Khảo sát đột biến CALR trên bệnh nhân xơ tủy nguyên phát bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017<br /> <br /> <br /> KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN CALR TRÊN BỆNH NHÂN XƠ TỦY NGUYÊN PHÁT<br /> BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA<br /> Phan Thị Xinh*, Hoàng Anh Vũ**<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> Mục tiêu: Xơ tủy nguyên phát là một dạng bệnh lý thuộc nhóm bệnh tân sản tăng sinh tủy có tủy<br /> xương bị xơ hóa, tăng sinh reticulin và gan lách tạo máu thay tủy. Các đột biến đặc trưng cho thể bệnh này<br /> bao gồm JAK2V617F (60%) và MPLW515L/K (5%). Gần đây, đột biến CALR được phát hiện trong khoảng<br /> 20 – 30% trường hợp xơ tủy nguyên phát với 2 loại đột biến phổ biến là mất 52 bp (loại 1), chèn 5 bp (loại<br /> 2) tại exon 9 gây lệch khung đọc và một số kiểu đột biến hiếm gặp khác. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này<br /> nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA exon 9 của gen CALR để khảo sát đột biến, góp<br /> thêm 1 dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy nguyên phát trên lâm sàng.<br /> Đối tượng và phương pháp: Mẫu máu ngoại vi trong ống chống đông EDTA của bệnh nhân xơ tủy<br /> nguyên phát âm tính với đột biến JAK2V617F được tách chiết DNA. Các cặp mồi xuôi và mồi ngược được<br /> thiết kế để khuếch đại đặc hiệu exon 9 của gen CALR. Sản phẩm PCR được giải trình tự theo hai chiều xuôi<br /> và ngược trên hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer để khảo sát đột biến.<br /> Kết quả: Cặp mồi CALR-g8F và CALR-g9R dùng để khuếch đại vùng exon 9 của gen CALR có nhiệt<br /> độ bắt cặp tối ưu là 550C. Phân tích kết quả giải trình tự chuỗi DNA ghi nhận 7/9 trường hợp có đột biến<br /> CALR chiếm 77,78%, trong đó phát hiện 2 kiểu đột biến bao gồm mất đoạn 52 bp (c.1099_1150del) và đột<br /> biến chèn thêm 5 bp (c.1154_1155insTTGTC), và các đột biến này đều ở dạng dị hợp tử. Kiểu mất đoạn 52<br /> bp gặp ở 6 bệnh nhân, là kiểu đột biến thường gặp nhất trong nghiên cứu này.<br /> Kết luận: Chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA phát hiện các<br /> đột biến CALR exon 9, giúp dễ dàng chẩn đoán các trường hợp xơ tủy nguyên phát không có đột biến<br /> JAK2V617F và MPLW515L/K trên lâm sàng.<br /> Từ khóa: Xơ tủy nguyên phát, gen CALR, đột biến gen, giải trình tự chuỗi DNA<br /> ABSTRACT<br /> DETECTION OF CALR MUTATIONS IN PRIMARY MYELOFIBROSIS BY DNA SEQUENCING<br /> Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 21 - No 2 - 2017: 322 - 326<br /> <br /> Purpose: Primary myelofibrosis (PMF) is a type of myeloproliferative neoplasms (MPNs)<br /> characterized by fibrosis in bone marrow, increased proliferation of reticulin and replacing bone marrow by<br /> liver and spleen for hematopoiesis. The typical mutations in this disease consist of JAK2V617F (60%) and<br /> MPLW515L/K (5%). Recently, CALR mutations were detected in approximately 20 – 30% of PMF patients<br /> with 2 common types of mutations including 52 bp deletetion (type 1) and 5 bp insertion (type 2) in exon 9<br /> leading to the frameshift and several other rare mutations. We aim to establish a procedure of DNA<br /> sequencing for CALR exon 9 and use for screening CALR mutations as an additional marker for diagnosis<br /> of PMF patients in clinical practice.<br /> <br /> <br /> * Bộ môn Huyết học - Đại học Y Dược TP.HCM; khoa Di truyền học phân tử, Bệnh viện Truyền máu<br /> Huyết học TP.HCM<br /> ** Bộ môn Mô phôi; Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM.<br /> Tác giả liên lạc: TS. Phan Thị Xinh ĐT: 0932 728 115 Email: phanthixinh@yahoo.com<br /> <br /> 322 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Methods: Genomic DNA was extracted from peripheral blood samples of JAK2V617F- negative PMF<br /> patients. Forward and reverse primers were designed to amplify specifically CALR exon 9. PCR products<br /> were sequenced bidirectionally using Sanger’s technique on an ABI 3130 Genetic Analyzer system.<br /> Result: The primers CALR-g8F and CALR-g9R were used to amplify exon 9 of CALR with optimal<br /> annealing temperature at 550C. The analysis of DNA sequencing results showed that 7 out of 9 patients<br /> (77.78%) carried CALR mutations, with 2 types of mutations including 52-bp deletion (c.1099_1150del)<br /> and 5-bp insertion (c.1154_1155insTTGTC), both were in heterozygous status. The 52-bp deletion type was<br /> the most common mutation, detected in 6 patients.<br /> Conclusion: We have successfully established the DNA sequencing procedure for detection of CALR<br /> exon 9 mutations, facilitating diagnosis of PMF in patients without JAK2V617F and MPLW515L/K<br /> mutations.<br /> Key words: Primary myelofibrosis, CALR gene, gene mutation, DNA sequencing.<br /> ĐẶTVẤNĐỀ protein với trọng lượng 46-kDa có 3 vùng cấu<br /> trúc và chức năng bao gồm một vùng đầu tận<br /> Nhóm bệnh tân sản tăng sinh tủy bao gồm N gắn lectin, một vùng giàu proline chứa vị trí<br /> bệnh bạch cầu mạn dòng tủy, đa hồng cầu tương tác Ca2+ có ái lực cao, và vùng đầu tận C<br /> nguyên phát, tăng tiểu cầu nguyên phát và xơ có tính acid. Calreticulin còn có vùng KDEL<br /> tủy nguyên phát. Bệnh đặc trưng bởi tình tại vị trí đầu tận C với nhiều vị trí gắn Ca2+ và<br /> trạng tăng sinh quá mức các tế bào máu và các mang nhiều vị trí gắn với bề mặt tế bào và với<br /> giai đoạn biệt hóa của tế bào trong tủy xương<br /> các yếu tố đông máu(3,4,6).<br /> và máu ngoại biên(2). Xơ tủy nguyên phát có<br /> Về mặt chẩn đoán, sinh thiết tủy và nhuộm<br /> tủy xương bị xơ hóa, tăng sinh reticulin và gan<br /> reticulin sẽ giúp chẩn đoán tình trạng xơ tủy<br /> lách tạo máu thay tủy, đặc biệt là lách. Hầu hết<br /> và mức độ xơ tủy, tuy nhiên cần tìm nguyên<br /> các trường hợp xơ tủy nguyên phát đều có<br /> nhân là xơ tủy nguyên phát hay thứ phát. Các<br /> lách to lúc chẩn đoán và khoảng 50% trường<br /> dấu ấn sinh học phân tử giúp các bác sĩ lâm<br /> hợp có gan to. Trong nhóm bệnh tân sản tăng<br /> sàng chẩn đoán được thể nguyên phát và có<br /> sinh tủy có các đột biến gen giúp chẩn đoán<br /> hướng điều trị phù hợp. Trong nghiên cứu<br /> bệnh như nhiễm sắc thể Philadelphia gặp<br /> này, chúng tôi thực hiện khảo sát đột biến<br /> trong bạch cầu mạn dòng tủy và đột biến gen<br /> CALR bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA,<br /> JAK2V617F gặp trong đa hồng cầu nguyên<br /> góp thêm 1 dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy<br /> phát, tăng tiểu cầu nguyên phát và xơ tủy<br /> nguyên phát trên lâm sàng.<br /> nguyên phát với tỷ lệ tương ứng là 99%, 60%,<br /> 60%(1). Ngoài ra, các đột biến tăng chức năng ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> liên quan gen MPL (MPLW515L/K) gặp trong<br /> Đối tượng<br /> 5% trường hợp xơ tủy nguyên phát, còn lại<br /> Nghiên cứu được thực hiện trên 10 bệnh<br /> khoảng 40% trường hợp xơ tủy nguyên phát<br /> nhân chẩn đoán xơ tủy nguyên phát theo tiêu<br /> chưa phát hiện đột biến gen.<br /> chuẩn của tổ chức y tế năm 2008 và không<br /> Đến cuối năm 2013, hai nghiên cứu của phát hiện đột biến JAK2 V617F.<br /> Klampfl (5), Nangalia (Error! Reference source not found.) và<br /> cộng sự đã xác định đột biến gen CALR mã Phương pháp:<br /> hóa Calreticulin trên 20 – 30% bệnh nhân (BN) Tách chiết genomic DNA<br /> xơ tủy nguyên phát không có đột biến gen 2 ml máu ngoại vi trong ống chống đông<br /> JAK2 và MPL. Gen CALR nằm trên NST có EDTA được lắc đều và tách chiết DNA<br /> 19p13.2 gồm 9 exon, tổng hợp Calreticulin<br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 323<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017<br /> <br /> bằng QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ) theo quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần<br /> hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. mềm CLC Main Workbench, so sánh với trình<br /> Thiết kế mồi tự chuẩn của gen CALR mang mã số<br /> NM_004343 trong GenBank để xác định đột<br /> Các đoạn mồi được thiết kế bằng phần<br /> biến gen.<br /> mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của<br /> gen CALR mang mã số NM_004343 trong KẾTQUẢVÀBÀNLUẬN<br /> GenBank (bảng 1).<br /> Xây dựng quy trình giải trình tự DNA<br /> Thực hiện PCR của gen CALR<br /> Mỗi tube PCR có thể tích 15 l chứa các Đột biến gen CALR gặp trong khoảng 25%<br /> thành phần gồm 1,5 µL 10X PCR buffer; 1,5 µL trường hợp xơ tủy nguyên phát và là đột biến<br /> dNTP 2,5 mM; 0,75 µL mồi xuôi và 0,75 µL thường gặp sau JAK2V617F (5,7,8). Các đột biến<br /> mồi ngược (10 M cho mỗi loại); 0,12 µL CALR gây ra các biến đổi liên quan trực tiếp<br /> TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, đến con đường truyền tín hiệu JAK-STAT và<br /> Nhật Bản) và 2 µL genomic DNA (50 - 100 ng). là nhân tố tiên lượng độc lập về mức độ nguy<br /> Chu trình luân nhiệt được thực hiện trên máy cơ(2,5,8). Khi xảy ra đột biến CALR, protein<br /> ABI 2700 (Apllied Biosystems, Mỹ). Sản phẩm calreticulin bị thay đổi ở vùng C-terminus và<br /> PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch làm mất vùng KDEL, dẫn tới sự tăng sinh bất<br /> agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide và thường các dòng tế bào máu và sinh bệnh(7).<br /> quan sát dưới hệ thống chụp ảnh điện di Khi phân tích về thời gian sống toàn bộ của<br /> ChemiDoc (Biorad, Mỹ). Sản phẩm PCR sau các trường hợp xơ tủy nguyên phát, nhiều<br /> đó được tinh sạch bằng illustraTM GFXTM PCR nghiên cứu đã cho thấy các BN mang đột biến<br /> DNA and Gel Band Purification Kit (GE CALR có nguy cơ tử vong thấp hơn so với các<br /> Healthcare) theo hướng dẫn sử dụng của nhà BN mang đột biến JAK2V617F hoặc MPL (3,8,9).<br /> sản xuất. Gen CALR có nhiều kiểu đột biến khác nhau,<br /> Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA trong đó 2 kiểu đột biến thường gặp là mất<br /> Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được đoạn 52-bp và chèn 5-bp TTGTC nên sử dụng<br /> thực hiện phản ứng cycle sequencing với kỹ thuật giải trình chuỗi DNA để phát hiện<br /> BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing các đột biến là cần thiết(8).<br /> kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều Trong nghiên cứu, chúng tôi thiết kế mồi<br /> xuôi và ngược. Sản phẩm sau đó được kết tủa để khuếch đại vùng exon 9 của gen CALR<br /> bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formanide, (bảng 1) là vị trí thường xảy ra các đột biến<br /> biến tính ở 95C trước khi làm lạnh đột ngột. làm thay đổi cấu trúc và chức năng của<br /> Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 protein calreticulin.<br /> Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và<br /> capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết<br /> Bảng 1: Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu<br /> Tên mồi Trình tự chuỗi (5’-3’) Đoạn gen được khuếch đại<br /> CALR-g8F GAAACCCTGTCCAAAGCAAG<br /> Dùng cho PCR Exon 8 – 9 (476 bp)<br /> CALR-g9R CAGGGCTGGACTGAGGCCTG<br /> Dùng cho sequencing CALR-g9F ACAACTTCCTCATCACCAACG<br /> Cặp mồi CALR-g8F và CALR-g9R được khi thay đổi nhiệt độ bắt cặp mồi trong<br /> dùng để khuếch đại vùng exon 9 của gen khoảng 550C – 600C, chúng tôi chọn được nhiệt<br /> CALR với kích thước là 476 bp (hình 1). Sau độ thích hợp cho phản ứng khuếch đại là 550C.<br /> <br /> <br /> <br /> 324 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> trường hợp). Trong 9 BN trên đã xác định âm<br /> tính JAK2V617F thì có 7/9 trường hợp phát hiện<br /> đột biến CALR, chiếm 77,78% với 2 kiểu đột biến<br /> là mất đoạn 52 bp (c.1099_1150del) và đột biến<br /> chèn thêm 5 bp (c.1154_1155insTTGTC), và các<br /> đột biến đều ở dạng dị hợp tử (hình 2). Mất đoạn<br /> 52 bp gặp trong 6 BN và là kiểu đột biến thường<br /> gặp nhất.<br /> Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi đã<br /> cho thấy rằng các trường hợp có mang đột<br /> Hình 1: Khuếch đại exon 8 – 9 gen CALR. Giếng biến CALR chiếm tỷ lệ cao ở BN xơ tủy<br /> 1: Mẫu BN; giếng 2: chứng dương (476 bp); giếng nguyên phát âm tính JAK2V617F, trong đó đột<br /> 3: nước; giếng 4: 1kb DNA Ladder. biến mất đoạn 52 bp là kiểu đột biến thường<br /> Sản phẩm khuếch đại được thực hiện giải gặp nhất, tương đồng với các nghiên cứu khác<br /> trình tự chuỗi DNA theo phương pháp Sanger trên thế giới(7,8,10). Nghiên cứu của Nangalia J<br /> trên hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer. Kết và cộng sự (2013) đã phát hiện đột biến CALR<br /> quả khuếch đại gen CALR của các mẫu phù xuất hiện ở 18/32 trường hợp xơ tủy nguyên<br /> hợp với trình tự gen CALR từ dữ liệu genome. phát âm tính đột biến JAK2V617F, chiếm tỷ lệ<br /> Điều này cho thấy cặp mồi do chúng tôi thiết là 56,25%(7). Năm 2014, Rumi E và cộng sự<br /> kế đã khuếch đại đặc hiệu trình tự gen CALR khảo sát trên 218 trường hợp xơ tủy nguyên<br /> để phát hiện đột biến. phát âm tính với JAK2V617F cho kết quả là<br /> 64,22% trường hợp mang đột biến CALR,<br /> Kết quả giải trình tự DNA của gen CALR<br /> trong đó đột biến mất đoạn 52 bp chiếm 72%,<br /> trên mẫu BN xơ tủy nguyên phát<br /> đột biến chèn đoạn 5 bp chiếm 16% và các đột<br /> Ứng dụng quy trình kỹ thuật đã được thiết biến khác chiếm tỷ lệ thấp(8). Đồng thời Tefferi<br /> lập ở trên để khảo sát đột biến gen CALR cho 9 A và cộng sự cũng đã công bố tỷ lệ các kiểu<br /> BN được chẩn đoán xơ tủy nguyên phát đột biến CALR xuất hiện ở 113 BN xơ tủy<br /> không mang đột biến gen JAK2V617F, chúng nguyên phát với 98 trường hợp (74,8%) là đột<br /> tôi phát hiện 7 BN có đột biến và hầu hết là biến mất đoạn 52 bp, 15 trường hợp (11,5%) là<br /> đột biến mất đoạn (Bảng 2). kiểu đột biến chèn đoạn 5 bp, và 18 trường<br /> Bảng 2: Đặc điểm bệnh nhân trong nghiên cứu hợp còn lại (13,7%) là các kiểu đột biến khác(10).<br /> Mã nghiên cứu Tuổi Giới Tình trạng đột biến Việc phát hiện các kiểu đột biến khác nhau và<br /> PMF-01 30 Nữ c.1154_1155insTTGTC tỷ lệ đột biến tương đồng với các nghiên cứu<br /> PMF-02 60 Nữ Không<br /> khác cho thấy kỹ thuật giải trình tự chuỗi<br /> PMF-03 50 Nữ c.1099_1150del<br /> PMF-04 32 Nữ Không DNA trong nghiên cứu này phù hợp với việc<br /> PMF-05 77 Nữ c.1099_1150del khảo sát đột biến CALR trên BN xơ tủy<br /> PMF-06 38 Nữ c.1099_1150del nguyên phát. Kết quả trên cho thấy chúng tôi<br /> PMF-07 61 Nam c.1099_1150del đã xây dựng thành công quy trình giải trình tự<br /> PMF-08 83 Nữ c.1099_1150del<br /> chuỗi DNA cho phân tích đột biến gen CALR,<br /> PMF-09 42 Nam c.1099_1150del<br /> giúp chẩn đoán chính xác xơ tủy nguyên phát<br /> Kết quả nghiên cứu ở bảng 2 cho thấy các<br /> để điều trị phù hợp.<br /> BN được chẩn đoán xơ tủy nguyên phát có<br /> tuổi trung bình là 53 tuổi, thấp nhất là 30 tuổi<br /> và cao nhất là 83 tuổi, và hầu hết là BN nữ (7/9<br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 325<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: Đột biến CALR trên exon 9.<br /> Dạng đột biến mất đoạn thường gặp<br /> c.1099_1151del52 (A) và đột biến chèn<br /> đoạn c.1154_1155insTTGTC (B).<br /> <br /> <br /> <br /> 6. Kuwabara K1, Pinsky DJ, Schmidt AM, et al (1995),<br /> KẾTLUẬN Calreticulin, an antithrombotic agent which binds to<br /> vitamin K-dependent coagulation factors, stimulates<br /> Kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA phát endothelial nitric oxide production, and limits thrombosis<br /> hiện các đột biến CALR đã được thiết lập trong in canine coronary arteries, J Biol Chem. Apr<br /> điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam, 7;270(14):8179-87.<br /> 7. Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ, et al (2013), Somatic<br /> giúp chẩn đoán và tiên lượng bệnh cho các BN CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with<br /> xơ tủy nguyên phát. Hơn nữa, nghiên cứu này nonmutated JAK2, N Engl J Med;369: 2391–405.<br /> 8. Rumi E, Pietra D, Pascutto C, et al (2014), Clinical effect of<br /> cũng cung cấp nền tảng để xây dựng cơ sở dữ<br /> driver mutations of JAK2, CALR, or MPL in primary<br /> liệu riêng cho BN tại Việt Nam. myelofibrosis, Blood, 124(7):1062-9.<br /> 9. Mario Cazzola, Robert Kralovics (2014), From Janus<br /> TÀILIỆUTHAMKHẢO kinase 2 to calreticulin: the clinically relevant genomic<br /> 1. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al (2005), Acquired landscape of myeloproliferative neoplasms, Blood,<br /> mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human 123:3714-3719.<br /> myeloproliferative disorders, Lancet, 365(9464):1054-61. 10. Tefferi A, Lasho TL, Tischer A, et al (2014), The prognostic<br /> 2. Campbell PJ, Green AR (2006), The myeloproliferative advantage of calreticulin mutations in myelofibrosis<br /> disorders, N Engl J Med, 7;355(23):2452-66. might be confined to type 1 or type 1-like CALR variants,<br /> 3. Chi J, Nicolaou KA, Nicolaidou V, et al (2014), Blood, 2014, 124:2465-2466.<br /> Calreticulin gene exon 9 frameshift mutations in patients<br /> with thrombocytosis. Leukemia, 28(5):1152-4.<br /> 4. Gold LI, Eggleton P, Sweetwyne MT, et al (2010), Ngày nhận bài báo: 06/03/2017<br /> Calreticulin: non-endoplasmic reticulum functions in<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/03/2016<br /> physiology and disease, FASEB J, 24:665–83.<br /> 5. Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al (2013). Ngày bài báo được đăng: 05/04/2017<br /> Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative<br /> neoplasms. N Engl J Med, 369:2379–90.<br /> <br /> <br /> <br /> 326 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017<br />