Khảo sát dịch trích từ hoa dừa cạn (Catharanthus roseus) ức chế virus Dengue trong kỳ nguyên phân tế bào gan

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> <br /> KHẢO SÁT DỊCH TRÍCH TỪ HOA DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS)<br /> ỨC CHẾ VIRUS DENGUE TRONG KỲ NGUYÊN PHÂN TẾ BÀO GAN<br /> Nguyễn Văn Linh*, Phạm Thị Bảo Trân*, Lê Thị Chi**, Bùi Chí Bảo***, Châu Gia Các****<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Giới thiệu: Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính gây nên bởi virus Dengue, lưu<br /> hành chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở bệnh nhân SXHD chức năng gan bị rối loạn, tế bào gan người<br /> là tế bào đích của virus khi xâm nhiễm và quá trình nhân bản của virus gây ra tiến trình hoại sinh trong tế bào<br /> này. Do chưa có vaccine phòng ngừa cũng như thuốc điều trị đặc hiệu nên tỉ lệ người mắc bệnh và tử vong không<br /> ngừng gia tăng. Điều này trở thành mối quan ngại lớn đối với sức khỏe cộng đồng trên bình diện quốc tế. Vì thế,<br /> việc tìm ra những dược liệu có khả năng ức chế quá trình nhân bản của virus đang được quan tâm trong thời<br /> gian gần đây. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) chứa những hợp chất có hoạt tính sinh học như alkaloid có khả<br /> năng ức chế quá trình phân bào. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả của dịch trích từ<br /> hoa dừa cạn trong việc ức chế sự nhân bản virus Dengue trong kỳ nguyên phân tế bào gan.<br /> Mục tiêu: Khảo sát hiệu quả ức chế sự nhân bản của virus Dengue trong tế bào gan bằng thuốc trích từ hoa<br /> dừa cạn.<br /> Phương pháp: Thu dịch trích từ hoa dừa cạn trắng và kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp HPLC. Xác<br /> định khả năng sống của tế bào khi nhiễm virus Dengue qua phương pháp xác định chỉ số MOI. Khảo sát nồng độ<br /> dịch trích từ hoa dừa cạn lần lượt là 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml để xác định nồng độ ức chế nhân bản của<br /> virus nhưng tế bào gan vẫn sống. Đánh giá tác động của thuốc lên tế bào đã nhiễm virus Dengue bằng phương<br /> pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang và biểu hiện RNA của virus thông qua phương pháp RT-PCR.<br /> Kết quả: Dịch trích từ mẫu hoa khô cho chất lượng tốt hơn mẫu tươi. Tại chỉ số MOI 50 số tế bào bị nhiễm<br /> virus còn sống chiếm tỉ lệ khoảng 80% cao hơn MOI 10 và MOI 100. Tế bào gan có tỷ lệ sống cao và giảm khả<br /> năng nhân bản của virus Dengue khi xử lý thuốc ở nồng độ 100 ng/ml. Kết quả kiểm tra RT-PCR cũng cho thấy<br /> thuốc có hiệu quả ức chế quá trình nhân bản của virus Dengue.<br /> Kết luận: Dịch trích từ hoa dừa cạn có hiệu quả làm giảm sự nhân bản của virus Dengue trong kỳ nguyên<br /> phân tế bào gan.<br /> Từ khoá: Hoa dừa cạn, sốt xuất huyết, DEN-2, tế bào Chang Liver.<br /> ABSTRACT<br /> SURVEY DRUG EXTRACTED FROM FLOWERING PERIWINKLE (CATHARANTHUS ROSEUS)<br /> INHIBITING VIRUS DENGUE ON DURING MITOSIS LIVER CELL.<br /> Nguyen Van Linh, Pham Thi Bao Tran, Le Thi Chi, Bui Chi Bao, Chau Gia Cac<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - Supplement of No 1 - 2016: 86 - 93<br /> <br /> Background: Dengue hemorrhagic fever (DHF) is an acute infectious disease caused by Dengue virus in<br /> tropical and subtropical regions. Dengue virus infected human liver cells and replicated, leading to dysfunctions<br /> and damages to liver cells. Currently, there are no preventive vaccine or specific drugs. Disease prevalent and<br /> mortality are inscreased continuously. Thus, DHF is a major concern in global health care. New drugs that<br /> <br /> <br /> * Đại học Cần Thơ **Đại học Cửu Long ***Đại học Y Dược Tp.Hồ Chí Minh<br /> ****Đại học Y Sungkyunwkan, Hàn Quốc<br /> Tác giả liên lạc : TS. Bùi Chí Bảo ĐT: 0909.708.225 Email: bcbao@ump.edu.vn<br /> <br /> 86 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> inhibit viral RNA replication are required. Catharanthus roseus contains biological compounds such as alkaloid<br /> which can inhibit mitosis. In this study, we investigate the inhibition effect of drug extracted from Catharanthus<br /> roseus in viral RNA replication on mitosis of liver cells.<br /> Objectives: Investigate the inhibition effect of drug extracted from Catharanthus roseus in viral RNA<br /> replication on mitosis of liver cells.<br /> Methods: Drug extracted from Catharanthus roseus was collected and checking purity by HPLC technique.<br /> Cell survival ability that infected by Dengue virus was measured by MOI index. Drug extracted with<br /> concentration of 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml was used to test inhibition effects. Drug effects was evaluated<br /> by immunocytochemistry and RT-PCR for RNA expression.<br /> Results: Drug extracted from dried materials are better than fresh materials. At MOI 50, cell survival was<br /> 80% which is higher than at MOI 10 and MOI 100. Survival rate is high and viral replication is decreased when<br /> treated with drug at 100 ng/ml. RT-PCR results showed that drug can inhibit viral RNA replication.<br /> Conclusions: Drug extracted from Catharanthus roseus can inhibit viral RNA replication in liver cell<br /> mitosis.<br /> Keywords: Catharanthus roseus, Dengue Hemorrhagic Fever, DEN-2, Chang Liver cells.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ bào Kuffer ở gan, tế bào monocyte ở máu<br /> ngoại biên(11). Do đó, tế bào gan và tế bào<br /> Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là một Kupffer có thể là các tế bào đích giúp virus<br /> bệnh nhiễm trùng cấp tính, nguyên nhân gây<br /> Dengue nhân lên, dựa trên cơ sở virus Dengue<br /> bệnh do virus Dengue có 4 tuýp huyết thanh<br /> nhân bản đặc biệt trong quá trình nguyên<br /> khác nhau là DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN- phân của tế bào gan(9). Suy gan tối cấp là một<br /> 4 . Bệnh truyền từ người sang người qua<br /> (1,11)<br /> biến chứng nghiêm trọng và có khả năng gây<br /> trung gian truyền bệnh là muỗi Aedes aegypti. tử vong cao(4,5,7,9). Ngoài ra, bằng phương pháp<br /> Do bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong cao nên hóa dịch mô, kháng nguyên virus Dengue đã<br /> SXHD được xem là vấn đề y tế quan trọng của được phát hiện trong tế bào gan từ những<br /> các quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt vùng ngoại tử cho thấy tế bào gan là vị trí<br /> Nam. Hàng năm, theo ước tính của Tổ chức Y chính sao chép virus sốt xuất huyết trong gan<br /> tế Thế giới có khoảng 20 triệu trường hợp và virus gây ra chết theo chương trình của tế<br /> nhiễm virus Dengue và khoảng 24.000 ca tử bào gan(10). DEN-2 có thể nhiễm đồng đều đến<br /> vong(11). Tại Việt Nam, SXHD được phát hiện năm dòng tế bào gan, nhưng tỷ lệ nhân bản<br /> từ năm 1959, bệnh lưu hành quanh năm của virus cao trong các dòng tế bào Hul7, PLC,<br /> nhưng thường tăng cao từ tháng 6 đến tháng M3B và Chang cao hơn trong dòng tế bào<br /> 11. Hơn 85% các ca SXHD và 90% các ca tử HA22T(6). Có thể đây yếu tố phân chia tế bào<br /> vong xảy ra ở các tỉnh phía Nam của Việt đóng vai trò quan trọng trong việc nhân lên<br /> Nam. Khoảng 90% các ca tử vong do SXHD là của virus trong tế bào gan. Vì thế, việc tìm ra<br /> dưới 15 tuổi(11). Tỷ lệ mắc bệnh giữa các năm những hoạt chất có khả năng ức chế quá trình<br /> và giữa các miền dao động rất khác nhau. nhân bản của virus cần được quan tâm.<br /> Hiện chưa có vaccine dự phòng hiệu quả đối<br /> Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) cũng có các<br /> với bệnh SXHD cũng như chưa có thuốc điều<br /> tên gọi khác như bông dừa, hoa hải đằng, trường<br /> trị đặc hiệu. Qua nghiên cứu, giải phẫu bệnh<br /> xuân. Cây dừa cạn có nguồn gốc từ châu Phi.<br /> học của gan và các tương quan sinh học trong<br /> Hiện nay, người ta đã xác định được các hoạt<br /> các trường hợp bệnh SXHD đã phát hiện<br /> chất của cây dừa cạn là những alkaloid có nhân<br /> kháng nguyên của virus Dengue được tìm<br /> indol trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều<br /> thấy ở đại thực bào, phổi, lách, tuyến ức, tế<br /> <br /> <br /> Khoa học Cơ bản 87<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> nhất trong rễ và lá. Những alkaloid trong dừa vincristine, prinin, vindolin, ajmalicin,<br /> cạn được chia làm 2 nhóm: nhóm alkaloid catharanthin, tetrahydroalstonin, vincosid(3). Các<br /> monomer có nhân indol hay indolinic như: dẫn xuất của vinblastine có khả năng ức chế<br /> ajmalicin, serpentin, alstonin, akuammin, phân bào.<br /> lochnerin, catharanthin, reserpin và vindolin. Mục tiêu của nghiên cứu nhằm tìm hiểu về<br /> Nhóm alkaloid dimer, không đối xứng gần như dược tính và ứng dụng hiện nay nhằm cung cấp<br /> đặc thù của loài dừa cạn như: vinblastine, các thông tin cần thiết cho việc tìm ra các loại<br /> vincristine, leurosin, leurosidin, rovidin(8). Dừa thuốc ức chế ngăn chặn bệnh SXHD.<br /> cạn ở nước ta có tỷ lệ alkaloid toàn phần là 0,1-<br /> 0,2%. Các chất chủ yếu là: vinblastine,<br /> ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Hoa dừa cạn trắng được thu hái ở tỉnh Đồng Tháp.<br /> A B C<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Hoa dừa cạn tươi (A), phơi khô (B) và nghiền thành bột (C).<br /> <br /> Phương pháp trypsin 10% FBS, 1% PS. Ủ trong tủ trữ ấm ở<br /> nhiệt độ 37oC, 5% CO2. Nuôi trong vòng 2-3<br /> Thu nhận mẫu thuốc<br /> ngày. Sau khi mật độ tế bào chiếm 70% - 80%<br /> Thu hái khoảng 200 g bông dừa cạn tươi, diện tích đĩa thì tiến hành cấy chuyền. Kết quả<br /> rửa sạch, phơi khô. Sau đó cân lại được 22 g được đánh giá bằng cách quan sát khả năng bám<br /> hoa khô. Nghiền thành bột mịn bằng máy xay dính, sự phát triển của tế bào sau 24 giờ nuôi và<br /> xát được khoảng 16,6 g bột. Hoà tan với kiểm tra sự tạp nhiễm dưới kính hiển vi soi<br /> DMSO, gia nhiệt ở nhiệt độ khoảng 60 - 700C, ngược (Olympus).<br /> khoảng 30 phút, lọc qua cột lọc 0,2 mm. Chạy<br /> Nhiễm DEN-2 vào tế bào Chang Liver<br /> sắc kí HPLC để kiểm tra độ tinh sạch. Thu<br /> nhận được dịch trích. Pha loãng dung dịch gốc chứa virus trong<br /> SFM trong ống tuýp 1,5 ml. Bắt đầu bằng cách<br /> Nuôi cấy tế bào Chang Liver<br /> thêm 500 μl SFM vào mỗi ống. Trộn các ống tại<br /> Giữ ống tế bào trong bể ổn nhiệt 37oC và lắc mỗi bước pha loãng. Rửa sạch các tế bào trong<br /> thật nhanh, tế bào sẽ tan ra trong vòng 1 phút. các đĩa lây nhiễm, hai lần với 2 ml PBS. Ủ các đĩa<br /> Sau đó đặt cốc thủy tinh chứa cồn 70% và ở 370C cho đến khi sẵn sàng cho thu kết quả.<br /> chuyển ngay vào tủ cấy để thao tác. Mở ống<br /> Xác định chỉ số MOI (Multiplicity of<br /> đựng nhưng không cho cồn rơi vào trong ống.<br /> Infection)<br /> Chuyển toàn bộ những gì trong ống vào đĩa nuôi<br /> cấy và thêm môi trường Mccoy’s 5A có bổ sung Nhiễm virus sang tế bào Chang Liver<br /> <br /> <br /> <br /> 88 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> trong môi trường Mccoy’s 5A bổ sung 10% phòng, sau đó phá màng tế bào bằng chất tẩy<br /> FBS, 1% PS với nồng độ virus (mg/ml) giảm nhẹ triton-X100 (0,03%) để giúp kháng thể đi<br /> dần: 1/100; 1/500; 1/1000. Ủ trong 24 giờ ở vào và bắt được với protein, tiếp theo ủ với<br /> 37oC. Sau đó quan sát dưới kính hiển vi huỳnh kháng thể trong vòng 1-2 giờ, sau đó rửa lại<br /> quang. So sánh tỷ lệ tế bào sống/tế bào chết và với PBS 3 lần, tiếp tục ủ với kháng thể thứ 2 (ủ<br /> tỷ lệ tế bào bị nhiễm virus/ tế bào chưa bị trong tối), kháng thể thứ 2 này có thể bắt được<br /> nhiễm ở các nồng độ khác nhau. Kết quả được huỳnh quang với màu tùy theo bước sóng,<br /> đánh giá thông qua chỉ số MOI. tiếp tục rửa lại với PBS 3 lần, mẫu thu được cố<br /> Đồng nhất chu kỳ tế bào Chang Liver định trên slide và dùng lamen đậy lại. Quan<br /> sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (ZEISS).<br /> Đồng nhất tế bào về pha G1: chuyển tế bào vào<br /> bình Roux chứa môi trường 10% huyết thanh. Ly trích RNA virus và RT-PCR<br /> Khi đạt độ phủ khoảng 70%, thay môi trường RNA virus được ly trích từ dịch nuôi cấy tế<br /> serum starvation (0.1% FBS). Ủ tế bào ở 370C, 5% bào theo phương pháp TRIzol. Tổng hợp cDNA<br /> CO2 trong 24 giờ. Sau đó thêm vào Thymidine. rồi sau đó tiến hành RT-PCR theo bộ Kit<br /> Đồng nhất tế bào về pha S: Xử lý tương tự như pha TaKaRa. Đánh giá kết quả dựa vào band hình<br /> G1 nhưng thêm vào 5-fluorodeoxyuridine. Đồng điện di trên gel agrose 2%.<br /> nhất tế bào về pha G2/M: chuyển tế bào vào bình<br /> Bảng 1: Trình tự các cặp mồi cho phản ứng RT–PCR.<br /> Roux chứa môi trường 10% huyết thanh. Cho<br /> Marker Trình tự mồi Kích thước<br /> thêm 200 ng/ml Colchicines, ủ tế bào ở 370C, 5% F: GGCCGCAACCATGGCAAACG<br /> DEN-2 211bp<br /> CO2 trong khoảng thời gian: 6 giờ để đưa tế bào R: GGCCGCAACCATGGCAAACG<br /> F: GCCTTCCGTGTCCCCACTGC<br /> về pha G2, 12-24 giờ để đưa tế bào về pha M. GAPDH<br /> R: CAATGCCAGCCCCAGCGTCA<br /> 411bp<br /> <br /> Nhuộm miễn dịch huỳnh quang<br /> Rửa tế bào với nước muối sinh lý và ổn<br /> định bằng PFA (4%) trong 5 phút ở nhiệt độ<br /> KẾT QUẢ<br /> Kết quả phân tích HPLC mẫu hoa dừa cạn<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: Kết quả phân tích HPLC mẫu hoa dừa cạn.<br /> A: mẫu chuẩn DMSO; B: DMSO có chứa mẫu hoa tươi; C: DMSO có chứa mẫu hoa khô<br /> Nhận xét: Kết quả phân tích bằng phương trái cho thấy (Hình A) trong vùng chạy từ<br /> pháp sắc kí lỏng hoà tan với dung dịch chuẩn khoảng 3,6 đến 5 ppm đã xác định có 10 đỉnh<br /> DMSO nhiệt độ 60 C sắc ký chạy từ phải sang<br /> o (peak). (Hình B) hoà tan DMSO với mẫu tươi<br /> <br /> <br /> Khoa học Cơ bản 89<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> trong vùng chạy từ 1,2-1,6 ppm có sự xuất hiện 1 gây ngộ độc tế bào. Các tế bào có chỉ số MOI 10<br /> đỉnh còn chập nhau 1 phần chưa tách hoàn hoàn. và MOI 100 đều không thích hợp cho các thí<br /> (Hình C) hoà tan DMSO với mẫu khô trong nghiệm tiếp theo. Ở chỉ số MOI 50 (tương ứng<br /> vùng chạy từ 1,2-1,6 ppm có sự xuất hiện của 1 với nồng độ 1/500), số tế bào bị nhiễm virus còn<br /> đỉnh tách rời nhau hoàn toàn. Như vậy ở mẫu sống chiếm tỉ lệ khoảng 80%, khả năng tồn tại<br /> khô khi phân tích thì cho kết quả tách các chất của virus Dengue là cao và ổn định tối ưu.<br /> hoàn toàn tốt hơn so với mẫu tươi.<br /> Kết quả nuôi cấy tế bào<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4: Kết quả nhiễm DEN-2 thông qua chỉ số<br /> MOI.<br /> <br /> Biểu hiện hình thái của virus Dengue sau<br /> khi tác động thuốc<br /> Hình 3: Tế bào Chang Liver sau khi nuôi cấy.<br /> <br /> Nhận xét: Sau 24h nuôi cấy, tế bào Chang<br /> Liver đã bám vào bề mặt môi trường nuôi cấy và<br /> cũng có một số tế bào không bám được vào bề<br /> mặt môi trường. Với những tế bào Chang Liver<br /> có khả năng bám dính vào bề mặt môi trường là<br /> Chang Liver có khả năng thích nghi với môi<br /> trường nuôi cấy. Còn đối với các tế bào Chang<br /> Liver không bám được vào môi trường là do tế<br /> bào chết do bị sốc khi xử lí với trypsin hoặc các tế<br /> bào này bị trypsin ức chế làm mất khả năng bám<br /> dính của tế bào. Sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát<br /> thấy các tế bào Chang Liver đã phát triển và tăng Hình 5: Kết quả điều trị virus Dengue-2 thuốc với<br /> sinh phủ khắp đĩa nuôi cấy. Chứng tỏ các tế bào các nồng độ thuốc (A): (–) Dengue-2; (B): (+)<br /> đã thích nghi với điều kiện nuôi cấy. Tiến hành Dengue-2/ (-) thuốc; (C): + 100 ng/ml thuốc; (D):<br /> thay môi trường sau hai ngày nuôi để bổ sung +200 ng/ml thuốc; (E): +300 ng/ml thuốc.<br /> chất dinh dưỡng cho môi trường nuôi và loại bỏ<br /> các tế bào chết và các yếu tố gây cản trở cho sự Nhận xét: Tế bào nhiễm Dengue-2 khi cho<br /> tăng sinh của tế bào. thuốc tác động vào ở nồng độ khác nhau, thì với<br /> nồng độ 100 ng/ml ức chế được DEN-2 tế bào<br /> Kết quả nhiễm DEN-2 vào tế bào Chang không bị chết biểu hiện (GFP) phát sáng, các tế<br /> Liver bào chết biểu hiện các chấm đen, ở nồng độ 200<br /> Kết quả cho thấy ở MOI 10, khả năng tồn tại ng/ml nồng độ thuốc cao không có ức chế được<br /> của DEN-2 sau khi nhiễm vào tế bào Chang DEN-2 vì tế bào chết nhiều biểu hiện dấu chấm<br /> Liver tỉ lệ tế bào bị nhiễm virus Dengue còn sống đen, nồng độ 300 ng/ml nồng độ thuốc rất cao<br /> rất thấp. MOI 100 thì tỉ lệ này lại quá cao, có thể gây ra tế bào chết cao gây ngộ độc tế bào.<br /> <br /> <br /> 90 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> trong tế bào, tế bào Chang Liver khi cho thuốc<br /> tác động lên có các chấm màu xanh lục (GFP<br /> phát sáng) ít nhất, tương ứng với số lượng virus<br /> Denguegiảm di rất nhiều. Điều này đã chứng<br /> minh rằng khi có thuốc tác động lên tế bào<br /> nhiễm virus Dengue đã ức chế được sự nhân<br /> bản của Dengue.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6: Biểu hiện của virus Dengue.<br /> Nhận xét: Khi quan sát dưới ánh sáng huỳnh<br /> quang ta thấy các chấm có màu xanh lục là các<br /> hạt (particle) của virus Dengue (GFP phát sáng).<br /> Kết quả cho thấy tế bào Chang Liver có các chấm<br /> màu xanh lục (GFP phát sáng) rất nhiều, đặc biệt<br /> các đốm màu xanh do chưa có thuốc chứng tỏ Hình 7: Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm cDNA<br /> giai đoạn này sự nhân bản của virus Dengue bằng marker GAPDH (chứng nội).<br /> <br /> Kết quả RT-PCR<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 8: Kết quả diện di bằng marker DEN-2 và biểu đồ phân tích sản phẩm điện di.<br /> Nhận xét: Trong kết quả điện di, ở giếng BÀN LUẬN<br /> (Nước) không biểu hiện band hình; giếng (–<br /> Dược liệu và chế phẩm từ dược liệu có thành<br /> Thuốc), band điện di sáng và rõ; giếng (+ Thuốc)<br /> phần phức tạp, để đáp ứng được tính đặc hiệu,<br /> band rất mờ. Trong biểu đồ (sử dụng phần mềm<br /> thông thường phương pháp HPLC hay được sử<br /> ImageJ) so sánh giữa giếng không điều trị và<br /> dụng. HPLC cũng là phương pháp định lượng<br /> điều trị thuốc cho thấy, band ở giếng không điều<br /> phổ biến nhất trong các dược điển hiện hành.<br /> trị thuốc (62,04%) sáng và rõ hơn band ở giếng<br /> Tuy nhiên, để áp dụng các phương pháp này,<br /> điều trị thuốc (37,95%), chứng tỏ hiệu quả của<br /> một trong những yêu cầu đầu tiên là phải có các<br /> thuốc đã ức chế quá trình nhân bản của virus<br /> chất chuẩn. Hơn thế nữa, các chất chuẩn rất cần<br /> Dengue trong tế bào.<br /> thiết cho công tác nghiên cứu phát triển dược<br /> liệu và các chế phẩm từ dược. Vì vậy, phương<br /> <br /> <br /> <br /> Khoa học Cơ bản 91<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> pháp HPLC được lựa chọn trong nghiên cứu này quá trình nguyên phân của tế bào có thể làm<br /> để định lượng và xác định tạp chất liên quan. giảm và tiêu diệt virus. Nghiên cứu này cũng có<br /> Sau khi thu được dịch chiết toàn phần, thực hiện kết quả tương tự, virus DEN-2 hiện diện nhiều<br /> quá trình phân lập để tách riêng đối tượng trong chu trình G2-M của tế bào dòng Chang<br /> nghiên cứu. Việc phân lập các hợp chất nghiên Liver so với các chu trình tế bào khác. Kết quả<br /> cứu trong đề tài dựa trên các quá trình hóa lí này giúp mở ra một hướng liệu trị bệnh sốt xuất<br /> như dựa vào tính tan của hợp chất trong dung huyết do DEN-2.<br /> môi, khả năng thẩm thấu, khả năng phân bố của KẾT LUẬN<br /> chất vào môi trường. Tùy thuộc vào mức độ tinh<br /> khiết của hợp chất sau phân lập, quá trình tinh Nghiên cứu đã thu được dịch trích từ hoa<br /> chế có thể được thực hiện bằng một trong các dừa cạn tinh chiết từ ethanol và kiểm tra độ tinh<br /> phương pháp sau: nếu hợp chất sau phân lập đã khiếtqua phương pháp HPLC cho thấy ly trích<br /> có độ tinh khiết khá cao thì chỉ cần tinh chế đơn từ mẫu khô cho kết quả tốt hơn so với mẫu tươi.<br /> giản bằng cách kết tinh lại trong dung môi nhiều Xác định được khả năng tồn tại của tế bào Chang<br /> lần, nếu hợp chất sau phân lập có độ tinh khiết Liver sau khi nhiễm DEN-2 là khá cao khoảng<br /> chưa cao thì quá trình tinh chế có thể thực hiện 80%. Xác định được ở nồng độ thuốc 100ng/ml<br /> bằng cách lặp lại quá trình sắc kí cột như giai có khả năng giúp tế bào gan sống và giảm được<br /> đoạn phân lập để lựa chọn phân đoạn tinh khiết khả năng nhân bản của virus Dengue trong kỳ<br /> hơn, hoặc thay đối dung môi rửa giải hoặc kiểu nguyên phân tế bào Chang Liver. Quan sát được<br /> sắc kí. Trên thế giới, một số nghiên cứu gần đây sự biểu hiện kiểu hình khi quan sát dưới huỳnh<br /> cho thấy khi xử lý các tế bào Vero với quang và biểu hiện kiểu gen của virus Dengue<br /> cytochalasin D, một chất ức chế thông qua phương pháp RT-PCR. Đánh giá được<br /> macropinocytosis, ngoài tác dụng ức chế tế bào tác động của thuốc vào tế bào gan đã nhiễm<br /> như mong muốn còn dẫn đến ức chế sự xâm virus trong kỳ nguyên phân đồng thời biểu hiện<br /> nhiễm của virus(2) hay việc sử dụng đột biến trội làm giảm khả năng nhân bản của virus Dengue.<br /> Esp15 trong việc ức chế clathrin qua trung gian TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> của quá trình dung hợp hai tế bào cho thấy sự 1. Alvarez ME, et al (1985). Dengue and hepatic failure. Am. J.<br /> giảm xâm nhập của virus West Nile được trên tế Med, 79: 670-674.<br /> 2. Chu JJH, et al. (2004). Infectious Entry of West Nile Virus<br /> bào C6/36. Kết quả này đã làm giảm việc xâm Occurs through a Clathrin-Mediated Endocytic Pathway.<br /> nhập của virus Dengue rất khả quang, giảm đến Journal of Virology, 78: 10543-10555.<br /> 3. Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, tái<br /> 80%(2). các nghiên cứu của Chu và cs. (2004)(2) và<br /> bản lần thứ 7, trang 307-309. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội.<br /> Krishnan và cs. (2007)(5) đã điều tra sự xâm nhập 4. Krishnan MN, et al (2007). Rab 5 is required for the cellular<br /> của virus Dengue vào các tế bào HeLa, kết quả entry of Dengue and WestNile Viruses. Journal of Virology,<br /> 81(9):4881-5.<br /> cho thấy sự xâm nhập của virus Dengue nói 5. Lawn SD, et al (2003). Dengue haemorrhagic fever with<br /> riêng và chi flavivirus nói chung không chỉ fulminant hepatic failure in an immigrant returning to<br /> thông qua endocytosis mà còn bằng nhiều con Bangladesh. Clin. Inf. Dis, 37: 1-4.<br /> 6. Lin YL, et al(2000). Infection of five human liver cell lines by<br /> đường khác nhau, giúp ích đáng kể cho sự hiểu dengue-2 virus. J. Med. Virol., 60:425-431.<br /> biết của chúng ta về sự xâm nhập flavivirus vào 7. Lum LC, et al (1993). Fulminant hepatitis in Dengue infection.<br /> Southeast Asian J. Trop.Med. Public Health, 24(3): 467-471.<br /> tế bào chủ, từ đó sẽ có phương pháp ngăn chặn<br /> 8. Moreno-Valenzuela OA, et al(1998). Effect of differentiation on<br /> hiệu quả sự nhân bản hay sự xâm nhiễm của the regulation of indole alkaloid production in<br /> virus Dengue vào tế bào, lảm giảm các hậu quả Catharanthusroseus hairy roots. Plant Cell Rep, 18(1-2):99-104.<br /> 9. Perez EA, et al (2009). Microtubule inhibitors: differentiating<br /> đáng tiếc từ bệnh do virus Dengue gây raTừ tubulin-inhibiting agents based on mechanisms of action,<br /> những nghiên cứu đã công bố, có thể nhận ra clinical activity, and resistance. Mol Cancer Ther, 8(8):2086–<br /> một điểm chung là các thuốc hoặc chất ức chế 2095.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 92 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 10. Subramanian V (2005). Dengue haemorrhagic fever and Ngày nhận bài báo: 20/11/2015<br /> fulminant hepatic failure. Dig. Dis. Sci, 50: 1146-1147.<br /> 11. WHO (2014). Hỏi đáp về sốt xuất huyết Dengue và sốt xuất Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015<br /> huyết Dengue nặng. Tổ chức Y tế Thế giới, Văn phòng đại Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016<br /> điện WHO Việt Nam.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Khoa học Cơ bản 93<br />