 1.4. Vòng đời của tảo silic với sinh sản vô tính và hữu tính [3]

Tảo silic cũng hình thành bào tử ngủ để duy trì sự sống trong các điều kiện bất

lợi của môi trường như thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ nước quá cao hoặc quá thấp,

muối dinh dưỡng bị thiếu…, nhất là vùng biển gần bờ. Những loài sống ở khu vực

biển ấm thường sinh bào tử ngủ vào thời kỳ có nhiệt độ nước thấp [1]. Bào tử ngủ

được sinh ra trong tế bào mẹ, thường xuất hiện sau khi tế bào phân chia. Vỏ của bào

tử ngủ rất dày, gồm vỏ trên và vỏ dưới, tạo thành một hộp hình cầu hoặc hơi dẹt, trên

mặt vỏ có gai hoặc trơn nhẵn. Hình dạng của bào tử ngủ và gai của chúng khác nhau

tùy theo loài, do đó trong nhiều trường hợp có thể dùng làm căn cứ để định loại. Sau

khi bào tử ngủ đã hình thành hoàn chỉnh, vỏ tế bào mẹ bị phá vỡ, bào tử thoát ra

ngoài, chìm dần xuống đáy, khi điều kiện môi trường trở nên thích hợp sẽ phát triển

thành tế bào mới [1].

Rất nhiều loài thuộc nhóm tảo silic trung tâm có hình thức sinh sản bằng bào tử

nhỏ (microspore), ở nhóm tảo silic lông chim cũng có loài sinh sản bằng hình thức

này nhưng vô cùng ít. Trong tế bào nhân phân chia nhiều lần, vỏ tế bào mẹ vẫn giữ

nguyên, tạo thành nhiều bào tử nhỏ có dạng gần hình cầu. Số lượng bào tử nhỏ trong

tế bào mẹ là số lũy thừa của 2 và ở mỗi loài cũng khác nhau, có thể là 2, 4, 8, 16 cái,

thậm chí có trường hợp tới 128 cái như Gran đã thấy trong tế bào của loài tảo rễ ống

10

gai nhọn (Rhizosolenia styliformis). Các bào tử nhỏ có thể di động được nhờ tiên

mao như ở loài tảo hình hộp Moobilien (Buddulphia mobiliensis) do Bergon phát

hiện. Thường thường quan sát thấy bào tử nhỏ trong thời kì cũng có bào tử sinh

trưởng, vì vậy nhiều tác giả đã cho rằng có thể chúng được hình thành do cùng một

yếu tố kích thích và đều có quan hệ đến sự nhỏ dần lại của tế bào [1].

1.1.4. Sự thích ứng phù du của tảo silic

Hầu hết các loài tảo silic ở biển đều sống lơ lửng trong nước, đó là đặc điểm cơ

bản khác với những thực vật khác. Tỷ trọng cơ thể của chúng hầu như bằng nước

biển, hơi cao hơn đôi chút. Các cá thể tảo có xu hướng lắng dần xuống để giữ cho cơ

thể luôn lơ lửng trong tầng nước thích hợp đủ ánh sáng, bảo đảm sự quang hợp thuận

lợi nó phải tiến hành điều chỉnh tỷ trọng cơ thể [1].

Qua nghiên cứu của nhiều học giả cho thấy trong các tế bào tảo silic có thể hình

thành những không bào hoặc những chất dịch có tỷ trọng nhẹ để tế bào nổi lên. Ở

một số loài, các tế bào tiết ra chất keo nhẹ, dạng sợi nối các tế bào với nhau thành

chuỗi dài. Rất nhiều loài tảo silic có tế bào dẹp, mỏng, rất dài và nối thành chuỗi

hoặc các tế bào có phần phụ phức tạp, ở xung quanh mép mặt vỏ hoặc các cực của

mép vỏ hình thành những lông gai dài tỏa ra hoặc những u lồi để liên kết với nhau

thành chuỗi dài thẳng hoặc cong xoắn. Các lông gai ở các loài to nhỏ khác nhau, rất

nhiều trường hợp lông gai rất to và dài, đối với những loài này phần tế bào chính trở

thành rất nhỏ. Sự hình thành các phần phụ của tế bào, các tế bào nối thành chuỗi dài

chính là làm tăng sự ma sát với nước, làm cho các cơ thể của nó khó lắng chìm [1].

1.1.5. Tính sinh thái của một số tảo silic tiêu biểu

Sự phân bố mặt phẳng và biến đổi sinh khối theo mùa của tảo silic phù du ở các

vùng biển Việt Nam phù hợp với quy luật chung của các biển trên thế giới. Vùng

biển ven bờ là nơi có độ muối không quá cao, thường thấp hơn 32 ‰, hàm lượng các

loại muối dinh dưỡng vô cơ hòa tan thường cao, do đó ở vùng biển này tảo silic phù

du thường có mật độ cao từ 1.000 đến 10.000 Tb/ L có khi ở vài nơi trong phạm vi

nhỏ đạt tới 100.000 Tb/ L. Vùng biển ngoài khơi xa, độ muối thường lớn hơn 33 ‰,

hàm lượng muối dinh dưỡng thấp, mật độ tảo silic cũng thấp, trung bình chỉ 10 Tb/ L

hoặc thấp hơn [1].

11

Sự biến đổi sinh khối theo mùa của tảo silic phù du ở các vùng biển Việt Nam

tùy theo vĩ độ có những sai khác. Ở vùng biển phía Bắc mang tính chất của vùng

biển á nhiệt đới, trong một năm sinh khối của nó có hai đỉnh cao vào mùa xuân và

cuối mùa thu đầu mùa đông, hai đỉnh cao này thường chênh lệch nhau khá lớn có khi

tới 2-3 lần. Ở vùng biển phía Nam thể hiện tính chất của vùng biển nhiệt đới rõ rệt,

biến đổi sinh khối của tảo silic phù du thường chỉ hình thành một đỉnh cao trong năm

vào mùa Đông Xuân [1].

Sự phân bố mặt phẳng và biến đổi theo mùa của tảo silic phù du nói trên đều

phụ thuộc vào sự sinh sản và phát triển mạnh của một số loài thuộc một số chi.

Những chi tảo này ở từng vùng biển cụ thể đều có những chu kỳ sinh trưởng, sinh

sản khác nhau và sự thay thế loài của chúng cũng không giống nhau [1].

1.1.6. Vai trò của tảo silic

Trong tự nhiên, tảo silic chiếm 25% sinh khối sinh vật sơ cấp, đóng vai trò quan

trọng trong việc tạo ra oxygen và được tìm thấy trong tất cả các hệ sinh thái thủy

sinh. Vì sự phong phú và đa dạng trong nhóm tảo nên nó không chỉ kiểm soát các

loài tảo độc hại như Microcystis aeruginosa Kutzing mà còn tiêu thụ chất dinh

dưỡng dư thừa [10].

Trong nuôi trồng thủy sản, tảo silic được sử dụng làm thức ăn trong giai đoạn

sinh trưởng của nhuyễn thể, giai đoạn ấu trùng của một số loài cá và các động vật

phù du (động vật chân mái chèo, luân trùng, Artemia). Tại Úc, tảo silic được nhân

giống làm thức ăn cho hàu (Crassostrea gigas và Saccostrea commercialis), ngọc

trai (Pinctada maxima), tôm sú (Haliotis spp.) tôm (Penaeus spp.) và cá tuyết (Lutes

calcarifer) [11]. Tảo silic Skeletonema costatum (Greville) Cleve là nguồn thức ăn

phù hợp cho ấu trùng tôm giai đoạn Zoea và Mysis [12]. Ở cửa sông Akkeshi-ko, tỉ

lệ tảo silic sống đáy trong ruột hàu chiếm 70% năm 2003 và 67% vào năm 2004 còn

trong ruột trai chiếm 78% năm 2003 và 87% năm 2004 [13]. Hơn nữa, tảo silic

Navicula spp. và Nitzschia spp. thường được nuôi cấy trên diện rộng làm thức ăn

thân mềm hai mảnh, ấu trùng giáp xác, con bào ngư non [14].

Hiện nay, tảo silic được sử dụng phổ biến trong công nghệ nano, sinh học phân

tử, điện tử, pin mặt trời, vật liệu quang học, thiết bị phân loại hạt, tụ điện siêu nhỏ và

12

các hệ thống phân phối thuốc [15].

1.2. Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tảo silic

1.2.1. Ánh sáng

Ánh sáng là một trong những nhân tố quan trọng có vai trò quyết định đến quá

trình quang hợp của các loài tảo. Ảnh hưởng của ánh sáng đến quang hợp không

những phụ thuộc vào cường độ ánh sáng mà còn thể hiện ở chất lượng ánh sáng. Ánh

sáng màu xanh làm tăng hàm lượng protein còn ánh sáng màu đỏ làm tăng hàm

lượng carbohydrate. Cường độ ánh sáng tối ưu cho sự phát triển của nhiều loài vi tảo

là từ 2500 ÷ 5000 lux. Cường độ ánh sáng cao quá mức có thể dẫn đến quang oxi hóa

và ức chế quá trình quang hợp của tảo, làm tăng hàm lượng sắc tố carotenoid,

polysaccharide trong tế bào tảo, ngược lại cường độ ánh sáng quá thấp sẽ làm chậm

quá trình sinh trưởng của tảo [9]. Do đó, trong các phòng nuôi cấy tảo người ta

thường lắp thêm hệ thống đèn huỳnh quang để đảm bảo cường độ ánh sáng thích

hợp. Tuy nhiên, đèn huỳnh quang cần đặt xa các bình nuôi cấy để tránh gây quá nóng

cho bình nuôi và việc chiếu sáng liên tục cũng ảnh hưởng xấu đến vi tảo như gây mất

sắc tố và làm tảo chết. Vì vậy, tùy vào từng loại tảo mà có quang chu kì thích hợp

12h:12h hay 12h:8h,...[7].

1.2.2. Nhiệt độ

Mỗi loài tảo cần được nuôi ở một nhiệt độ thích hợp bởi vì nhiệt độ có thể ảnh

hưởng đến cấu trúc tế bào, tốc độ phản ứng trao đổi chất, quá trình quang hợp, sự

phân bố, sự sinh trưởng, cường độ hô hấp, kích thước tế bào và sự thích nghi của

loài. Không chỉ ở nhiệt độ thấp mà ở nhiệt độ cao cũng có thể gây ra thiệt hại nghiêm

trọng trong quá trình nuôi cấy tảo. Nhiệt độ thấp có thể ảnh hưởng đến tính lưu động

của màng và nhiệt độ cao làm tăng tốc độ phản ứng tối và hô hấp diễn ra nhanh hơn,

hiệu quả quang hợp giảm do sự biến tính của các enzyme. Tương tự như cường độ

ánh sáng, các loài có nhiệt độ tối ưu khác nhau. Ví dụ, những loài Nitzschia thích

nghi ở nhiệt độ cao (~ 30°C) trái với Navicula lanceolata được tìm thấy ở vùng nước

lạnh. Hầu hết các loại tảo phát triển tốt ở nhiệt độ từ 17oC đến 22oC. Nhiệt độ thấp

hơn thường không giết chết tảo nhưng sẽ làm giảm tốc độ tăng trưởng của nó và trên

27oC thì nhiều loài tảo sẽ chết. Nếu cần thiết, hệ thống nuôi cấy có thể được làm mát

13

bằng dòng nước lạnh trên bề mặt bình nuôi cấy hoặc bằng cách kiểm soát nhiệt độ

không khí bằng các thiết bị điều hòa không khí [16].

Ngoài ra, thành phần sinh hóa của tảo silic cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ.

Tăng nhiệt độ quá mức tối ưu làm giảm khả năng tổng hợp protein do đó làm giảm

tốc độ tăng trưởng. Nhiệt độ thấp dưới mức tối ưu thường làm giảm tổng lượng chất

béo nhưng làm tăng hàm lượng acid béo không bão hòa, tăng tính ổn định và tính lưu

động của màng tế bào [9].

1.2.3. Thành phần dinh dưỡng

Thành phần dinh dưỡng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến

sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo. Các nguyên tố đa lượng bao gồm C, H, O, N,

P, S, Ca, Mg, K, Si cần với nồng độ cao hơn 10-2 - 10-4 mol L-1. Trong đó, ba nguyên

tố quyết định quan trọng nhất là C, N và P. Tỷ lệ mol Redfield tối ưu cho các loài ở

đáy là 119C: 17N: 1P. Silicon cũng là nguyên tố cần thiết cấu tạo nên tảo silic và

thường được biết đến với tỷ lệ 16Si: 16N: 1P.

Carbon: là một trong những nguyên tố khoáng quan trọng cần được cung cấp

cho quá trình sinh trưởng của tảo, tỷ lệ cố định carbon thấp sẽ làm giảm tốc độ tăng

trưởng của tảo. Nó cũng là yếu tố cần thiết cho quá trình quang hợp và sinh sản của

tảo. Carbon có thể được sử dụng dưới dạng carbonate hoặc bicarbonate. Khi CO2 quá

cao có thể làm giảm hàm lượng protein và các sắc tố trong tế bào.

Nitrogen: chiếm khoảng 7 - 10% trọng lượng khô tế bào, là thành phần thiết

yếu tham gia cấu tạo và thực hiện các chức năng của tảo. Các nguồn nitrogen như

nitrate, amoniac và urea, mỗi loại được sử dụng như một nguồn nitrogen duy nhất để

duy trì sự tăng trưởng và sinh sản của tảo. Chất dinh dưỡng ảnh hưởng rõ rệt đến

thành phần lipid của tảo silic nước ngọt Stephanodiscus minutulus. Khi tảo được nuôi

trong điều kiện thiếu chất dinh dưỡng sẽ tăng tích tụ chất béo trung tính và giảm lipid

phân cực. Đối với tảo silic Phaeodactylum tricornutum khi được nuôi trong điều kiện

có hàm lượng nitrogen thấp sẽ làm gia tăng tỷ lệ chất béo trung tính (từ 69 đến 75%

tổng chất béo) cùng với phospholipid (từ 6 đến 8%) [17].

Phosphorus: chiếm khoảng 1% trọng lượng khô của tảo, tham gia cấu tạo

màng sinh chất, hình thành nhiều hợp chất hữu cơ tham gia vào quá trình chuyển hóa

14

vật chất và năng lượng của tảo silic, sinh tổng hợp acid nucleic, tác dụng lên hệ keo

dưới dạng các ion, ở dạng vô cơ nó liên kết với kim loại tạo nên hệ đệm đảm bảo cho

pH ở phạm vi nhất định.

Silicon: chủ yếu tham gia cấu tạo nên vỏ của tảo silic. Khi thiếu silic sự phát

triển của tảo không bị ngừng trệ nhưng màng tế bào bị ảnh hưởng - rất khó xác định

được tên loài.

Tóm lại, các nguyên tố đa lượng vừa tham gia cấu tạo tế bào vừa là thành phần

của hệ thống đệm, điều chỉnh pH và một số vai trò khác trong tế bào tảo silic. Trái

5 mol L-1) bao gồm Cl, Fe, Mn, Zn, Cu, Ni và Mo và nó tác động đến quá trình trao

ngược với các nguyên tố đa lượng, các nguyên tố vi lượng cần ở mức thấp hơn (< 10-

đổi chất của vi tảo.

Bảng 1.1. Danh sách các chất dinh dưỡng cần thiết cấu tạo nên tảo silic

-, đại phân tử hữu cơ

-, NO2

+, NO3

Thành phần Hợp chất Sinh khối khô (mg)

650 330 100 140 47 75 80 33 C O H N Na K Ca P

2- , Cl-,…

16 S

+

75 Mg Cl

34 CO2, H2O, CO3 O2, H2O, đại phân tử hữu cơ H2O, H2S, đại phân tử hữu cơ -, urea,.. N2, NH4 NaCl, Na3PO4, Na2SO4,… KCl, K2SO4, K3PO4. CaCO3, Ca2+ Nhiều muối hữu cơ, Na hoặc K phosphate,… Nhiều muối hữu cơ, MgSO4.7H2O, amino acids Nhiều muối hữu cơ, muối SO4 Muối Na+, K+, Ca2+, NH4 FeCl3, Fe(NH4)2SO4 Fe

1.2.4. Độ mặn

Độ mặn thay đổi làm biến đổi áp suất thẩm thấu của tế bào, hạn chế quá trình

quang hợp, hô hấp, tốc độ tăng trưởng và giảm sự tích lũy glucose [12]. Ngoài ra, độ

mặn còn ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa và thành phần acid béo của tảo [9].

15

Giới hạn chịu đựng về độ mặn của tảo biển rất lớn. Hầu hết, các loài tảo được

nuôi cấy đều phát triển tốt ở độ mặn thấp hơn độ mặn của môi trường sống và điều

này có thể thực hiện được bằng cách pha loãng nước biển với nước máy. Khoảng độ

mặn từ 20 đến 25‰ tốt cho sinh trưởng của tảo silic [16].

1.2.5. Yếu tố pH

Độ pH là một thông số môi trường quan trọng vì nhiều loài tảo chỉ phát triển

trong phạm vi pH hẹp. Giá trị pH chỉ ra nồng độ carbon dioxide hòa tan trong môi

trường. Những thay đổi về pH có thể được biểu thị bằng sự xuất hiện hoặc biến mất

của các loài tảo silic vì hầu hết các loài thường tồn tại ở giá trị pH nhất định. Mỗi

loài đều có giới hạn pH khác nhau: có loài ưa axit, có loài ưa kiềm và có loài ưa pH

trung tính. Ở giá trị pH cao, hàm lượng CO2 có sẵn trong nước nhỏ sẽ hạn chế tốc độ

tăng trưởng của tảo bởi vì pH làm tăng tính linh hoạt của thành tế bào và ức chế hình

thành các bào tử từ đó làm tăng thời gian hoàn thành của chu kỳ tế bào. Ngoài ra, giá

trị pH cao còn ức chế quá trình điều hòa áp suất thẩm thấu, quang hợp và trao đổi

chất của tảo [18]. Ở giá trị pH thấp làm thay đổi sự hấp thu chất dinh dưỡng hoặc

làm tăng khả năng phát tán kim loại độc. Ribulose - 1,5 - bisphosphate carboxylase

(RuBP) không hoạt động khi pH dưới 6,5, bị ức chế khi pH = 6,8 và hoạt động tối ưu

tại pH từ 7,5 đến 7,8. Giá trị pH trên 8,0 làm hoạt tính của RuBP giảm và giảm 50%

khi pH = 8,5 [19]. Vì vậy, trong quá trình nuôi cấy tảo silic để thu được sinh khối tối

đa cần nghiên cứu giá trị pH thích hợp.

Khoảng pH nuôi cấy phù hợp cho hầu hết các loài tảo từ 7,0 - 9,0 và mức tối ưu

cho sự phát triển của tảo là 8,2 - 8,7. Nhiều khi công việc nuôi bị thất bại hoàn toàn

do tế bào bị phá vỡ vì không duy trì giá trị pH thích hợp. Trong quá trình tảo phát

triển, việc bổ sung carbon dioxide hoặc sục khí vào môi trường có thể làm tăng pH

đến 9,0 [7]. Có nhiều công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng

của tảo như tảo silic Cerataulina pelagica không thể phát triển khi pH vượt quá 8,5

[20] hay sự tăng trưởng của Skeletonema costatum, Thalassiosira pseudonana và

Thalassiosira oceanica bị ức chế khi pH vượt quá 9,4 [21]. Ngoài ra, sự tăng trưởng

của Pseudo-nitzschia multiseries bị ức chế khi pH trên 8,8 nhưng hàm lượng domoic

acid lại tăng tại giá trị pH này [22]. Tảo silic Phaeodactylum tricornutum và tảo lục

16

Dunaliella tertiolecta không thể chịu được giá trị pH cao hơn 9,5 và nó tạo ra sinh

khối tối đa ở pH từ 8,0 - 8,2. Trong điều kiện pH cao từ 10 - 12 sẽ ức chế sự tăng

trưởng của tảo vì carbon vô cơ hầu như không được tảo sử dụng, một số chất dinh

dưỡng bị kết tủa và môi trường hoàn toàn bị suy tàn [23].

1.3. Tổng quan về chi tảo Entomoneis

1.3.1. Vị trí phân loại chi tảo Entomoneis

Lịch sử của chi Entomoneis bắt đầu với Ehrenberg - người đã mô tả loài mới

Navicula alata Ehrenberg vào năm 1840 và một chi mới Amphiprora vào năm 1843

với loài điển hình Amphiprora constricta. Năm 1845, ông giải thích lại Navicula

alata của mình là Entomoneis alata Ehrenberg và tạo ra một chi mới có tên là

Entomoneis [25][26].

Năm 1975, Reimer đã sửa đổi cả hai chi và đề xuất rằng tên Entomoneis nên

được sử dụng thay vì Amphiprora, chuyển bốn loài Amphiprora sang Entomoneis là

E. robusta, E. pulchra, E. ornata, E. paludosa và thiết lập họ Entomoneidaceae

[25-27]. Họ Entomoneidaceae bao gồm Entomoneis và Plagiotropis Pfitzer nhưng

chi này đã được chuyển sang họ Plagiotropidaceae [25].

Hiện tại, họ Entomoneidaceae bao gồm hai chi: Entomoneis và Platichthys với

các đặc điểm chung như rãnh dài hình ống, mặt van bị nén, không có lớp phủ van

riêng biệt và nhiều đoạn nối. Các loài của chi Platichthys không có vỏ dạng xoắn, chỉ

có một dãy vân, không có keel hình sigma [26][27].

Chi tảo Entomoneis bao gồm các loài tảo silic có cấu trúc phức tạp. Nó thường

được tìm thấy ở vùng nước lợ trầm tích biển, thỉnh thoảng ở nước ngọt. Chi

Entomoneis có đặc điểm là sống lưng đường sigma theo chiều dài, được nâng lên từ

vỏ thân, có nhiều vành đai phức tạp, vân hoa trên mặt vỏ tế bào sắp xếp theo dạng

đối xứng hai bên đối với trục dài của mặt vỏ như dạng lông chim, có nhiều rãnh xen

kẽ, sống lưng và vỏ liên kết bởi các lỗ tạo thành các đường giao nhau [24]. Chi tảo

silic Entomoneis thuộc [28]:

17

Giới: Chromista

Giới phụ: Harosa

Ngành: Ochrophyta

Phân ngành: Khakista

Lớp: Bacillariophyceae

Phân lớp: Bacillariophycidae

Bộ: Surirellales

Họ: Entomoneidaceae

Chi: Entomoneis

1.3.2. Lược sử nghiên cứu về vi tảo

Từ lâu, vi tảo biển được nghiên cứu rộng rãi do có thành phần dinh dưỡng cao.

Vi tảo cũng sử dụng ánh sáng mặt trời để thực hiện quá trình quang hợp tạo ra chất

hữu cơ nhưng nó hoạt động hiệu quả hơn thực vật. Năm 1703 là năm khởi đầu cho

việc nghiên cứu tảo silic trên thế giới. Các nghiên cứu dần được triển khai sâu rộng

tiếp theo vào thế kỷ XIX. Năm 1999, vi tảo Entomoneis vertebralis được định danh,

phân lập ở môi trường có nồng độ muối cao và các đặc điểm hình thái, sinh thái học

của loài này cũng đã được nghiên cứu bởi Ester Clavero và cộng sự [29]. Năm 2013,

Danny C. Reinke và cộng sự đã phân lập, định danh Entomoneis reimeri bằng

phương pháp quan sát hình thái dưới kính hiển vi điện tử quét do các loài tảo silic

đặc thù bởi các rãnh và hoa vân trên vỏ. Tảo silic Entomoneis reimeri sp. nov., được

phân biệt với các loài Entomoneis khác bởi số lượng vân, thiếu các điểm nối và các

cấu trúc vi mô của mặt vân [30]. Năm 2016, Lijuan He và cộng sự đã phân lập và

nhận dạng tảo silic Entomoneis sp. MMOGRB 0374S. Loài này được phân biệt với

các loài Entomoneis khác bởi kích thước nhỏ hơn, các vân dày đặc hơn và có 94%

trình tự nucleotide tương đồng. Sinh khối đạt đến 182 mg/ L ở pha cân bằng và 229

mg/ L sau 3 ngày nuôi cấy giới hạn nitơ. Lipid được chiết xuất bằng bốn phương

pháp và phương pháp dichloromethane/ metanol là hiệu quả nhất, mang lại 36% sinh

khối khô ở pha cân bằng và 40% sau 3 ngày nuôi cấy không có nitơ. Hàm lượng

arachidonic acid chiếm từ 16% đến 19% tổng lượng axit béo [4]. Năm 2018,

Mejdandzic và cộng sự đã phân loại được loài Entomoneis tenera mới từ Biển

18

Adriati dựa vào đặc điểm hình thái (tế bào rất nhỏ, chiều dài vỏ 16 - 21 μm, chiều

rộng vỏ 5 - 20 μm, vân hình bầu dục rộng,…) và di truyền phân tử (sử dụng một gen

trong nhân SSU và hai gen trong lục lạp rbcL, psbC) [24].

Ở Việt Nam, vi tảo chủ yếu được nghiên cứu về sự phân bố và phân loại. Vào

năm 1926, Maurice Rose là người đầu tiên nghiên cứu về sinh vật phù du ở vùng

biển Việt Nam. Ông công bố danh mục gồm 13 chi, 20 loài tảo ở vịnh Nha Trang.

Từ năm 1959-1985 đã có gần 100 chuyến khảo sát trên các tàu nghiên cứu ở

Việt Nam, Trung Quốc và Liên Xô tại vịnh Bắc Bộ, vùng biển Trung bộ, Đông và

Tây bộ. Những chương trình hợp tác này cũng đã xác định trên 200 loài tảo silic.

Năm 1993, Trương Ngọc An đã phân loại tảo silic phù du ở biển Việt Nam với 481

loài thuộc 4 ngành và đã mô tả 225 loài tảo silic trong 2 bộ, 7 bộ phụ, 18 họ, 60 chi.

Mỗi loài đều được mô tả các đặc điểm rõ ràng, dễ hiểu và có các hình vẽ hoặc ảnh

chụp do chính tác giả thực hiện từ các mẫu quan sát, khiến cho những người mới bước

vào phân loại tảo có thể nhanh chóng phân biệt, nhận biết được thành phần tảo silic, sự

khác biệt giữa các chi điển hình rất thuận lợi trong nghiên cứu sinh vật phù du [1].

Vào năm 1996, Đặng Thị Sy đã định danh được 377 taxon (gồm 307 loài, 54

thứ và 16 taxa mới dừng ở bậc chi) thuộc 65 chi, 19 họ, 3 phân bộ, 6 bộ, 2 lớp Tảo

silic. Lớp Tảo silic trung tâm có 4 bộ, 12 họ, 33 chi, 173 loài, 24 thứ và 10 taxa mới

dừng ở tên chi. Lớp Tảo silic lông chim có 2 bộ, 3 phân bộ, 7 họ, 32 chi, 134 loài, 30

thứ và 6 taxa mới dừng ở tên chi [31]. Tiếp theo năm 2003, Nguyễn Văn Tuyên đã

nghiên cứu về độ đa dạng của tảo trong thủy vực nội địa Việt Nam và phát hiện được

411 loài tảo silic [32]. Năm 2007, Lương Quang Đốc đã nghiên cứu tảo silic sống

trên nền đáy mềm và một số đặc điểm sinh thái của chúng ở vùng đầm phá ven biển

tỉnh Thừa Thiên Huế [2]. Đến năm 2009, Nguyễn Thị Gia Hằng và cộng sự đã ghi

nhận được 348 taxa khuê tảo bám trong đó có 100 taxa thuộc bộ Trung tâm

(Centrales) và 238 taxa thuộc bộ Lông chim (Pennales) trong hệ sinh thái rừng ngập

mặn tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả phân tích

cho thấy có sự khác biệt quan trọng trong độ giàu và thành phần loài giữa hai loại đài

vật (mặt bùn và mặt rễ cây ngập mặn) và giữa các môi trường rừng ngập mặn khác

nhau [33]. Tiếp đến năm 2012, Mai Viết Văn đã nghiên cứu về sinh vật phù du vùng

19

ven biển tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu. Kết quả xác định được 232 loài thực vật phù du

thuộc 72 giống của 5 ngành tảo phân bố ở vùng nghiên cứu. Trong đó, ngành tảo

silic có số loài nhiều nhất với 176 loài (chiếm 75,86% tổng số loài) chiếm ưu thế ở cả

hai mùa. Vào năm 2014, Nguyễn Thị Gia Hằng đã nghiên cứu về đa dạng tảo silic ở

rừng ngập mặn Cần Giờ và vùng ven biển Đồng bằng sông Cửu Long [34].

Ngày nay, có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến sự sinh trưởng và đặc điểm

sinh lý của tảo tạo cơ sở để ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản. Năm 2010, Nguyễn

Thị Hoài Hà đã phân lập và định danh sơ bộ được 3 loài Chaetoceros muelleri;

Navicula tuscula và Navicula radiosa dựa vào đặc điểm hình thái và nghiên cứu về

đặc điểm sinh học của các loài này ở rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định. Kết quả

cho thấy rằng cả ba chủng này đa dạng về thành phần các loại acid béo nên có thể

ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, làm tăng chất lượng con giống [35]. Vào năm

2012, Nguyễn Thị Hương và cộng sự đã thu thập và nuôi sinh khối tảo silic Navicula

cari và Nitzschia closterium làm thức ăn thủy sản [36]. Ảnh hưởng của mật độ ban

đầu và pH đến sự sinh trưởng, mật độ cực đại và thời gian đạt pha cân bằng của tảo

Thalassiosira pseudonana (Hasle & Heimdal) được nghiên cứu bởi Trần Thị Lê

Trang và Lục Minh Diệp trong năm 2017. Nghiên cứu cho thấy rằng tảo được nuôi ở

mật độ 15x104 tb/ mL và pH từ 7,5 - 8,0 cho sinh khối cao nên được sử dụng trong

thực tiễn sản xuất [37].

So với các chi tảo silic khác như Amphora, Navicula, Chaetoceros,

Skeletonema… thì chi tảo Entomoneis được nghiên cứu ít hơn. Các nghiên cứu gần

như chỉ phân lập và định danh loài dựa vào hình thái mà chưa nghiên cứu nhiều về

các đặc điểm sinh lý.

Từ những nghiên cứu trên cho thấy, cơ sở dữ liệu về tảo silic ở nước ta còn khá

ít nhưng hiện nay nhờ sự phát triển của khoa học kĩ thuật nên đã dễ dàng phân lập,

định danh cũng như thống kê thành phần loài. Càng ngày càng có nhiều công trình đi

sâu vào nghiên cứu đặc điểm sinh lý và sinh hóa của tảo silic để phục vụ thực tiễn.

Tuy nhiên, có rất ít công trình nghiên cứu về tác động của biến đổi khí hậu lên sinh

trưởng và sinh lý của nó.

20

1.3.3. Ứng dụng thực tiễn của một số loài thuộc chi tảo Entomoneis

Tảo silic là loài tảo giàu chất dinh dưỡng, được sử dụng làm nguồn thức ăn cho

lớp hai mảnh vỏ. Thực nghiệm cho hàu ăn với tảo có hàm lượng carbohydrate,

protein và acid béo không bão hòa cao làm tăng tốc độ tăng trưởng của hàu [38]. Kết

quả nghiên cứu của Soares và cộng sự vào năm 2013 cho thấy Entomoneis alata có

hàm lượng EPA cao (chiếm 9,7%) và DHA chiếm 0,4%. Vì vậy, nó được ứng dụng

nhiều trong ngành dược phẩm và thực phẩm. Tuy nhiên, hàm lượng acid béo không

bão hòa cao làm cho tảo này không phù hợp để sản xuất diesel sinh học [39]. Ngoài

ra, chi tảo Entomoneis còn chứa chất 6-Sulfo-O-alpha-D quinovopyranosyl

diacylglycerol là một chất được sử dụng để ức chế Na+, K+ - ATPase [40].

Entomoneis cf. punctulata được dùng để kiểm tra độc tính trên toàn bộ trầm tích vì

khả năng chịu đựng tốt với hàng loạt các thông số hóa lý nước và trầm tích bao gồm

độ mặn, pH, ammonia và sulfide [41].

21

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian, địa điểm và vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Thời gian nghiên cứu

Tháng 9/2018 đến tháng 3/2019.

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Sinh học - Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên - Trường Đại

học Sài Gòn TP. Hồ Chí Minh.

2.1.3. Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là tảo silic Entomoneis sp. được Nguyễn Văn Duy thu

106°51'49.73" và đang được lưu giữ tại phòng thí nghiệm Sinh học của Trường Đại

mẫu vào tháng 6 năm 2018 tại sông Dần Xây, vĩ độ 10°28'49.14", kinh độ

học Sài Gòn. Hình 2.1 mô tả hình thái Entomoneis sp. đã được phân lập bao gồm ảnh

SEM (e), ảnh chụp tế bào đã làm sạch nội chất (d), ảnh chụp tế bào sống (a-c) dưới

kính hiển vi bội giác 40X. Chi tảo Entomoneis có mảnh vỏ dạng lá bưởi hay đàn

violon, ngoài ra mảnh vỏ còn có hình mác khi nội chất tụ lại theo trục đỉnh. Tế bào

thường vặn xoắn và phân chia theo trục đỉnh. Rãnh vỏ song song, trong khoảng 10

μm có khoảng 34 - 36 rãnh, đường lỗ hình cung, một dãy ngắn các lỗ nhỏ và hẹp về

phía cuối sống lưng, chiều rộng vỏ 10 - 19 μm, chiều dài vỏ 29 - 45 μm [6].

Hình 2.1. Hình thái tảo Entomoneis sp., thanh thước tỉ lệ ứng với 10 μm [6]

22

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Hình 2. 2. Sơ đồ mô tả các bước nghiên cứu trong đề tài

2.2.2. Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm, môi trường và nguồn giống

- Chuẩn bị dụng cụ

Bình tam giác 1000 mL, 500 mL, 250 mL, bình trung tính 1000 mL, lọ thủy

tinh đựng hóa chất, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, phễu…

được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó tráng lại thật sạch với nước ngọt, đậy nút bông

và được sấy ở nhiệt độ 1200C, trong thời gian 30 phút. Các dụng cụ khác như đầu tip,

eppendorf, micropipette, thùng xốp, giá đựng eppendoft, hộp đựng eppendoft, hộp

đựng đầu tip, giấy nhôm, băng keo hấp khử trùng, băng keo giấy, bút lông dầu, kéo,

kẹp, giấy báo tạp chí, đèn cồn,…được vệ sinh sạch sẽ.

- Chuẩn bị môi trường F/2

Môi trường F/2 [42] bao gồm nước biển tự nhiên ở rừng ngập mặn Cần Giờ đã

lọc bằng màng lọc 0,22 µm bổ sung thêm các khoáng đa lượng (NaNO3,

NaH2PO4.H2O, Na2SiO3.9H2O), 7 loại khoáng vi lượng và 3 loại vitamin.

Cần pha dung dịch gốc sơ cấp cho từng khoáng vi lượng và vitamin trước khi

pha dung dịch gốc để dùng cho môi trường cuối cùng. Sau khi bổ sung đầy đủ các

23

thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin, môi trường được đem hấp vô

trùng và lưu trữ để sử dụng.

- Chuẩn bị nguồn giống

Tảo silic được chọn có tốc độ sinh trưởng cao, năng suất quang hợp cao, có khả

năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh, tế bào tảo ở trạng thái huyền phù,

không kết dính vào thành và đáy bình nuôi cấy. Dịch vi tảo thuần chủng được thu ở

cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng tảo là tốt nhất. Tế bào vi tảo có màu vàng

nâu, không bị hoại tử, gãy góc, vón cục. Vi tảo được nuôi trong bình tam giác 250

mL, lượng môi trường và mẫu không quá 30% dung tích bình sau đó đặt vào phòng

nuôi cấy ở nhiệt độ 22 ÷ 240C, quan sát hằng ngày.

2.2.3. Định danh phân tử tảo Entomoneis sp. bằng mã vạch ADN

- Thu sinh khối và lưu giữ tảo

Mẫu tảo được lọc qua giấy lọc Whatman đường kính 47 mm bằng máy hút chân

không. Sau đó, mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ -30oC cho đến khi xử lý.

Hình 2.3. Thiết bị thu sinh khối tảo

- Tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số tách chiết từ mẫu tảo silic Entomoneis sp. được thực hiện theo

phương pháp CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) với một số cải tiến nhỏ:

Bước 1: Đặt mẫu lọc vào cối, thêm 1 mL dung dịch đệm chiết và nghiền mạnh.

Tiếp tục thêm 1 mL dung dịch đệm chiết và nghiền. Chuyển vào 4 eppendorf (2 mL).

24

Rửa cối bằng 1 mL dung dịch đệm chiết rồi chia đều vào 4 eppendorf. Cho các mẫu

vào bể ủ ở nhiệt độ 600C trong 30 phút và đảo nhẹ mẫu sau 10 phút.

Bước 2: Sau 30 phút thêm một lượng tương đương dung dịch chloroform, đảo

đều mẫu trong 5 phút. Ly tâm các mẫu 8000 vòng, trong 15 phút, ở nhiệt độ 40C. Thu

phần dịch trong phía trên chứa ADN (thể tích từ 500 - 800 µL) chuyển sang

eppendorf mới.

Bước 3: Cho một lượng isopropanol tương đương thể tích với dịch trong vừa

chuyển, đảo nhẹ sau đó ủ ở nhiệt độ -200C từ 2 đến 3 giờ. Sau thời gian ủ tiến hành

ly tâm 8000 vòng, trong 15 phút, ở nhiệt độ 40C, sau đó loại bỏ phần dịch nước (cẩn

thận không làm trôi phần ADN dưới đáy eppendorf).

Bước 4: Rửa ADN bằng 500 µL dung dịch cồn 70%, ủ trong 30 phút, ở nhiệt độ

100C. Sau khi ủ tiến hành ly tâm 8000 vòng, trong vòng 15 phút, ở nhiệt độ 40C, loại

bỏ dung dịch cồn. Để khô các mẫu ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Thu hồi các mẫu

vào một eppendorf bằng 80 µL dung dịch đệm TE.

- Kiểm tra độ tinh sạch của ADN

Kiểm tra ADN tổng trên gel điện di. Độ tinh sạch còn thể hiện qua tỉ số hấp thụ

của hai bước sóng 260/280. Nếu đạt từ 1,8 - 2,0 là đủ tiêu chuẩn về độ tinh sạch cho

phản ứng PCR [43].

- Khuếch đại gen chỉ thị rbcL-3P bằng kỹ thuật PCR

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu CfD và DP rbcL7 (Hình 2.4) nhằm khuếch đại trình

tự vùng gen rbcL-3P bằng kỹ thuật PCR trên máy PCR major cycler, model cycler-

25, USA [61]

Hình 2.4. Sơ đồ thiết kế mồi để khuếch đại trình tự gen rbcL-3P [61]

25

Phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện với tổng thể tích 25 µL (Bảng 2.7)

Bảng 2.1. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại trình tự rbcL-3P

STT Thành phần Thể tích (µL)

Taq Mix 12,5 1

Mồi CfD 1 2

Mồi DP rbcL7 1 3

ADN khuôn 1 4

Nước cất vô trùng 9,5 5

Tổng thể tích 25

Hút các thành phần Taq Mix, cặp mồi, ADN khuôn và nước cất vô trùng cho

vào các eppendorf 0,2 mL. Huyền phù nhẹ nhàng để hoà trộn đều các thành phần

phản ứng, sau đó li tâm nhanh 15 giây rồi đặt các eppendorf vào các khuôn ủ nhiệt

của máy PCR. Tiến hành chạy chương trình nhiệt để thực hiện phản ứng khuếch đại

trình tự rbcL-3P (Bảng 2.8).

Bảng 2.2. Chu kì nhiệt khuếch đại trình tự rbcL-3P

Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

Tiền biến tính 95oC 2 phút 1

Biến tính 94oC 20 giây

35 Bắt cặp 50oC 30 giây

Kéo dài 72oC 2 phút

Kết thúc 72oC 7 phút 1

- Kỹ thuật điện di ADN trên gel agarose

Chuẩn bị gel: cân 0,3 g agarose rồi thêm vào 40 mL dung dịch đệm TE 1X

(Tris - HCl - EDTA), đun hỗn hợp đến khi tan hoàn toàn, khuấy đều và làm nguội rồi

cho vào khuôn đã gắn lược, để yên khoảng 30 phút cho gel đông.

Đặt khuôn gel vào máng điện di có chứa TE 1X sao cho dung dịch đệm ngập

trên gel khoảng 1 cm, giếng lược của bản gel đặt về phía cực âm.

ADN tổng số được chiết xuất và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng việc chạy điện

di với agarose gel 1% ở 90V, I = 3A, thời gian 30 phút trong dung dịch đệm TE 1X.

26

- Giải trình tự và hiệu chỉnh

Sản phẩm PCR nhân bản thành công gen rbcL-3P sẽ được gửi đi giải trình tự

hai chiều (với mồi xuôi và mồi ngược) tại Trung tâm Công nghệ sinh học Số 2374,

Quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, Q.12, TP.HCM.

Kết quả giải trình tự gen được hiệu chỉnh bằng Multiple Sequence Alignment

(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle), trình tự đồng nhất (consensus sequence) được

rút ra từ hai kết quả giải trình tự và kiểm tra các sai lệch. Trình tự gen này sẽ được so

sánh và sắp xếp (alignment) bằng thuật toán Clustal W. Sau đó, các trình tự được so

sánh với dữ liệu của ngân hàng gen NCBI bằng công cụ giải thuật so sánh các chuỗi

sinh học (BLAST) để định danh loài Entomoneis sp.

Cây phát sinh loài được xây dựng trên phương pháp Maximum - Likelihood.

Cây phát sinh Maximum - Likelihood được xây dựng theo mô hình Kimura 2 thông

số, phân tích bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (resampling) bằng phần mềm MEGA

6.0 [44].

2.2.4. Xác định mật độ tế bào tảo silic Entomoneis sp.

- Sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer cải tiến

Buồng đếm hồng cầu Neubauer cải tiến có 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có

16 ô vuông nhỏ, mỗi ô vuông nhỏ có diện tích 1/400 mm2 và độ sâu buồng đếm là

0,1 mm. Đếm số lượng tảo có trong 4 ô lớn (Hình 2.5).

Lắc đều mẫu tảo silic, dùng micropipet hút mẫu tảo silic cho vào buồng đếm đã

được đậy sẵn lamen, chờ lắng 2 phút, sau đó đưa vào thị trường kính để đếm. Mẫu

được đếm hằng ngày vào lúc 8 giờ sáng dưới kính hiển vi quang học Zeiss ở bội giác

10X và 40X, mỗi mẫu tảo silic được đếm 3 lần. Phương pháp dựa trên cơ sở đếm số

tế bào có mặt trong một thể tích xác định sau khi đã bám dính vào một mặt phẳng

trong độ sâu thị trường của hệ thống thị kính - vật kính (Hình 2.5).

27

Hình 2.5. Thiết bị buồng đếm hồng cầu xác định mật độ tảo

Tổng số tế bào đếm được trong các lần đếm được dùng để tính mật độ tế bào

theo công thức [45]:

n: tổng số tế bào đếm được

i: số lần đếm tế bào

D: mật độ tế bào

- Đo mật độ quang của tảo silic Entomoneis sp.

Phương pháp đo mật độ quang (OD) còn được gọi là phương pháp đo độ hấp

thụ hoặc độ đục, giúp xác định mật độ tế bào trong các nghiên cứu sinh lý cũng như

xác định sự tăng trưởng qua các pha của vi tảo. Đây là phương pháp gián tiếp cho

thấy sự tương quan giữa mật độ vi tảo với độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng cụ thể.

Phương pháp đếm tế bào tốn thời gian, do đó đo mật độ quang là một phương pháp +

28

nhanh và hiệu quả. Lượng ánh sáng được hấp thụ bởi dịch huyền phù tế bào có

thể liên quan trực tiếp đến sinh khối hoặc số lượng tế bào [46].

Mối quan hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ cực đại và mật độ tế bào Entomoneis

sp. được xác định theo phương trình tuyến tính:

Mật độ tế bào = 322,22OD 680 - 2,8115

Hệ số xác định của mô hình hồi quy tương đối cao (R2 = 0,9537) (Hình 2.6) cho

thấy mối quan hệ giữa mật độ tế bào và độ hấp thụ là phù hợp với phương trình tuyến

tính này.

Hình 2.6. Mối tương quan tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ hấp thụ [6]

2.2.5. Xác định thời gian thế hệ và tốc độ tăng trưởng

Khi môi trường nuôi cấy thuận lợi và đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho

sự tăng trưởng của vi tảo, vi tảo sinh sản vô tính. Kích thước và sinh khối của các tế

bào riêng lẻ tăng theo thời gian. Thời gian cần thiết để số lượng tế bào tăng gấp đôi

được gọi là thời gian nhân đôi hay thời gian thế hệ (td), vì đó là thời gian để tảo phát

triển và tạo ra một thế hệ mới. Số lượng tế bào trong pha lũy thừa được mô tả như

sau [46]:

No = Số lượng tế bào ban đầu

n = Thế hệ

29

Mật độ tế bào ở hai thời điểm khác nhau trong quá trình tăng trưởng được dùng

để tính tốc độ tăng trưởng trong khoảng thời gian đó, theo công thức [47]:

μ: tốc độ tăng trưởng đặc trưng (d-1)

tt và t0: hai thời điểm trên đường cong tăng trưởng

Nt và N0: mật độ tế bào ở các thời điểm tương ứng

Thời gian thế hệ (td) được tính theo công thức sau:

Thời gian phân chia mỗi ngày (Dd) được tính theo công thức sau:

Năng suất sinh khối (BM) được tính theo công thức [48]:

2.2.6. Đo hiệu suất lượng tử tối đa của quang hệ II

Hiệu suất lượng tử tối đa của quang hệ II (Fv/ Fm) được đo bởi máy Aquapen

C-AP-100, bằng cách lấy 2 mL dung dịch nuôi tảo cho vào cuvet (10×10 mm) đã

được ủ tối 5 phút (Hình 2.4). Máy đo huỳnh quang dựa trên nguyên lý: khi tế bào

quang dưỡng trong tối được chiếu sáng thì tất cả trung tâm phản ứng được mở và sẵn

sàng nhận kích thích, vì vậy trường huỳnh quang lúc này là thấp nhất (Fo). Khi ánh

sáng bão hòa, các trung tâm phản ứng đóng lại và hiệu suất lượng tử PSII lớn nhất

(Fm). Biến thiên huỳnh quang Fv được sử dụng để đánh giá hiệu suất lượng tử của

phản ứng quang hóa trong quá trình quang hợp. Nhiều tài liệu cho thấy chỉ số Fv/ Fm

là chỉ thị tốt để nghiên cứu khả năng quang hợp, điều kiện sinh lý của thực vật phù

du và được tính theo công thức: Fv/ Fm = (Fm - Fo)/ Fm [49].

30

Hình 2.7. Thiết bị đo hiệu suất lượng tử tối đa của quang hệ II

2.2.7. Xác định pH của dịch nuôi tảo

pH của môi trường nuôi cấy được đo hằng ngày vào lúc 9 giờ bằng đầu dò cầm

tay Consort - C1010 của Bỉ, độ chính xác 0,01 (Hình 2.5).

pH được điều chỉnh với 1M NaOH và 1M HCl [50] trước khi hấp để tránh hiện

tượng kết tủa.

Hình 2.8. Thiết bị đo pH

2.2.8. Bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí trong phòng thí nghiệm Sinh học, được thiết kế đặc

biệt và có đầy đủ các thiết bị phục vụ cho việc nuôi sinh khối tảo, khảo sát các đặc

điểm sinh trưởng và sinh lý của nó. Nghiên cứu được chia làm 2 thí nghiệm:

31

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của mật độ ban đầu đến sự sinh trưởng của

Entomoneis sp. đã được định danh. Các mật độ thí nghiệm: 5x104 tb/ mL; 10x104 tb/

mL; 15x104 tb/ mL; 20x104 tb/ mL. Tảo silic Entomoneis sp. được cấy theo phương

pháp mẻ bán liên tục trong các bình tam giác 250 mL, chứa 100 mL mẫu với môi

trường F/2. Các bình tam giác được đậy kín bằng nút bông không thấm, phủ kín bên

ngoài nút bằng giấy nhôm, hấp vô trùng trước khi sử dụng. Điều kiện môi trường với

cường độ ánh sáng khoảng 2500 lux, nhiệt độ là 24 ± 2oC (đặt trong phòng có máy

điều hòa), chu kì quang 12h:12h, pH=7,0 Các thí nghiệm được lặp lại 4 lần (tổng số

là 4x4 = 16 nghiệm thức).

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và sinh lý của tảo

silic Entomoneis sp. đã được định danh. Tảo silic Entomoneis sp. được cấy theo

phương pháp mẻ bán liên tục trong các bình tam giác 250 mL, chứa 100 mL mẫu với

môi trường F/2 và mật độ ban đầu phụ thuộc vào kết quả thí nghiệm 1. Thí nghiệm

được tiến hành với 6 giá trị pH khác nhau 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và được lặp lại 4

lần (tổng số là 4x6 = 24 nghiệm thức) trong phòng thí nghiệm với cường độ ánh sáng

khoảng 2500 lux, chu kì quang 12h:12h, nhiệt độ 24 ± 2oC.

2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được thu trực tiếp trong quá trình tiến hành thí nghiệm. Tất cả các

thí nghiệm được thực hiện trong bốn lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị

trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Dữ liệu được phân tích bằng phép phân tích

phương sai một yếu tố (ANOVA) trên phần mềm SPSS 20.0. Sử dụng Duncan Post

Hoc trong phân tích ANOVA để xác định sự sai khác có ý nghĩa giữa các công thức

thí nghiệm (mức ý nghĩa α = 0,05).

32

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân tích trình tự vùng gen rbcL-3P của Entomoneis sp.

3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số và khuếch đại vùng gen rbcL-3P bằng

kĩ thuật PCR

- Kết quả tách chiết ADN tổng số

+ Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy ADN tổng số sáng rõ, sắc nét và

không bị đứt gãy.

+ Kết quả đo OD cũng cho thấy mẫu ADN tổng số có độ tinh sạch cao (tỉ số

hấp thụ của hai bước sóng 260/280 là 1,9) đủ tiêu chuẩn cho phản ứng PCR (Hình

3.1). Các mẫu ADN tổng số được bảo quản ở -30 ºC cho đến khi sử dụng.

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của ADN bằng Nanodrop

- Kết quả khuếch đại vùng gen rbcL-3P bằng kĩ thuật PCR

Dựa vào kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% thể hiện trong hình

3.2 cho thấy các băng ADN đều sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí ở giữa băng 800 bp

và 900 bp. Sản phẩm PCR có kích thước phân tử phù hợp với dự tính ban đầu. Như

vậy, quá trình khuếch đại trình tự đoạn gen rbcL-3P tảo silic Entomoneis sp. đã thành

33

công và sản phẩm này có thể được sử dụng để giải trình tự. Kết quả giải trình tự cũng

sẽ phản ánh mức độ đáng tin cậy của sản phẩm khuếch đại.

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng rbcL-3P của tảo silic Entomoneis

sp. (1) và thang ADN chuẩn (2)

3.1.2. Kết quả phân tích trình tự sau khi hiệu chỉnh

Kết quả giải trình tự cung cấp bởi dịch vụ của Trung tâm Công nghệ Sinh học

Thành phố Hồ Chí Minh. Trình tự vùng gen rbcL-3P sau khi loại bỏ vùng mơ hồ do

lỗi đọc trình tự nằm ở hai đầu kết quả giải trình tự có độ dài trong khoảng 854 bp.

Kết quả đúng với lý thuyết, cho thấy quá trình khuếch đại trình tự vùng rbcL-3P đã

thành công.

Theo nghiên cứu của Hamser và cộng sự vào năm 2011, khi phân tích vùng

trình tự rbcL-3P của Sellaphorga spp., kích thước vùng này khoảng 748 bp [51].

Để kiểm tra độ tin cậy của trình tự, sử dụng kĩ thuật BLAST để xác nhận trình

tự tương đồng. Kết quả cho thấy đều là các trình tự vùng rbcL-3P của Entomoneis,

với giá trị độ bao phủ 95%, giá trị độ tương đồng cao từ 97 - 99%, chứng tỏ mẫu

nghiên cứu đạt độ tin cậy cao và loài Entomoneis sp. trong nghiên cứu này có quan

hệ gần gũi nhất với loài Entomoneis umbratica (Hình 3.3).

34

Hình 3.3. Kết quả tra cứu bằng kĩ thuật BLAST trên GenBank

35

3.1.3. Xây dựng cây phát sinh chủng loài đối với trình tự rbcL-3P

Sử dụng dữ liệu trình tự tham khảo trên GenBank để so sánh với các trình tự

trong nghiên cứu bởi các lý do sau: các trình tự này đạt chiều dài đủ theo yêu cầu

khoảng 800 - 900 bp, có độ bao phủ cao và độ tương đồng đạt 95 - 99% (Bảng 3.1).

Bảng 3. 1. Kết quả BLAST vùng gen rbcL-3P các mẫu tương đồng trên cơ sở dữ

liệu của GenBank

Mức độ Mức độ Mã số trình tự STT Tên loài trùng khớp tương đồng trong GenBank trình tự di truyền

Entomoneis umbratica 95% 99% 1 MF000629.1

Entomoneis infula 95% 98% 2 MF000634.1

Entomoneis infula 95% 98% 3 MF000628.1

Entomoneis tenera 95% 98% 4 KX591888.1

Entomoneis cf alata 95% 98% 5 MF000636.1

Entomoneis gracilis 95% 97% 6 MF000635.1

Entomoneis vilicicii 95% 97% 7 MF000639.1

Từ kết quả phân tích so sánh trình tự, cây phát sinh chủng loài được xây dựng

dựa trên trình tự vùng gen rbcL-3P (Hình 3.4).

Thực hiện quá trình sắp cột thẳng hàng trình tự vùng gen rbcL-3P bằng thuật

toán Clustal W. Dựa trên chiều dài của trình tự, chọn điểm thông tin di truyền để

thiết lập vùng phân tích. Điểm được chọn lựa phải thỏa mãn là chúng tồn tại ở tất cả

các trình tự.

Trước khi xây dựng cây phát sinh chủng loại vùng rbcL-3P cần lựa chọn mô

hình phân tích, phần mềm Mega 6.0 sẽ giúp thực hiện phép tính để lựa chọn mô hình

phân tích hợp lý và hiệu quả nhất.

Kết quả cho thấy phương pháp Maximum - Likehood với giá trị bootstrap 1000

là mô hình phân tích hợp lý và chính xác.

36

Hình 3.4. Mô hình cây phát sinh của Entomoneis sp. phân tích bằng trình tự

vùng gen rbcL-3P trong nghiên cứu này

Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài cho thấy Entomoneis sp. trong

nghiên cứu này có quan hệ gần gũi nhất với Entomoneis umbratica với độ tin cậy

68% và tạo thành 1 nhóm riêng.

Như vậy, với gen chỉ thị rbcL-3P cho thấy loài này có độ tương đồng cao (99%)

với Entomoneis umbratica.

3.2. Ảnh hưởng của mật độ ban đầu đến sự sinh trưởng của tảo silic Entomoneis

sp. trong môi trường F/2

3.2.1. Đường cong tăng trưởng của tảo silic Entomoneis sp.

Mật độ ban đầu trong nuôi cấy tảo silic ảnh hưởng rất lớn đến sinh khối cũng

như thời gian tảo đạt mật độ cực đại và nó có ý nghĩa rất lớn trong thực tế sản xuất

thức ăn thủy sản. Mỗi loài khác nhau thường có mật độ ban đầu khác nhau như

Navicula incerta được nuôi cấy ở mật độ 5x104 tb/ mL [52]; 0,1x104 tb/ mL đối với

loài Skeletonema costatum [53]; còn ở Thalassiosira pseudonana là 15x104 tb/ mL

nhằm tiết kiệm nguồn tảo giống và đem lại hiệu quả kinh tế cho người nuôi [37].

Tóm lại, tùy thuộc vào mục đích mà lựa chọn mật độ ban đầu sao cho thích hợp.

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy trong khoảng 7 ngày đầu nuôi cấy, sự tăng trưởng

của tảo silic Entomoneis sp. diễn ra nhanh. Mật độ tế bào ban đầu càng cao thì số

lượng tế bào tăng càng nhiều và thời gian đạt mật độ càng ngắn vì số lượng tế bào

37

ban đầu tham gia vào quá trình phân chia nhiều.

Sau ngày thứ 7, mật độ tảo đã có sự biến đổi. Với mật độ ban đầu 5x104 tb/ mL,

15x104 tb/ mL và 20x104 tb/ mL số lượng tảo tiếp tục tăng; còn ở mật độ ban đầu

10x104 tb/ mL thì số lượng tế bào lại giảm, sau đó đạt cực đại 54,19 ± 2,41x104 tb/

mL ở 9 ngày nuôi cấy. Với mật độ 5x104 tb/ mL, 15x104 tb/ mL và 20x104 tb/ mL thì

số lượng tế bào đạt cực đại lần lượt 47,45 ± 2,22 x104 tb/ mL; 56,72 ± 2,51 x104 tb/

mL và 62,19 ± 2,25 x104 tb/ mL ở ngày thứ 10, 9 và 8 (Bảng 3.2).

Sự tàn lụi của tảo silic Entomoneis sp. bắt đầu sớm ở mật độ 20x104 tb/ mL, sau

khi đạt mật độ cực đại vào ngày thứ 8 là 62,19 ± 2,25 x104 tb/ mL và ngày thứ 9

giảm xuống còn 59,72 ± 2,02 x104 tb/ mL. Đến ngày thứ 10 tảo silic ở mật độ 10x104

tb/ mL và 15x104 tb/ mL cũng bắt đầu tàn lụi. Tảo silic ở mật độ 5x104 tb/ mL bắt

đầu tàn lụi vào ngày thứ 11 khá chậm so với các nghiệm thức khác .

Bảng 3.2. Mật độ tế bào tảo silic Entomoneis sp. dưới ảnh hưởng của các mật độ

ban đầu khác nhau

Thời gian (ngày) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Mật độ tế bào (104 tb/ mL) 15 15,00b ± 0,00 22,84b ± 1,7 30,33b ± 3,36 34,35b ± 2,28 42,98b ± 3,62 41,8b ± 1,59 46,82a ± 2,46 49,12b ± 1,56 54,89b ± 3,00 56,72ab ± 2,51 50,08a ± 2,96 47,33b ± 3,35 50,18a ± 3,57 46,15b ± 2,64 41,63b ± 2,57

10 10,00c ± 0,00 19,25c ± 0,71 26,75b ± 0,79 27,29c ± 0,17 35,37c ± 1,18 38,6c ± 1,86 41,71b ± 1,19 49,1b ± 1,93 47,85c ± 1,78 54,19b ± 2,41 48,54a ± 1,79 45,62c ± 2,28 48,48a ± 1,99 41,4c ± 1,78 38,19b±1,77 5 5,00d ± 0,00 7,72d ± 1,21 13,45c ± 3,38 20,28d ± 3,02 28,36d ± 2,61 33,09d ± 1,88 b 39,83 ± 0,97 41,03c ± 2,35 43,66d ± 2,08 45,38c ± 3,78 47,45a ± 2,22 41,08b ± 1,48 42,09b ± 1,08 39,84c ± 0,74 34,1c±3,34 20 20,00a ± 0,00 29,42a ± 2,01 37,04a ± 2,04 42,36a ± 0,78 49,75a ± 2,11 50,77a ± 0,93 46,82a ± 2,05 55,01a ± 2,39 62,19a ± 2,25 59,72a ± 2,02 50,28a ± 0,12 54,54a ± 2,56 50,29a ± 0,92 56,46a ± 2,72 57,56a ± 1,9

* Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 4 lần. Số liệu trình bày ở bảng 3.2 là giá trị trung bình ± SD (x104 tb/ mL). Chữ cái viết kèm bên trên thể hiện sự khác nhau có

ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)

38

Như vậy, sau các ngày nuôi cấy quần thể tảo silic sinh trưởng tốt ở tất cả các

mật độ và cả 4 mật độ đều cho thấy quần thể không trải qua pha tiềm phát mà tăng

trưởng mạnh (Hình 3.5). Mặc dù, ở mật độ 20x104 tb/ mL thời gian đạt mật độ cực

đại nhanh nhất nhưng đường cong tăng trưởng không ổn định nhất. Ở mật độ 15x104

tb/ mL, 10x104 tb/ mL thời gian đạt mật độ cực đại chậm hơn, giữa hai mật độ này

không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê, đường cong tăng trưởng chưa ổn

định và không có dạng hình chữ S điển hình. Ở mật độ 5x104 tb/ mL mặc dù thời

gian tăng trưởng của quần thể kéo dài hơn vì ban đầu mật độ thấp nên số lượng tế

bào phân chia thấp, pha tăng trưởng kéo dài nhưng đường cong tăng trưởng gần như

đều đặn và ổn định nhất từ pha lũy thừa đến pha suy vong, có dạng điển hình, màu

sắc dịch nuôi thay đổi rõ ràng qua các ngày.

Hình 3.5. Đường cong tăng trưởng của Entomoneis sp. ở các mật độ ban đầu

khác nhau

So sánh với các nghiên cứu trước đó thì tảo silic Entomoneis sp. được nuôi cấy

trong môi trường F/2 cho mật độ tế bào cao hơn môi trường DAM (Bảng 3.3.).

39

Bảng 3.3. Mật độ tế bào cực đại của tảo silic Entomoneis sp. trong môi trường

DAM và F/2

Môi trường 5x104 tb/ mL 10x104 tb/ mL 15x104 tb/ mL 20x104 tb/ mL

DAM [6] 28,12 ± 1,71 30,38 ± 2,26 33,6 ± 1,4 45,41 ± 3,18

47,45 ± 2,22 54,19 ± 2,41 56,72 ± 2,51 62,19 ± 2,25 F/2

Kết quả bảng 3.3. cho thấy môi trường DAM tảo phát triển kém, ở mật độ

5x104 tb/ mL sinh khối chỉ đạt 28,12 ± 1,71 x 104 tb/ mL trong 9 ngày nuôi cấy. Với

môi trường F/2 tảo phát triển tốt hơn, mật độ cực đại đạt 47,45 ± 2,22x104 tb/ mL

trong 10 ngày nuôi cấy. Điều này có thể giải thích dựa vào thành phần và hàm lượng

dinh dưỡng của từng môi trường. Hai môi trường trên đều có các thành phần chính là

NaNO3, NaH2PO4, Na2SiO3, EDTA, FeCl3. Tuy nhiên, hàm lượng của các thành phần

đạm, lân, silic trong môi trường DAM thấp hơn môi trường F/2 nên số lượng tảo

được nuôi trong môi trường F/2 có thể có mật độ cao hơn.

3.2.2. Màu sắc dịch nuôi tảo silic Entomoneis sp. trong môi trường F/2

Sự tăng trưởng của tảo silic Entomoneis sp. còn được thể hiện qua màu sắc dịch

nuôi (Hình 3.6). Vào những ngày đầu của quá trình nuôi cấy, màu sắc dịch nuôi tảo

silic chưa có sự thay đổi nhiều. Từ ngày thứ 3 trở đi, màu sắc dịch nuôi vàng hơn vì

tế bào phân chia mạnh làm tăng số lượng tế bào trong quần thể.

Màu vàng nâu đậm dần vào các ngày tiếp theo và đậm nhất vào ngày thứ 10

ứng với lúc mật độ tế bào đạt cực đại, kích thước tế bào tăng, thể sắc tố đậm chiếm

trọn thể tích tế bào. Đến ngày thứ 11 màu sắc dịch nuôi vẫn còn đậm nhưng trong

bình xuất hiện nhiều tế bào chết, tốc độ phân chia giảm, kích thước tế bào nhỏ dần,

mất dạng điển hình, sắc tố trong tế bào phân mảnh và nhạt dần.

Màu sắc của dịch nuôi giảm dần vào các ngày cuối cùng của pha sinh trưởng vì

số lượng tế bào chết trong các bình nuôi cấy gia tăng, sự thoát sắc tố diễn ra mạnh.

Hiện tượng kết dính rồi bám vào đáy bình của tảo silic cũng xuất hiện vào những

ngày cuối pha.

40

Hình 3.6. Màu sắc dịch nuôi Entomoneis sp. từ ngày 1 đến ngày 14

3.2.3. Tốc độ tăng trưởng, năng suất sinh khối của Entomoneis sp.

Khi môi trường nuôi cấy thuận lợi và đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho sự

sinh trưởng của vi tảo, vi tảo sinh sản vô tính. Kích thước và sinh khối của các tế bào

riêng lẻ tăng theo thời gian, dẫn đến tăng sinh khối. Như vậy, tốc độ tăng trưởng và

năng suất sinh khối có liên quan mật thiết với nhau và được thể hiện rõ qua bảng 3.4.

Bảng 3.4. Tốc độ tăng trưởng, thời gian phân chia mỗi ngày, thời gian thế hệ và

năng suất sinh khối của Entomoneis sp. ở các mật độ khác nhau

Mật độ tế bào (x104 tb/ mL)

0,44a ± 0,04 0,20b ± 0,02 0,21b ± 0,04 0,18b ± 0,03

5 10 15 20

0,63a ± 0,06 0,29b ± 0,03 0,30b ± 0,06 0,25b ± 0,04

Tốc độ tăng trưởng (1/ngày)

1,60b ± 0,15 3,45a ± 0,39 3,38a ± 0,6 4,04a ± 0,70

Thời gian phân chia mỗi ngày

Thời gian thế hệ

Năng suất sinh khối (104tb/ mL/ngày) 6,97a ± 1,46 5,37a ± 0,63 6,71a ± 1,41 6,77a ± 1,08

* Tất cả các thí nghiệm đều lặp lại 4 lần. Số liệu trình bày ở bảng 3.4 là giá trị

trung bình ± SD. Chữ cái viết kèm bên trên thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa về mặt

thống kê (p < 0,05).

41

Ở mật độ ban đầu 5x104 tb/ mL, tốc độ tăng trưởng cao nhất 0,44 ± 0,04 vì môi

trường thích hợp và mật độ thấp nên không có sự cạnh tranh nhiều giữa các cá thể

trong quần thể. Ngược lại, ở mật độ ban đầu cao hơn lần lượt 10x104 tb/ mL, 15x104

tb/ mL và 20x104 tb/ mL thì tảo cũng sinh trưởng nhưng có thể vì cạnh tranh nhiều

nên tốc độ tăng trưởng của tảo thấp hơn lần lượt 0,2 ± 0,02; 0,21 ± 0,04; 0,18 ± 0,03

và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa ba mật độ này.

Thời gian thế hệ được tính từ lúc một tế bào sinh ra đến khi tế bào đó phân chia

hoặc số tế bào trong quần thể tăng gấp đôi. Thời gian thế hệ ngắn nhất là 1,6 ± 0,15 ngày ứng với mật độ 5x104 tb/ mL và thời gian thế hệ này có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê với các mật độ ban đầu còn lại. Thời gian thế hệ dài nhất là 4,04 ± 0,7 ngày ở mật độ ban đầu 20x104 tb/ mL. Tuy nhiên, ở mật độ này không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với mật độ 10x104 tb/ mL và 15x104 tb/ mL với thời gian lần

lượt là 3,45 ± 0,39 và 3,38 ± 0,6 (Bảng 3.4).

Thời gian phân chia mỗi ngày ở mật độ ban đầu 5x104 tb/ mL là dài nhất và chiếm 0,63 ± 0,06 ngày (p<0,05). Các mật độ ban đầu 10x104 tb/ mL, 15x104 tb/ mL và 20x104 tb/ mL có thời gian phân chia mỗi ngày lần lượt từ 0,29 ± 0,03 ngày; 0,3 ±

0,06 ngày và 0,25 ± 0,04 ngày (p>0,05) (Bảng 3.4).

Năng suất sinh khối cao nhất là 6,97 ± 1,46 ở mật độ 5x104 tb/ mL, thấp nhất là 5,37 ± 0,63 ở mật độ 10x104 tb/ mL. Ở mật độ 15x104 tb/ mL và 20x104 tb/ mL thì

năng suất này lần lượt đạt 6,71 ± 1,41 tb/ mL và 6,77 ± 1,08 tb/ mL. Tuy nhiên, năng

suất sinh khối giữa các mật độ này không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Tóm lại, nếu mật độ ban đầu càng cao thì tốc độ tăng trưởng càng chậm, thời

gian phân chia mỗi ngày càng ngắn, thời gian thế hệ càng dài và năng suất sinh khối

thấp. Kết quả trong nghiên cứu này trùng khớp với các nghiên cứu trước đó. Tốc độ

tăng trưởng và sinh khối thu được cao nhất khi nuôi vi tảo Botryococcus sp. ở mật độ

ban đầu là 106 tb/ mL, nhưng khi nuôi ở mật độ ban đầu 107 tb/ mL thì sinh khối đạt

cực đại thấp và tảo nhanh chóng suy tàn, đường cong tăng trưởng không có dạng

chuẩn [48]. Sự tăng nhanh về số lượng tế bào dẫn đến sự cạnh tranh giữa các cá thể

trong quần thể, chất dinh dưỡng nhanh chóng cạn kiệt và chất độc hại ngày càng

nhiều, pH càng tăng, khả năng quang hợp và trao đổi chất giảm.

42

3.3. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và sinh lý của Entomoneis sp.

3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của Entomoneis sp.

pH là một trong những yếu tố rất quan trọng quyết định đến sự phân bố cũng

như sự sinh trưởng và sinh khối của vi tảo. Vì vậy, để quá trình nuôi cấy thành công

và thu được sinh khối tảo cao cần tiến hành nghiên cứu pH thích hợp.

Để xác định mức độ ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của tảo silic

Entomoneis sp., thí nghiệm được tiến hành với 6 giá trị pH khác nhau lần lượt là 6,0;

6,5; 7,0; 7,5; 8,0 và 8,5 với mật độ ban đầu đã được rút ra từ thí nghiệm khảo sát ảnh

hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến sự sinh trưởng của tảo silic Entomoneis sp. là

5x104 tb/ mL.

Bảng 3.5. Mật độ tế bào của Entomoneis sp. với các giá trị pH khác nhau

7,29b ± 0,34 7,06b ± 0,38 7,37ab ± 0,3 7,45ab± 0,38

7,4ab ± 0,61

7,84a ± 0,44

pH 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5

6,24b ± 0,13 6,66b ± 0,17 7,47a ± 0,47 7,61a ± 0,21

7,98ab ± 0,58

7,69a ± 0,47

N1

6,01d ± 0,41 6,50d ± 0,37 7,33c ± 0,24 8,17b ± 0,2

8,91a ± 0,53

7,71bc ± 0,38

N2

7,13d ± 0,63 7,18d ± 0,36 8,01c ± 0,55 8,39bc± 0,32

9,85a ± 0,12

8,75b ± 0,37

N3

N4

8,01c ± 0,59 8,31c ± 0,55 8,45c ± 0,23 9,26b ± 0,21

10,26a ± 0,35 9,08ab ± 0,15

6,53c ± 0,39 7,61b ± 0,26 7,86b± 0,11

7,61b ± 0,39

N5

9,4a ± 0,46

9,43a ± 0,43

N6

* Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 4 lần. Số liệu trình bày ở bảng 3.5 là giá trị trung bình ± SD (x104 tb/ mL). Chữ cái viết kèm bên trên thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)

Theo kết quả nghiên cứu, từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 2 tảo silic được nuôi ở các

giá trị pH khác nhau đều thích nghi và bắt đầu sinh trưởng. Tuy nhiên, không có sự

khác biệt lớn về mật độ tế bào, màu sắc dịch nuôi (Bảng 3.5, Hình 3.7, N1, N2).

Bắt đầu từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 6, mật độ tế bào tảo silic Entomoneis sp. ở

các nghiệm thức đã có sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê. Vào ngày thứ 5, tại

giá trị pH = 8,0 tảo silic Entomoneis sp. sinh trưởng mạnh nhất với mật độ cực đại

cao nhất 10,26 ± 0,35x104 tb/ mL và màu sắc dịch nuôi đậm nhưng không sai khác

43

nhiều so với các nghiệm thức khác (Hình 3.7, N5). Với giá trị pH = 7,5 và 8,5 thì mật

độ tế bào thấp hơn và đạt cực đại lần lượt là 9,26 ± 0,21x104 tb/ mL và 9,08 ±

0,15x104 tb/ mL. Tảo sillic Entomoneis sp. ở các giá trị pH = 6,0; 6,5 và 7,0 luôn

sinh trưởng với mật độ tế bào thấp hơn lần lượt là 8,01 ± 0,59x104 tb/ mL; 8,31 ±

0,55x104 tb/ mL và 8,45 ± 0,23x104 tb/ mL. Kết quả kiểm định thống kê cho thấy

không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mật độ tế bào cực đại giữa 3 giá trị pH

này (p > 0,05). Tác động của pH đến mật độ tế bào cực đại tại giá trị pH = 8,0 và 8,5

là có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Từ đó cho thấy, giá trị pH từ 6,0 -

7,0 không nằm trong giới hạn tối ưu cho sự phát triển của tảo silic Entomoneis sp. và

giá trị tối ưu nhất thích hợp cho sự phát triển của Entomoneis sp. tại pH = 8,0. Ngoài

ra, đường cong tăng trưởng của tảo ở giá trị này tương đối đều và ổn định, mật độ tế

bào dễ đếm vì không có sự kết dính giữa các tế bào như các nghiệm thức khác. Sau

khi đạt mật độ cực đại, sự sinh trưởng của tảo silic bắt đầu giảm mạnh so với các

nghiệm thức còn lại. Tóm lại, khi nuôi tảo trong môi trường F/2, với mật độ ban đầu

là 5x104 tb/ mL và giá trị pH được điều chỉnh hằng ngày về các giá trị pH ban đầu

như trong thí nghiệm thì sự sinh trưởng của tảo bị ảnh hưởng rất nhiều. Mật độ cực

đạt chỉ đạt 10,26 ± 0,35 x104 tb/ mL rất thấp so với đối chứng là 33,09 ± 1,88x104 tb/

mL. Sự sinh trưởng của tảo silic Entomoneis sp. bị ảnh hưởng rất lớn tại giá trị pH từ

6,0 - 7,0. Điều này rất có ý nghĩa trong nuôi cấy tảo silic Entomoneis sp.

44

Hình 3.7. Màu sắc dịch nuôi qua các ngày dưới ảnh hưởng của các mức pH

khác nhau (từ trái sang phải mức pH tăng dần từ 6,0 - 8,5)

45

Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng của tảo Entomoneis sp. với các giá trị pH

khác nhau

Nhìn chung, đường cong tăng trưởng của Entomoneis sp. dưới các giá trị pH

khác nhau đều có dạng chữ S và không có pha tiềm phát. Quần thể vi tảo phát triển

nhanh, mật độ tế bào cao sau ngày đầu cấy chuyền (Hình 3.8).

Ngày thứ nhất và ngày thứ hai, mật độ tế bào dưới các giá trị pH

không khác biệt nhiều. Sự khác biệt chỉ thể hiện rõ ở ngày thứ 3 trở đi (Hình 3.8).

Ở các nghiệm thức pH = 6,0; pH = 6,5; pH = 7,0, số lượng tế bào trong quần

thể giảm vào ngày thứ 3 sau đó tăng trở lại và rơi vào pha suy vong hoàn toàn ở ngày

6 (Hình 3.8).

Mật độ tế bào đạt cực đại vào ngày thứ 5 ở hầu hết các nghiệm thức và đạt giá

trị tối đa tại nghiệm thức pH = 8,0. Sau đó, số lượng tế bào giảm nhanh và rơi vào

pha suy vong ở ngày thứ 6 (Hình 3.8). Như vậy, từ đường cong tăng trưởng cho thấy

tảo silic Entomoneis sp. tăng trưởng tốt tại giá trị pH = 8,0.

Nhìn chung, sự thay đổi giá trị pH trong phạm vi từ 6,0 - 8,5 có tác dụng lớn

đến sự tăng trưởng của tảo silic Entomoneis sp.. Điều này được thể hiện thông qua

mật độ tế bào, đường cong tăng trưởng và màu sắc dịch nuôi. Hầu hết màu sắc các

46

bình nuôi cấy với các giá trị pH khác nhau đều không thấy có sự khác biệt rõ rệt. Mật

độ tế bào rất thấp so với đối chứng và màu sắc dịch nuôi rất nhạt.

Ngoài ra, tốc độ tăng trưởng, năng suất sinh khối cũng như thời gian phân chia

của tảo silic Entomoneis sp. cũng bị ảnh hưởng bởi các giá trị pH khác nhau. Tất cả

được thể hiện rõ trong bảng 3.6 và hình 3.9.

Bảng 3.6. Tốc độ tăng trưởng, năng suất sinh khối và thời gian phân chia của

tảo silic Entomoneis sp. dưới tác động của pH khác nhau

Tốc độ tăng trưởng Năng suất sinh khối Thời gian phân pH chia mỗi ngày (1/ngày) (tb/mL/ngày)

0,19b ± 0,04 0,59b ± 0,07 0,27b ± 0,06 6,0

0,16b ± 0,07 0,55bc ± 0,11 0,23b ± 0,1 6,5

-0,01c ± 0,07 0,33d ± 0,07 -0,19c ± 0,11 7,0

0,17b ± 0,02 0,55bc ± 0,03 0,24b ± 0,03 7,5

0,27a ± 0,05 0,75a ± 0,11 0,39a ± 0,07 8,0

0,11b ± 0,04 0,46c ± 0,06 0.16b ± 0,06 8,5

* Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 4 lần. Số liệu trình bày ở bảng 3.6 là giá trị trung bình ± SD (x104 tb/ mL). Chữ cái viết kèm bên trên thể hiện sự khác nhau có

ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)

Tại giá trị pH = 7,0 thì tốc độ tăng trưởng, thời gian phân chia mỗi ngày mang

giá trị âm và năng suất sinh khối thấp nhất. Điều này cho thấy, ở giá trị pH = 7,0

hoàn toàn không thích hợp cho sự sinh trưởng của Entomoneis sp. Tốc độ tăng

trưởng ở giá trị pH = 6,0; 6,5; 7,5 và 8,5 lần lượt 0,19 ± 0,04; 0,16 ± 0,07; 0,17 ±

0,02 và 0,11 ± 0,04 (p > 0,05). Như vậy, tốc độ tăng trưởng cao nhất tại giá trị pH =

8,0 là 0,27 ± 0,05 và cũng tại giá trị pH này thì năng suất sinh khối đạt cao nhất và

thời gian phân chia mỗi ngày dài nhất (p < 0,05).

47

)

/

)

N / 1 ( g n ở ư r t g n ă t ộ đ c ố T

N L m / b t 4 0 1 x ( i ố h k h n i s t ấ u s g n ă N

Hình 3.9. Tốc độ tăng trưởng và năng suất sinh khối của Entomoneis sp. dưới

các giá trị pH ban đầu khác nhau

Nhìn chung, giá trị pH tối ưu nhất cho sinh trưởng của tảo silic Entomoneis sp.

là 8,0 (Hình 3.9). Kết quả trong nghiên cứu này nhất quán với kết luận của các nhà

nghiên cứu khác. Goldman và cộng sự (1982) cho rằng nhiều loài vi tảo biển phát

triển tối ưu ở pH = 8,1 - 8,3 [54]. Hinga (1992) nhận thấy rằng tảo silic có giá trị pH

tối ưu gần 8,1 và tốc độ tăng trưởng thấp hơn ở giá trị pH = 8,5. Tảo silic Navicula

phyllepta Kutzing và Nitzschia epithemoides Grunow được nuôi cấy trong môi

trường F/2, hoạt động tối ưu ở khoảng pH 7,8 - 8,3 [50]. Đối với Chaetoceros

muelleri, tốc độ tăng trưởng và mật độ tế bào tảo silic giảm tại giá trị pH = 6,8 và

không bị ảnh hưởng ở khoảng pH từ 7,4 - 8,2 [55]. Hay pH tối ưu để Cricosphaera

elongata phân chia tế bào là 7,8 [18].

Biến đổi pH trong môi trường không những ảnh hưởng đến việc hấp thu CO2

mà còn liên quan quá trình trao đổi chất trong tế bào [56]. Sự thay đổi pH ngoại bào

ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng và quá trình trao đổi chất bên trong tảo silic

Skeletoneme costatum và có thể do các enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất

trong tế bào có giá trị pH khác nhau [57]. Một số tảo silic như Cerataulina pelagica

và Thalassiosira punctigera không thể phát triển khi pH vượt quá 8,5 [58]. Sự tăng

trưởng của các loài tảo silic khác như Skeletonema costatum, Thalassiosira

pseudonana và T. oceanica giảm khi pH trên 8,5 và bị ức chế khi pH vượt quá 9,4

48

[59]. Giá trị pH trên 8,6 giảm tốc độ tăng trưởng của Pseudo-nitzschia multiseries và

giá trị pH từ 8,8 - 9,0 ức chế sự tăng trưởng của nó [60]. Tốc độ tăng trưởng, mật độ

cực đại cũng như thời gian đạt pha cân bằng của tảo silic Thalassiosira pseudonana

tại giá trị pH = 7,0 - 8,0 tốt hơn so với giá trị pH từ 8,5 - 9,0 [37].

3.3.2. Sự biến thiên pH qua các ngày với giá trị pH ban đầu khác nhau

Bảng 3.7. Giá trị pH biến thiên qua các ngày

Ngày

pH=6,0

pH=6,5

pH=7,0

pH=7,5

pH=8,0

pH=8,5

N1

7,34e ± 0,12 7,61d± 0,05

7,82c ± 0,05 7,90c ± 0,07

8,01b ± 0,02

8,16a ± 0,03

N2

7,41c ± 0,17 7,51c ± 0,37 7,94b ± 0,04 8,04ab ± 0,05

8,11ab ± 0,01

8,27a ± 0,05

N3

6,77d ± 0,45 7,30c ± 0,29 7,77b ± 0,05 7,88b ± 0,04

8,05ab ± 0,04

8,25a ± 0,09

N4

6,88d ± 0,40 7,35c ± 0,34 7,81b ± 0,10 7,92b ± 0,10

8,08ab ± 0,06

8,29a ± 0,08

N5

6,62e ± 0,32 7,09d ± 0,27 7,64c ± 0,11 7,80bc ± 0,09

8,03b ± 0,03

8,31a ± 0,11

N6

6,39e ± 0,15 7,12d ± 0,22 7,58c ± 0,19 7,89b ± 0,09

8,01b ± 0,09

8,27a ± 0,08

N7

6,44e ± 0,24 6,84d ± 0,16 7,43c ± 0,11 7,89b ± 0,15

8,04b ± 0,05

8,33a ± 0,06

N8

6,73e ± 0,3

6,57e ± 0,14 7,44d ± 0,15 7,79c ± 0,04

8,03b ± 0,04

8,31a ± 0,07

* Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 4 lần. Số liệu trình bày ở bảng 3.7 là giá

trị trung bình ± SD. Chữ cái viết kèm bên trên thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa về

mặt thống kê (p < 0,05).

Giá trị pH trong các nghiệm thức được điều chỉnh hằng ngày về các mức pH

ban đầu lần lượt 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5. Mặc dù giá trị pH giảm dần từ ngày 1 đến

ngày 8 tại các mức pH = 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 nhưng vẫn cao hơn giá trị pH ở ngày đầu

nuôi cấy. Điều này cho thấy tảo có cơ chế tự điều chỉnh pH ngoại bào để thay đổi các

giá trị pH không phù hợp cho sự sinh trưởng về giá trị tương đối ổn định. Tại giá trị

pH ban đầu là 8,0 pH biến động rất ít từ 8,01 - 8,11. Ở giá trị pH = 8,5, pH giảm và

dao động từ 8,16 - 8,30 (Bảng 3.7, Hình 3.10).

49

Hình 3.10. Giá trị pH thay đổi qua các ngày

Giá trị pH tăng vào ngày đầu tiên ở các nghiệm thức pH = 6,0; 6,5; 7,0; 7,5, sau

đó giảm dần qua các ngày 4, 5, 6 (Hình 3.10).

Ở nghiệm thức pH = 8,5, giá trị pH giảm nhanh vào ngày thứ nhất sau đó tăng

nhẹ qua các ngày nuôi cấy (Hình 3.10).

Giá trị pH thay đổi hầu như không đáng kể ở nghiệm thức có giá trị pH = 8,0

(Hình 3.10).

Nhìn chung, giá trị pH không có sự sai khác lớn giữa các nghiệm thức. Quần

thể rơi vào pha suy vong ở ngày 6 và 7 với nghiệm thức 6,5 và 7,0. Tuy nhiên, ở

nghiệm thức pH = 6,0 thì giá trị pH lại tăng nhanh vào ngày cuối của pha suy vong.

3.3.3. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất lượng tử tối đa của Entomoneis sp.

Ảnh hưởng của pH đến Fv/ Fm của Entomoneis sp. được trình bày trong bảng 3.8.

50

Bảng 3.8. Chỉ số Fv/ Fm thay đổi qua các ngày với pH ban đầu khác nhau

Thời

pH = 6,0

pH = 6,5

pH = 7,0

pH = 7,5

pH = 8,0

pH = 8,5

gian

(Ngày)

0,73a ± 0,01

0,74a ± 0,01

0,73a ± 0,01

0,73a ± 0,01 0,73a ± 0,01 0,73a ± 0,01

N1

0,74a ± 0,01

0,74a ± 0,01

0,73a ± 0,01

0,74a ± 0,01 0,73a ± 0,00 0,73a ± 0,01

N2

0,74b ± 0,01

0,75a ± 0,01

0,74b ± 0,01

0,74b ± 0,01 0,73b ± 0,01 0,74ab ±0,01

N3

0,73b ± 0,01 0,74ab ± 0,01 0,74ab ± 0,01 0,75ab± 0,01 0,74ab ±0,01 0,75a ± 0,01

N4

0,73b ± 0,01

0,75a ± 0,01

0,75a ± 0,01

0,75a ± 0,01 0,75a ± 0,01 0,75a ± 0,01

N5

0,73a ± 0,01

0,74a ± 0,01

0,74a ± 0,01

0,75a ± 0,01 0,74a ± 0,01 0,75a ± 0,04

N6

0,71ab ±0,03

0,70b ± 0,02

0,72ab ± 0,02 0,73a ± 0,01 0,72ab ±0,03 0,74a ± 0,02

N7

0,70a ± 0,02

0,63b ± 0,04

0,70a ± 0,02

0,72a ± 0,01 0,69a ± 0,02 0,73a ± 0,02

N8

* Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 4 lần. Số liệu trình bày ở bảng 3.8 là giá

trị trung bình ± SD. Chữ cái viết kèm bên trên thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa về

mặt thống kê (p < 0,05).

Sau khi tiếp xúc với pH, chỉ số Fv/ Fm của Entomoneis sp. không bị ảnh hưởng

rõ ràng trong thời gian phơi nhiễm 2 ngày đầu (p > 0,05). Từ ngày thứ 3 trở đi chỉ số

Fv/ Fm có sự khác biệt giữa các nghiệm thức (Bảng 3.8, Hình 3.11).

Ở giá trị pH = 6,0 thì chỉ số Fv/ Fm giảm dần từ 0,74 - 0,70 và có sự khác biệt

với các nghiệm thức khác, rõ nhất ở các ngày 4, 5 và 7 (p < 0,05) (Bảng 3.8).

Khi được điều chỉnh với pH = 6,5 thì chỉ số Fv/ Fm giảm nhẹ vào ngày thứ 4 và

tăng lại sau ngày thứ 5, sau đó giảm dần qua các ngày và giảm mạnh nhất vào ngày

thứ 8 (Bảng 3.8, Hình 3.11).

Hoạt động của quang hệ II ở các mức pH = 7,0; 7,5 và 8,0 ổn định từ ngày 3 -6,

sau đó giảm dần ở 2 ngày còn lại của pha tăng trưởng và giữa chúng không có sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.8, Hình 3.11).

51

Với mức pH = 8,5 thì chỉ số Fv/ Fm tương đối ổn định qua các ngày và giảm

nhẹ vào ngày cuối cùng (Bảng 3.8, Hình 3.11).

Tóm lại, dữ liệu trong nghiên cứu cho thấy chỉ số Fv/ Fm hầu như thay đổi

không đáng kể khi tảo silic Entomoneis sp. bị phơi nhiễm ở phạm vi pH từ 6,0 - 8,5

trong thời gian ngắn hạn (6 ngày). Hiệu suất lượng tử tối đa của quang hệ II tương

đối ổn định dưới các giá trị pH khác nhau. Kết quả này mâu thuẫn với công trình

được xuất bản trước đây. Hiệu quả quang hợp của Chaetoceros muelleri giảm khi

môi trường xung quanh các tế bào trở nên chua hơn. Đối với tảo silic C. muelleri, chỉ

số Fv/ Fm giảm khi pH môi trường thấp, nó ảnh hưởng đến chức năng màng và tăng

tiết carbohydrate. Màng thylakoid rất quan trọng để duy trì khả năng quang hợp, điều

khiển quá trình trao đổi chất giữa môi trường trong và ngoại bào [55].

Tuy nhiên, tại giá trị pH = 6,8 chỉ số Fv/ Fm là thấp hơn đáng kể và có sự trùng

khớp với giá trị pH = 6,5 trong nghiên cứu này (Bảng 3.8, Hình 3.11)

Hình 3.11. Chỉ số Fv/ Fm thay đổi qua các ngày

52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Tảo silic Entomoneis sp. nghiên cứu trong đề tài có quan hệ gần gũi nhất với

loài Entomoneis umbratica khi phân tích trình tự vùng gen rbcL-3P trên GenBank.

Mật độ nuôi cấy ban đầu thích hợp cho sự sinh trưởng của tảo silic Entomoneis

sp. trong môi trường F/2 là 5x104 tb/ mL vì ở mật độ này đường cong tăng trưởng

của tảo ổn định và đều đặn nhất nên rất thuận lợi trong nghiên cứu sinh trưởng cũng

như sinh lý của tảo silic.

Tảo được nuôi ở giá trị pH = 8,0 thu được sinh khối cao. Tuy nhiên, chỉ số Fv/ Fm

không có sự thay đổi đáng kể qua các ngày. Với các giá trị pH khác, tảo sinh trưởng

chậm, sắc tố mất dần, chỉ số Fv/ Fm dao động và giảm vào các ngày cuối của pha lũy

thừa đặc biệt tại pH = 6,5.

KIẾN NGHỊ

Cần nghiên cứu sâu hơn ảnh hưởng của pH đến thành phần sinh hóa, đặc biệt là

hàm lượng các acid béo không no đa nối đôi có trong tảo silic Entomoneis sp. Đây là

một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá hàm lượng dinh dưỡng của loài này.

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái khác như ánh sáng,

nhiệt độ, độ mặn, nồng độ CO2, dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng,… đến sự

sinh trưởng của tảo.

53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Trương Ngọc An, Phân loại khuê tảo phù du ở biển Việt Nam. Nxb Khoa học

và Kỹ thuật, 1993.

[2] Lương Quang Đốc, “Nghiên cứu tảo Silic sống trên nền đáy mềm và một số

đặc điểm sinh thái của chúng ở vùng đầm phá ven biển tỉnh Thừa Thiên Huế.”

2007.

[3] A. Kale và B. Karthick, “The Diatoms: Big Significance of Tiny Glass

Houses,” Resonance, vol. 20, pp. 919–930, Oct. 2015.

[4] L. He, S. Lou, X. Lin, X. Qian, S. Xie và Z. Wang, “Isolation and

identification of the marine diatom Entomoneis sp. MMOGRB 0374S

(Bacillariophyta): a strain with high arachidonic acid composition,” Bot. Mar.,

vol. 59, no. 6, pp. 463–471, 2016.

[5] J. Raven et al., Ocean Acidification due to Increasing Atmospheric Carbon

Dioxide. Royal Society Policy Document, 2005.

[6] Trần Ý Nhi, “Khảo sát ảnh hưởng của mật độ ban đầu và chất kháng sinh -

kháng nấm đến sự phát triển của vi tảo Entomoneis sp. phân lập tại khu dự trữ

sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ,” Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học

Sài Gòn, p. 69, 2018.

[7] Patrick Lavens và Pratrick Sorgeloos, “Manual on the Production and Use of

Live Food for Aquaculture,” p. 361, 1996.

[8] D. C. Trần, H. H. Nguyễn, T. H. Nguyễn, M. C. Nguyễn, Đ. T. Dương, và H.

H. Nguyễn, “Bước đầu tìm hiểu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và

nhiệt độ lên sinh trưởng và quang hợp của 3 chủng vi tảo thuộc chi

Chaetoceros phân lập được ở Việt Nam,” Đại Học Quốc Gia Hà Nội, p. 11,

2003.

[9] Amos Richmond, Ph.D, Prof. Emeritus và Qiang Hu, Handbook of Microalgae

Culture Applied Phycology and Biotechnology. 2013.

[10] Xie Congxin, “A study on the feeding habits of silver carp and bighead.,” pp.

385–394, 1989.

54

[11] M.R. Brown, S.W. Jeffrey, J.K. Volkman và G.A Dunstan, “Nutritional

properties of microalgae for mariculture,” no. 151, pp. 315–331, 1997.

[12] Lê Viễn Chí, “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của tảo Skeletonema

costatum.” Viện nghiên cứu Hải sản Hải Phòng, 1996.

[13] Maruf Kasim và Hiroshi Mukai, “Food sources of the oyster (Crassostrea

gigas) and the clam (Ruditapes philippinarum) in the Akkeshi-ko estuary,” vol.

4, no. 3, pp. 104–114, 2009.

[14] Malcolm R. Brown, “Nutritional Value and Use of Microalgae in

Aquaculture.” 2002.

[15] Djordje P. Medarević và Svetlana R. Ibrić, “Diatoms – nature materials with

great potential for bioapplications,” vol. 70, no. 6, pp. 613–627, 2016.

[16] I. Laing, “Cultivation of marine unicellular algae,” Lab. Leafl. Fish. Lab.

Benarth Road Conwy Gwynedd, vol. 67, p. 32, 1991.

[17] M. A. Borowitzka và N. R. Moheimani, Eds., Algae for Biofuels and Energy.

Springer Netherlands, 2013.d

[18] E. Swift và W. R. Taylor, “The effect of pH on the division rate of the

Coccolithophorid Cricosphaera elongata,” J. Phycol., vol. 2, no. 3, pp. 121–

125, Sep. 1966.

[19] J. R. Coleman và B. Colman, “Inorganic Carbon Accumulation and

Photosynthesis in a Blue-green Alga as a Function of External pH,” Plant

Physiol., vol. 67, no. 5, pp. 917–921, May 1981.

[20] F. Pedersen và P. Hansen, “Effects of high pH on a natural marine planktonic

community | Sci-napse | Academic search engine for paper,” Mar. Ecol. Prog.

Ser., no. 260, pp. 19–31, 2003.

[21] M. Taraldsvik và S. M. Myklestad, “The effect of pH on growth rate,

biochemical composition and extracellular carbohydrate production of the

marine diatom Skeletonema costatum,” Eur. J. Phycol., vol. 35, no. 2, pp. 189–

194, May 2000.

55

[22] Nina Lundholm, Per Juel Hansen, Yuichi Kotaki, “Effect of pH on growth and

domoic acid production by potentially toxic diatoms of the genera Pseudo-

nitzschia and Nitzschia,” pp. 1–15, 2004.

[23] Đặng Đình Thi và Đặng Hoàng Phước Hiền, Công nghệ sinh học vi tảo. Trung

tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia: Nxb. Nông nghiệp, 1999.

[24] M. Mejdandžić et al., “Entomoneis tenera sp. nov. , a new marine planktonic

diatom (Entomoneidaceae, Bacillariophyta) from the Adriatic Sea,” Phytotaxa,

vol. 292, no. 1, pp. 1–18, Jan. 2017.

[25] Patrick, R.M. và Reimer, C.W, “The Diatoms of the United States: Bd.

2.Entomoneidaceae, Cymellaceae, Gomphonemaceae, Epithemiaceae.”

Academy of Natural Sciences, 1975.

[26] B. Liu, D. M. Williams và L. Ector, “Entomoneis triundulata sp. nov.

(Bacillariophyta), a New Freshwater Diatom Species from Dongting Lake,

China,” Cryptogam. Algol., vol. 39, no. 2, pp. 239–253, May 2018.

[27] H. Lange-Bertalot, A. Witkowski, M. Kulikovskiy, A. W. R. Seddon và J. P.

Kociolek, “Taxonomy, frustular morphology and systematics of Platichthys , a

new genus of canal raphe bearing diatoms within the Entomoneidaceae,”

Phytotaxa, vol. 236, no. 2, pp. 135–149, Nov. 2015.

[28] “WoRMS - World Register of Marine Species - Entomoneidaceae Reimer,

1975.” [Online]. Available:

http://www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=149659. [Accessed:

11-Mar-2019].

[29] E. Clavero, J. O. Grimalt và M. Hernández-Mariné, “Entomoneis vertebralis

sp. nov. (Bacillariophyceae); a new species from hypersaline environments,”

Cryptogam. Algol., vol. 20, no. 3, pp. 223–234, Jul. 1999.

[30] D. C. Reinke và D. E. Wujek, “Entomoneis reimeri sp. nov., a new saline

diatom species from Kansas,” Trans. Kans. Acad. Sci. 1903-, vol. 116, no. 3/4,

pp. 113–118, 2013.

[31] Đặng Thị Sy, “Tảo Silic vùng cửa sông ven biển Việt Nam,” Hà Nội, p. 186,

1996.

56

[32] Nguyễn Văn Tuyên, “Đa dạng sinh học tảo trong thuỷ vực nội địa Việt Nam,”

Nxb Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh, p. 499, 2003.

[33] Nguyễn Thị Gia Hằng và cs, “Quần xã khuê tảo bám trong hệ sinh thái rừng

ngập mặn tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh,” Sci

Technol Dev, vol. 12, no. 07, pp. 72–78, 2009.

[34] Nguyễn Thị Gia Hằng, “Đa dạng khuê tảo ở rừng ngập mặn Cần Giờ và ven

biển đồng bằng sông Cửu Long,” Luận Án Tiến Sĩ Sinh Học Đại Học Khoa

Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh, p. 202, 2014.

[35] Nguyễn Thị Hoài Hà, “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số loài khuê tảo

silic phân lập ở rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định.,” Báo Cáo Đề Tài

Nghiên Cứu Khoa Học Cấp Huyện, 2010.

[36] Nguyễn Thị Hương, Hoàng Thị Châu Long và Lê Thị Thu Hương, “Thu thập

và nuôi sinh khối khuê tảo biển làm thức ăn nuôi thủy sản.,” Viện Nghiên Cứu

Nuôi Trồng Thủy Sản III, 2012.

[37] Trần Thị Lê Trang và Lục Minh Diệp, “Ảnh hưởng của mật độ ban đầu và pH

đến sinh trưởng, mật độ cực đại và thời gian pha cân bằng của tảo Thalassiosira

pseudonana (Hasle & Heimdal) nuôi sinh khối,” Tạp Chí Khoa Học - Công

Nghệ Thủy Sản - Trường Đại Học Nha Trang, no. 2, pp. 121–126, 2017.

[38] C. T. Enright, G. F. Newkirk, J. S. Craigie và J. D. Castell, “Evaluation of

phytoplankton as diets for juvenile Ostrea edulis L.,” J. Exp. Mar. Biol. Ecol.,

vol. 96, no. 1, pp. 1–13, Apr. 1986.

[39] A. T. Soares et al., “Chromatographic characterization of triacylglycerides and

fatty acid methyl esters in microalgae oils for biodiesel production,” J. Renew.

Sustain. Energy, vol. 5, p. 053111, Sep. 2013.

[40] M. C. Rho et al., “A sulfonoglycolipid with Na+,K+-ATPase inhibitory

activity, produced by a cultured unique diatom symbiont isolated from a larger

foraminifera,” Planta Med., vol. 62, no. 6, pp. 552–554, Dec. 1996.

[41] M. S. Adams và J. L. Stauber, “Development of a whole-sediment toxicity test

using a benthic marine microalga,” Environ. Toxicol. Chem., vol. 23, no. 8, pp.

1957–1968, Aug. 2004.

57

[42] R. R. L. Guillard, “Culture of Phytoplankton for Feeding Marine

Invertebrates,” in Culture of Marine Invertebrate Animals: Proceedings — 1st

Conference on Culture of Marine Invertebrate Animals Greenport, W. L.

Smith và M. H. Chanley, Eds. Boston, MA: Springer US, 1975, pp. 29–60.

[43] Lehninger AL, Biochemistry, 2nd ed. Worth Publishers, 1975.

[44] M.-A. Lee, D. G. Faria, M.-S. Han, J. Lee và J.-S. Ki, “Evaluation of nuclear

ribosomal RNA and chloroplast gene markers for the DNA taxonomy of

centric diatoms,” Biochem. Syst. Ecol., vol. 50, pp. 163–174, Oct. 2013.

[45] P. Andersen và J. Throndsen, “Estimating cell numbers,” Man. Harmful Mar.

Microalgae Monogr. Oceanogr. Methodol., pp. 99–129, Jan. 2003.

[46] Y.-K. Lee et al., “Basic Culturing and Analytical Measurement Techniques,”

in Handbook of Microalgal Culture, Wiley-Blackwell, 2013, pp. 37–68.

[47] A. M. Wood, R. C. Everroad và L. M. Wingard, Measuring growth rates in

microalgal cultures. Amsterdam: Elsevier, Acad. Press [u.a.], 2005.

[48] P. Gani, N. Mohamed sunar, H. M. Peralta, A. A. Abdul Latiff và A. R. Ab.

Razak, “Influence of Initial Cell Concentrations on the Growth Rate and

Biomass Productivity of Microalgae in Domestic Wastewater,” Appl. Ecol.

Environ. Res., vol. 14, pp. 399–409, Mar. 2016.

[49] J. Masojidek, M. Koblizek và G. Torzillo, “Photosynthesis in Microalgae,”

Handb. Microalgal Cult. Biotechnol. Appl. Phycol., pp. 20–39, Apr. 2013.

[50] B. Scholz, “Effects of varying pH on the growth and physiology of five marine

microphytobenthic diatoms isolated from the Solth o¨ rn tidal flat (southern

North Sea, Germany),” Phycologia, vol. 53, no. 3, pp. 252–264, 2014.

[51] S. Hamsher, K. Evans, D. Mann, A. Poulíčková và G. W Saunders, “Barcoding

Diatoms: Exploring Alternatives to COI-5P,” Protist, vol. 162, pp. 405–22, Jul.

2011.

[52] G. Courtois de Viçose, Porta, V. M.P, H. Fernández-Palacios và M. Izquierdo,

“Effects of density on growth rates of four benthic diatoms and variations in

biochemical composition associated to growth phase,” J. Appl. Phycol., vol.

24, p. 1427, Dec. 2012.

58

[53] D. Peng, X. Ren, L. CaiCai và L. HanQi, “Effects of temperature, salinity and

initial cell density of cleaning dredged materials on growth of Skeletonema

costatum.,” Southwest China J. Agric. Sci., vol. 27, no. 2, pp. 852–858, 2014.

[54] J. C. Goldman, Y. Azov, C. B. Riley và M. R. Dennett, “The effect of pH in

intensive microalgal cultures. I. Biomass regulation,” J. Exp. Mar. Biol. Ecol.,

vol. 57, no. 1, pp. 1–13, Jan. 1982.

[55] Daniel Thornton, “Effect of Low pH on Carbohydrate Production by a Marine

Planktonic Diatom (Chaetoceros muelleri),” Res. Lett. Ecol., vol. 2009, Feb.

2009.

[56] J. A. Raven, “Nutrient Transport in Microalgae,” in Advances in Microbial

Physiology, vol. 21, A. H. Rose and J. G. Morris, Eds. Academic Press, 1981,

pp. 47–226.

[57] C. Ouellet và A. A. Benson, “The Path of Carbon in Photosynthesis XIII. pH

effcts in C14O2 fixation by scenedesmus,” J. Exp. Bot., vol. 3, no. 2, pp. 237–

245, Jun. 1952.

[58] Theo Elzenga et al, “The Role of Extracellular Carbonic Anhydrase Activity in

Inorganic Carbon Utilization of Phaeocystis globosa (Prymnesiophyceae): A

Comparison with other Marine Algae Using the Isotopic Disequilibrium

Technique,” Limnol. Oceanogr., vol. 45, pp. 372–380, Mar. 2000.

[59] E. G. Durbin và C. Y. Chen, “Effects of pH on the growth and carbon uptake

of marine phytoplankton,” Mar. Ecol.-Prog. Ser., vol. 109, pp. 83–94, Jun.

1994.

[60] Nina Lundholm et al, “Effect of pH on growth and domoic acid production by

potentially toxic diatoms of the genera Pseudo-nitzschia and Nitzschia,” Mar.

Ecol.-Prog. Ser., vol. 273, pp. 1–15, Jun. 2004.

[61] Gary W. Saunders, Daniel C. McDevit, “Methods for DNA barcoding

photosynthetic protists emphasizing the macroalgae and diatoms,” Methods in

Molecular Biology (Clifton, N.J.)., vol. 858, pp. 207–222, 2012.

PL 1

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Một số hình ảnh trong nghiên cứu

PL 2

Phụ lục 2: Các loại hóa chất được sử dụng để pha môi trường F/2

+ Pha chế dung dịch gốc khoáng đa lượng

Khối lượng cân/50 mL nước Hoá chất Nồng độ dung dịch gốc cất

NaNO3 75,0 g/L 3,75 g

NaH2PO4.H2O 5,0 g/L 0,25 g

Na2SiO3.9H2O 30,0 g/L 1,50 g

+ Pha chế dung dịch gốc sơ cấp khoáng vi lượng

Hoá chất Nồng độ dung dịch gốc sơ Khối lượng cân/50 mL nước

cấp cất

FeCl3.6H2O - -

Na2EDTA.2H2O - -

MnCl2.4H2O 180,0 g/L 9,000 g

ZnSO4.7H2O 22,0 g/L 1,100 g

CoCl2.6H2O 10,0 g/L 0,500 g

CuSO4.5H2O 9,8 g/L 0,490 g

Na2MoO4.2H2O 6,3 g/L 0,315 g

+ Pha chế dung dịch gốc khoáng vi lượng

Hoá chất/Dd. gốc sơ Nồng độ mong muốn Lượng lấy/50 mL dd cấp

1,17 x10-2 M (3,15 g/L) 0,1575 g FeCl3.6H2O

1,17 x10-2 M (4,36 g/L) 0,218 g Na2EDTA.2H2O

9,10 x10-4 M Ddgsc. MnCl2.4H2O 50 µL

7,65 x10-5 M 50 µL Ddgsc. ZnSO4.7H2O

4,20 x10-5 M 50 µL Ddgsc. CoCl2.6H2O

3,93 x10-5 M 50 µL Ddgsc. CuSO4.5H2O

2,60 x10-5 M 50 µL Ddgsc. Na2MoO4.2H2O

PL 3

+ Pha chế dung dịch gốc sơ cấp vitamin

Nồng độ dd. gốc Khối lượng cân/50 mL Hoá chất sơ cấp nước cất

Thiamine.HCl (Vitamin B1) - -

1,0 g/L 0,05 g Biotin (Vitamin H)

1,0 g/L 0,05 g Cyanocobalamin (Vitamin B12)

+ Pha chế dung dịch gốc vitamin

Lượng lấy/50

Vitamin Nồng độ mong muốn mL dd. chung

5,92 x10-4 M (200 Thiamine.HCl (Vitamin B1) 10 mg mg/L)

Ddgsc. Biotin (Vitamin H) 4,10 x10-6 M 50 µL

Ddgsc. Cyanocobalamin (Vitamin 7,38 x10-7 M 50 µL B12)

+ Pha chế môi trường cuối cùng

Dung dịch Nồng độ sử Lượng sử Nồng độ cuối trong môi

dụng dụng trường

Ddg. NaNO3 75 g/L 1 mL 8,82 x10-4 M

Ddg. NaH2PO4.H2O 5 g/L 1 mL 3,62 x10-5 M

Ddg. Na2SiO3.9H2O 30 g/L 1 mL 1,06 x10-4 M

Dd. gốc vi lượng § xem bảng 2.3 1 mL 1‰ nồng độ bảng 2,3

Dd. gốc vitamin § xem bảng 2.5 0,5 mL 1‰ nồng độ bảng 2,5

PL 4

GCGTTTCTTATACTGTATGGAAGGTATTAACCGTGCATCAGCATCAACAGGTGAA

ACAAAAGGTTCTTACTTAAACATCACTGCTGGTACAATGGAAGAAGTTTACAAAC

GTGCTGAATACGCTAAAGCAGTAGGTTCTGTAATTGTTATGATCGATTTAGTTATG

GGTTATACAGCTATTCAATCAATTGCATACTGGGCTCGTGAAAACGATATGTTATT

ACACTTACACCGTGCTGGTAACTCTACATACGCACGTCAAAAAAATCATGGTATT

AACTTCCGTGTTATCTGTAAGTGGATGCGTATGGCTGGTGTAGATCATATCCACGC

TGGTACAGTTGTAGGTAAATTAGAAGGTGATCCTTTAATGATTAGAGGTTTCTAC

GATATTTTACGTGAAACTAACTTAGATGTTAACTTACCATACGGTATTTTCTTCGA

AATGACATGGGCAAGTTTACGTCGTTGTATGCCTGTAGCTTCAGGTGGTATTCACT

GTGGTCAAATGCACCAATTAGTTCACTACTTAGGTGATGACGTAGTATTACAATTC

GGTGGTGGTACAATCGGTCACCCTGATGGTATTCAAGCAGGTGCTACAGCTAACC

GTGTTGCATTAGAAGCAATGGTATTAGCTCGTAACGAAGGTGCTGACTACTTCAA

CCCACAAGTTGGTCCTCAAATTTTACGTGAGGCAGCTAAAACATGTGGTCCTTTA

CAAACAGCTTTAGACTTATGGAAAGATATCAGCTTCAACTACACATCTACAGATA

CAGCTGATTTCGCTACAACACCTACAGCAAACGTATAATAAATTAATTCTAAAAC

ACTTAAGGAGTATTTGAATAGTG

Phụ lục 3. Kết quả giải trình tự vùng gen rbcL-3P sau khi loại bỏ trình tự mồi

Phụ lục 4. Phân tích phương sai 1 nhân tố về ảnh hưởng của mật độ ban đầu

khác nhau đến sinh trưởng của tảo silic Entomoneis sp.

N1

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha = 0.05

3

1

2

4

4 7.720000

1

4

19.250000

2

4

22.843750

3

4

29.426250

4

Sig.

1.000

1.000

1.000

1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

PL 5

N2

Duncan

N

Subset for alpha=0.05

Mật độ

2

3

1

4

13.452500

1

4

26.750000

2

4

30.327500

3

4

37.042500

4

1.000

.068

1.000

Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

N3

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha=0.05

1

2

3

4

20.2775

4

1

27.287500

4

2

35.347500

4

3

42.357500

4

4

Sig.

1.000

1.000

1.000

1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

N4

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha=0.05

1

2

3

4

4 28.355000

1

35.370000

4

2

42.980000

4

3

49.750000

4

4

Sig.

1.000

1.000

1.000

1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

PL 6

N5

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha=0.05

1

2

3

4

4 33.087500

1

4

38.595000

2

4

41.802500

3

4

50.765000

4

Sig.

1.000

1.000

1.000

1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

N6

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha=0.05

2

3

1

39.830000

41.710000

4 4 4 4

46.820000 46.820000 .151

1.000

.220

1 2 3 4 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

N7

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha=0.05

1

2

3

41.027500

4

1

4

49.095000

2

4

49.115000

3

4

55.012500

4

1.000

Sig.

1.000

.992

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

PL 7

N8

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha=0.05

1

2

3

4

4 43.657500

2

4

47.845000

1

4

54.890000

3

4

62.187500

4

Sig.

1.000

1.000

1.000

1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

N9

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha=0.05

1

2

3

45.375000

4

1

4

54.187500

2

4

56.720000

56.720000

3

4

59.718750

4

Sig.

1.000

.220

.151

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

N10

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha=0.05

1

4

47.450000

2

4

48.542500

1

4

50.075000

3

4

50.282500

4

Sig.

.162

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

PL 8

N11

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha=0.05

1

2

3

41.075000

4

2

45.615000

4

1

47.325000

4

3

4

54.542500

4

1.000

Sig.

1.000

.423

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

N12

N

Subset for alpha=0.05

Duncan Mật độ

2

1 42.087500

4 4 4 4

48.480000 50.180000 50.285000 .342

1.000

1 2 4 3 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

N13

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha=0.05

2

3

1

39.842500 41.397500

46.147500

4 4 4 4

.299

1.000

56.457500 1.000

1 2 3 4 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

PL 9

N14

Duncan

Mật độ

N

Subset for alpha=0.05 2

3

1 34.095000

38.187500 41.625000

4 4 4 4

1.000

.063

57.562500 1.000

1 2 3 4 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

Phụ lục 5. Phân tích phương sai 1 yếu tố về ảnh hưởng của pH đến mật độ tảo

silic Entomoneis sp.

N1

Duncan pH

N

Subset for alpha=0.05

1

2

7.05750 7.29000 7.37000 7.40250 7.44500

4 4 4 4 4 4

.254

7.29000 7.37000 7.40250 7.44500 7.83750 .112

2 1 3 5 4 6 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000. N2

Duncan pH

N

Subset for alpha=0.05

1

2

6.23500 6.66000

4 4 4 4 4 4

7.47250 7.61000 7.68750 7.98000 .100

1 2 3 4 6 5 Sig. .133 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

PL 10

N3

Duncan pH

N

Subset for alpha=0.05

2

3

4

1 6.01250 6.50250

7.33250 7.70750

7.70750 8.17000

4 4 4 4 4 4

8.90500

1 2 3 6 4 5

Sig.

.077

.169

.094 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

N4 Duncan

pH

N

Subset for alpha=0.05

2

3

4

1 7.12500 7.18000

8.01250 8.38750

8.38750 8.75000

4 4 4 4 4 4

1 2 3 4 6 5

9.85250 1.000

Sig.

.856

.226

.242

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

N5

Duncan pH

N

1

Subset for alpha=0.05 2

3

8.01250 8.31250 8.45250

9.07500 9.26250

4 4 4 4 4 4

10.26250

1 2 3 6 4 5

1.000

Sig.

.145

.503

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

PL 11

N6

Duncan

Subset for alpha=0.05

pH

N

3

2

7.60750 7.60750 7.85750

1 2 5 3 4 6

1 4 6.53000 4 4 4 4 4

9.39500 9.42750 .900

Sig.

1.000

.366

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size=4.000.

Phụ lục 6. Phân tích phương sai 1 nhân tố về sự thay đổi pH qua các ngày dưới

các mức pH ban đầu khác nhau

N1 Duncan

Mức

N

3 7.82000 7.89750

5 8.16250 1.000

1 2 3 4 5 6 Sig.

1 7.33500 1.000

Subset for alpha = 0.05 4 8.00750 1.000

2 7.61250 1.000

.120

4 4 4 4 4 4 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

N2

N

Mức

1 2 3 4 5 6 Sig.

4 4 4 4 4 4

1 7.40500 7.51250 .382

Subset for alpha = 0.05 2 7.94250 8.03500 8.10750 .209

3 8.03500 8.10750 8.26500 .085

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

PL 12

N3 Duncan

Subset for alpha = 0.05

Mức

N

1 6.77250

2 7.30250

3

4

1 2

4 4

7.76750

3

4

1.000

1.000

7.88250 8.04750 .109

8.04750 8.24500 .227

4 5 6 Sig.

4 4 4

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

N4

Duncan

Mức

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

7.34500

7.81000 7.91750 8.08250

4 6.87500 4 4 4 4 4

1.000

1.000

8.08250 8.28750 .220

.126

1 2 3 4 5 6 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

N5

Duncan

Mức

N

Subset for alpha = 0.05 4

3

5

2

7.09000

7.64000 7.80000

7.80000 8.02750

1 4 6.62250 4 4 4 4 4

1.000

1.000

.103

8.30750 1.000

1 2 3 4 5 6 Sig. .242 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

PL 13

N6 Duncan

N

Mức

5 8.26750

4 4 4 4 4 4

1 6.38500 1.000

Subset for alpha = 0.05 4 7.88500 8.01250 .232

3 7.57750 1.000

2 7.12000 1.000

1.000

1 2 3 4 5 6 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

N7 Duncan

N

Mức

5 8.32750

4 4 4 4 4 4

1 6.43500 1.000

Subset for alpha = 0.05 4 7.89000 8.03500 .173

3 7.42500 1.000

2 6.84000 1.000

1.000

1 2 3 4 5 6 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

N8 Duncan

Subset for alpha = 0.05

N

Mức

2

4

5

2 1 3 4 5 6

4 4 4 4 4 4

1 6.56500 6.72500 .159

7.44250 1.000

3 7.78500 1.000

8.03250 1.000

8.31250 1.000

Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

PL 14

Phụ lục 7. Ảnh hưởng của pH đến Fv/ Fm

N1

N

Subset for alpha = 0.05

Duncan pH

1

4 4 4 4 4 4

.72750 .73000 .73250 .73250 .73250 .73500 .442

5 4 1 3 6 2 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

N2

N

Subset for alpha = 0.05

Duncan pH

1

4 4 4 4 4 4

.73000 .73250 .73250 .73500 .73750 .73750 .059

5 3 6 1 2 4 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

N3

Duncan

pH

N

Subset for alpha = 0.05

2

1 .73250 .73500 .73500 .73750 .74250

4 4 4 4 4 4

5 1 3 4 6 2

.74250 .74750 .272

.054 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

PL 15

N4

Duncan

pH

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

.73250 .74250 .74250 .74250 .74750

4 4 4 4 4 4

.054

.74250 .74250 .74250 .74750 .75000 .321

1 2 3 5 4 6 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

N5

Duncan pH

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

.72500

4 4 4 4 4 4

1.000

.74500 .74500 .74750 .75000 .75250 .332

1 2 5 3 4 6 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

N6

Duncan pH

N

Subset for alpha = 0.05 1

4 4 4 4 4 4

.72500 .73750 .74000 .74000 .74500 .74500 .191

1 2 3 5 6 4 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

PL 16

N7

Duncan pH

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

.69500 .70750 .71500 .72000

4 4 4 4 4 4

.155

.70750 .71500 .72000 .73250 .73500 .126

2 1 3 5 4 6 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.

N8

Duncan pH

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

.63000

4 4 4 4 4 4

.69250 .69750 .70250 .72000 .72750 .053

2 5 3 1 4 6 Sig. 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000.