Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ bacillus subtilis cố định trong gel alginate

Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate<br /> <br /> <br /> <br /> KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ ENZYME PROTEASE THU NHẬN TỪ BACILLUS<br /> SUBTILIS CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE<br /> Trần Hồng Thắng*, Trần Thị Duân Hải*, Nguyễn Huỳnh Thanh Phong*<br /> Nguyễn Thị Tình*, Hồ Bảo Xuyên*, Nguyễn Văn Dũng*<br /> TÓM TẮT<br /> Thu nhận enzyme từ tế bào vi sinh vật cố định trong chất mang là một hướng mới trong<br /> công nghệ sản xuất enzyme. Đề tài được thực hiện nhằm mục đích đánh giá khả năng sản xuất<br /> enzyme protease từ tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis được cố định trong gel Alginate, đồng thời,<br /> khảo sát một số điều kiện tinh sạch và hoạt động của enzyme protease thu nhận được từ các tế<br /> bào được cố định. Kết quả của đề tài cho thấy nồng độ Alginate thích hợp với việc cố định tế bào<br /> B. subtilis là 2%, thời gian nuôi cấy tế bào vi khu n được cố đ ào vi sinh vật cố<br /> định sau 4 lần tái sử dụng, hoạt độ riêng enzyme protease giảm 50% hoạt tính. Enzyme protease<br /> thu nhận được có hoạt độ riêng cao nhất khi được tinh sạch bằng dung môi Acetone và điều kiện<br /> hoạt động t i ưu của enzyme protease là ở nhiệt độ 40oC và pH 7.<br /> Từ khóa: tế bào cố định; protease; Bacillus subtilis; Alginate.<br /> CHARACTERIZATION OF PROTEASE ACTIVITY FROM BACILLUS<br /> SUBTILIS CELLS IMMOBILIZED IN ALGINATE GEL<br /> ABSTRACT<br /> Enzyme from immobilized cells is the new approach for enzyme production technology.<br /> This paper aimed to evaluate the ability of enzyme production from Bacillus subtilis immobilized<br /> in alginate beads and determine optimum conditions for enzyme activity. The results showed that<br /> optimum concentration of alginate for immobilizing cells was 2% in 24h. Protease enzyme from<br /> immobilized cells reduce 50% specific activity after 4 batches. Enzyme protease, purified by<br /> acetone solvent show the highest activity. Optimum temperature and pH for enzyme activity is<br /> 40oC and pH 7.<br /> Keywords: immobilized cell, protease, bacillus subtilis, alginate.<br /> I. GIỚI THIỆU niger…(Lượng, 2004).<br /> Protease là một trong những enzyme có định tế bà<br /> nhiều ứng dụng rộng rãi phục vụ cho đời sống, đang đ<br /> trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dệt đi m trong vi c lên men sản xuất protease. Vì<br /> may, dược phẩm. Protease có thể thu nhận từ protease là một enzyme ngoại bào, nên có thể<br /> các nguồn: thực vật, động vật và vi sinh vật. được áp dụng trong việc cố định tế bào. Bằng<br /> Trong đó, vi sinh vật là nguồn cho protease cách cố định các tế bào vi khuẩn trong các chất<br /> phong phú nhất. Một số loài vi sinh vật có khả nền, protease được sinh tổng hợp trong môi<br /> năng tổng hợp protease như B. subtilis, B. trường nuôi cấy. Điều này làm cho quá trình<br /> cereus, Streptomyces griseus, Streptomyces sản xuất protease bằng các tế bào cố định ổn<br /> rimosus và Aspergillus oryzae, Aspergillus định hơn trong thời gian dài, dễ dàng tinh sạch<br /> <br /> *<br /> Trường Đại học Công nghiệp TPHCM<br /> <br /> <br /> 108<br />  Tạp chí Đại học Công nghiệp<br /> <br /> <br /> <br /> được enzyme nằm chủ yếu trong môi MgSO4.7H2O (1.15g), MnSO4.4H2O (0.28g),<br /> trường lỏng còn tế bào được giữ lại trong các được hòa tan trong 100mL nước cất.<br /> chất nền (Kumar và Takagi, 1999). Alginate Khảo sát khả năng sinh enzyme protease<br /> thường được sản xuất dưới dạng các dẫn xuất<br /> của muối tan như sodium alginate, potassium Chủng Bacillus subtilis được tăng sinh<br /> alginate. Khi các muối này được cho tiếp xúc trong môi trường lỏng có thành phần cao thịt<br /> với các ion kim loại đa hóa trị như Ca2+, Zn2+, (10g), peptone (10g), NaCl (5g), dung dịch A<br /> Pb2+… các ion kim loại đa hóa trị sẽ thay thế (5ml), sacharose (10g), thêm nước cất đủ<br /> các ion ban đầu trong phân tử alginate hình 1000ml. Chủng B. subtillis được nuôi cấy lắc<br /> thành liên kết ngang giữa các lớp trong cấu (120 vòng/phút) trong 24 giờ trong 100mL<br /> trúc mạng phân tử alginate và tạo thành cấu môi trường tăng sinh. Sau khi tăng sinh, chủng<br /> trúc gel. Trong ngành công nghệ thực phẩm, vi sinh vật được cấy điểm vào môi trường<br /> ion Ca2+ được sử dụng làm tác nhân tạo gel gelatin và ủ ở 37oC trong 48 giờ để đánh giá<br /> alginate vì hầu hết ion còn lại có thể ảnh khả năng sinh tổng hợp enzyme protease<br /> hưởng không tốt đến sức khoẻ của người sử (Clarke, 1953). Mỗi chủng được cấy ra ba đĩa,<br /> dụng và có khả năng gây độc cho vi khuẩn, và đo đường kính vòng phân giải trong từ đĩa<br /> nấm men (Nghĩa, 1996). để đánh giá khả năng sinh enzyme.<br /> <br /> B. subtilis có khả năng tiết enzyme Cố định vi sinh vật bằng gel Alginate<br /> protease trên môi trường nuôi cấy để phân giải 100mL dung dịch tăng sinh B. subtillis<br /> các chất dinh dưỡng có trong môi trường nhằm được nuôi cấy lắc trong 24 giờ, ly tâm 3000<br /> cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi, thu<br /> chất. Để phát hiện và đánh giá khả năng hoạt sinh khối. Sinh khối tế bào B. subtillis được<br /> hóa của enzyme protease được tiết bởi B. rửa lại bằng KCl vô trùng, nước cất vô trùng<br /> subtilis ta dùng môi trường gelatin nghèo chất (lặp lại ba lần) và huyền phù toàn bộ sinh khối<br /> dinh dưỡng để kích thích chúng sản sinh với 100mL nước muối sinh lý đã hấp khử<br /> protease. trùng (Adinarayana, Jyothi, và Ellaiah, 2005).<br /> Mục tiêu của bài báo này nhằm đánh giá Pha loãng 1mL dung dịch huyền phù tế<br /> khả năng sinh tổng hợp protease của chủng B. bào trong nước muối sinh lý vào 100mL môi<br /> subtillis tại phòng sinh hóa trên chất nền là gel trường thu nhận protease bổ sung Sodium<br /> alginate được cố dịnh bằng dung dịch CaCl2. Algiante ở nồng độ xác định. Toàn bộ hỗn hợp<br /> II. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP được tạo hạt bằng dung dịch CaCl2 0,25M. Hạt<br /> gel tạo thành được để ổn định trong dung dịch<br /> Vi sinh vật CaCl2 trong 1 giờ rồi rửa lại bằng nước muối<br /> Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được sinh lý và nước cất vô trùng (ba lần). Các hạt<br /> cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh Hóa, Viện gel tạo thành được nuôi cấy lỏng lắc (120<br /> Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường vòng/phút) sử dụng môi trường thu nhận<br /> Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí protease trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí<br /> Minh. Chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên nghiệm. Dịch tăng sinh thu nhận được sử dụng<br /> môi trường giữ giống có thành phần bao gồm cho các thí nghiệm sau.<br /> (trên 1L môi trường): cao thịt (10), peptone Khảo sát điều kiện nuôi cấy tế bào B.<br /> (10), NaCl (5), dung dịch A (5ml), sacharose subtillis cố định<br /> (10), agar (20), thêm nước cất cho đủ 1L.<br /> Thành phần dung dịch A bao gồm: Môi trường thu nhận protease (100mL)<br /> được bổ sung chất mang Sodium Alginate ở<br /> <br /> 109<br /> Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate<br /> <br /> <br /> <br /> các nồng độ khác nhau (1%, 2%, 3%, 4% và và lấy giá trị trung bình.<br /> 5%) được hấp khử trùng (121oC và 1atm) Khảo sát độ rò rỉ tế bào từ hạt gel<br /> trong 30 phút. Môi trường tiệt trùng được bổ<br /> sung huyền phù vi sinh vật và tạo hạt gel bằng Môi trường thu nhận protease (100mL)<br /> dung dịch CaCl2 0,25M. được bổ sung chất mang Sodium Alginate ở<br /> các nồng độ khác nhau (1%, 2%, 3%, 4% và<br /> 5%) được hấp khử trùng (121oC và 1atm)<br /> trong 30 phút. Môi trường tiệt trùng được bổ<br /> sung huyền phù vi sinh vật và tạo hạt gel bằng<br /> dung dịch CaCl2 0,25M.<br /> Các hạt tế bào B. subtillis cố định được<br /> nuôi cấy lỏng lắc (120 vòng/phút) trong 24h ở<br /> nhiệt độ phòng. Lọc bỏ hạt gel, thu lại dịch<br /> lọc, dịch lọc được lọc thêm một lần nữa bằng<br /> giấy lọc để loại bỏ thành phần gel Alginate bị<br /> vỡ trong quá trình nuôi cấy. Sinh khối trong<br /> dịch lọc được xác định bằng phương pháp sấy<br /> đến khối lượng không đổi (Adinarayana et al.,<br /> 2005).<br /> Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme<br /> protease của chủng B. subtillis cố định qua các<br /> mẻ nuôi cấy<br /> B. subtillis được cố định trong gel<br /> alginate 2%, các hạt gel được đưa vào bình<br /> môi trường thu nhận protease 100ml (mẻ 1),<br /> sau 24 giờ tiến hành chuyển hạt gel từ mẻ 1<br /> sang môi trường thu nhận mới (mẻ 2). Enzyme<br /> protease trong môi trường cũ được thu nhận và<br /> khảo sát hoạt tính protease và hàm lượng<br /> protein. Tiếp tục thực hiện cho các mẻ sau cho<br /> đến khi hoạt độ của mẻ cuối cùng bằng 50%<br /> hoạt độ của mẻ 1.<br /> Khảo sát điều kiện tinh sạch enzyme<br /> protease<br /> Hình 1. Chủng B. subtilis nuôi trên đĩa<br /> B. subtillis được cố định trong gel<br /> petri (trên) và được nhuộm gram (dưới).<br /> alginate 2%, các hạt gel được đưa vào bình<br /> Các hạt tế bào B. subtillis cố định được môi trường thu nhận protease 100ml và nuôi<br /> nuôi cấy lỏng lắc (120 vòng/phút) trong 24 giờ cấy trong 24 giờ. Dịch nuôi cấy được loại bỏ<br /> ở nhiệt độ phòng. Mẫu B. subtillis tự do cũng hạt gel và ly tâm để thu dịch chiết enzyme.<br /> được nuôi cấy ở mốc thời gian trên. Enzyme Dịch chiết enzyme được kết tủa bằng cồn 96o<br /> protease thu nhận được từ các thí nghiệm trên và Acetone ở 4oC theo các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3,<br /> được xác định hoạt độ dựa trên khả năng phân 1:4 (Vdịch chiết:Vdung môi), lắc đều và để lạnh<br /> giải casein. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần trong 60 phút; ly tâm 6000 vòng/phút trong 10<br /> <br /> 110<br />  Tạp chí Đại học Công nghiệp<br /> <br /> <br /> <br /> phút. Loại bỏ dịch nổi và thu nhận kết tủa, kết Brilliant Blue và đem đo mật độ quang ở bước<br /> tủa được huyền phù bằng nước cất vô trùng. song 595nm. Dựa vào đường chuẩn protein<br /> Dịch thu được là dịch enzyme thô được đánh (dung dịch Albumin chuẩn 0,1%) để xác định<br /> giá hoạt độ protease và hàm lượng protein. hàm lượng Albumin tương ứng với lượng<br /> Khảo sát điều kiện hoạt động của protein có trong dịch mẫu (Kruger, 1994). Các<br /> enzyme protease thí nghiệm được thực hiện ba lần và lấy giá trị<br /> hoạt độ trung bình.<br /> Enzyme thô thu nhận từ quá trình tăng<br /> sinh tế bào vi sinh vật cố định được khảo sát ở Xử lý số liệu thống kê<br /> các nhiệt độ (30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC) Các số liệu được xử lý theo phương pháp<br /> và pH (6, 7, 8, 9) để tìm điều kiện hoạt động phân tích phương sai ANOVA.<br /> tối ưu của enzyme này. III. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN<br /> Xác định hoạt độ enzyme protease theo Khả năng phân giải protein của chủng B.<br /> Anson subtillis<br /> Hoạt độ protease được xác định dựa trên Vòng phân giải gelatin nhằm định tính<br /> khả năng phân giải protein (casein) của khả năng phân giải protein của chủng<br /> protease. Dịch enzyme (1mL) được cho phản B.subtilis. Sau 48 giờ ủ và tiến hành thử bằng<br /> ứng với 5mL dung dịch casein 1% trong thời thuốc thử HgCl2 thu được đường kính trung<br /> gian 30 phút ở nhiệt độ 35oC. Sau 30 phút, bình của vòng phân giải là 3cm. Từ kết quả<br /> ngừng phản ứng enzyme bằng 10mL dung này cho thấy chủng B. subtilis của chúng tôi có<br /> dịch TCA 5% và đem lọc thu dịch. Dịch lọc khả năng phân giải protein gelatin trên môi<br /> thu được (2mL) được bổ sung 0,5mL thuốc trường bán rắn. Vòng phân giải có đường kính<br /> thử Folin và đem đo mật độ quang ở bước trung bình khoảng 3cm, trong khi khuẩn lạc<br /> sóng 720nm. Dựa vào đường chuẩn tyrosine chỉ nằm ngay giữa đĩa petri, điều này cho thấy<br /> (dung dịch tyrosine chuẩn 20mM) để xác định chủng B. subtilis cần một cơ chế để có thể sử<br /> lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm dụng gelatin ở môi trường ngoại bào, một<br /> được thủy phân dưới tác dụng của enzyme. trong các cơ chế đó chính là khả năng tiết ra<br /> Hoạt độ của enzyme được biểu diễn bằng đơn các enzyme ngoại bào đặc trưng của chủng B.<br /> vị hoạt độ enzyme protease. Một đơn vị hoạt subtilis trong đó có enzyme protease.<br /> độ enzyme protease là lượng enzyme trong Như vậy qua các vòng phân giải trên<br /> một phút ở 300C có khả năng phân giải protein môi trường gelatine có thể xác nhận khả năng<br /> tạo thành sản phẩm hòa tan trong acid<br /> sinh tổng hợp protease của chủng B. subtillis.<br /> tricloacetic, có độ hấp thụ quang ở bước sóng<br /> 720nm tương đương với 1µmol tyrosine<br /> (Cupp-Enyard, 2008). Các thí nghiệm được<br /> thực hiện ba lần và tính giá trị trung bình.<br /> Xác định hàm lượng protein theo<br /> Bradford<br /> Hàm lượng protein trong mẫu được xác<br /> định bằng phương pháp Bradford dựa trên sự<br /> thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc<br /> nhuộm Comassie Brilliant Blue khi tạo phức<br /> hợp với protein. Dịch mẫu (1mL) được bổ Hình 2. Vòng phân giải gelatin của<br /> sung thêm 5mL thuốc nhuộm Comassie chủng Bacillus subtilis.<br /> <br /> 111<br /> Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate<br /> <br /> <br /> <br /> Khảo sát điều kiện nuôi cấy tế bào B.<br /> subtillis cố định<br /> Để đánh giá độ ổn định của hạt gel<br /> alginate, tế bào vi khuẩn B. subtillis được cố<br /> định ở các nồng độ alginate khác nhau (1, 2, 3,<br /> 4 và 5%) và nuôi cấy trong môi trường cảm<br /> ứng sinh enzyme protease trong 24 giờ. Khối<br /> lượng sinh khối khô và hoạt độ riêng của<br /> enzyme protease ở các khoảng thời gian khác<br /> nhau. Kết quả ở Hình 3 cho thấy nồng độ<br /> alginate sử dụng cho việc cố định tế bào vi<br /> khuẩn có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh Hình 3. Hoạt độ riêng protease (UI/mg)<br /> tổng hợp enzyme protease và mức độ rò rỉ của của enzyme protease theo nồng độ Alginate và<br /> tế bào ra môi trường. Từ các dữ liệu cho thấy mức độ rò rỉ tế bào ở 24h.<br /> protease thu nhận từ chủng B. subtillis cố định<br /> Kết quả này là phù hợp so với một số<br /> có hoạt độ cao nhất ở nồng độ Alginate 2%<br /> nghiên cứu trước đây, (Zoe và cộng sự ,2006)<br /> sau 24 giờ nuôi trong môi trường sinh tổng<br /> đã sử dụng alginate nồng độ từ 2% đến 3,5%<br /> hợp protease đạt (27.458 UI/mg) và giảm dần<br /> để cố định B. subtillis sinh tổng hợp amylase<br /> ở các nồng độ alginate khác (3%, 4% và 5%).<br /> cao gấp 2,5 lần amylase thu nhận từ các chủng<br /> Điều này cho thấy khi tăng dần nồng độ<br /> tự do (Konsoula và Liakopoulou-Kyriakides,<br /> alginate sẽ làm giảm cấu trúc xốp của hạt gel,<br /> 2006). Đồng thời, nghiên cứu của Adinarayana<br /> từ đó giới hạn khả năng cung cấp dinh dưỡng<br /> và cộng sự (2004) cũng thu nhận được kết quả<br /> và khả năng khuếch tán của oxy từ môi trường<br /> tương từ nhưng ở nồng độ alginate tối ưu thu<br /> tới tế bào vi sinh vật. Như vậy nồng độ 2% của<br /> nhận được là 3% (Adinarayana, Bapi Raju và<br /> Alginate là tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp<br /> Ellaiah, 2004).<br /> protease của chủng B. subtillis cố định.<br /> Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme<br /> Mức độ rò rỉ tế bào từ hạt gel Alginate<br /> protease của chủng B. subtillis cố định qua các<br /> được thể hiện trong Hình 3, độ rò rỉ tế bào sẽ<br /> mẻ nuôi cấy<br /> giảm dần khi ta tăng dần nồng độ alginate từ<br /> 1% lên 5%. B. subtillis được cố định trong gel Chủng B. subtillis cố định được nuôi cấy<br /> Alginate không hoàn toàn nằm sâu bên trong thu nhận enzyme protease theo mẻ (24 giờ cho<br /> hạt mà sẽ có một lượng tế bào nằm gần lớp vỏ mỗi mẻ) ở nồng độ alginate tối ưu. Kết quả thu<br /> alginate có cấu trúc lỗ xốp, vì vậy lượng B. nhận được cho thấy hoạt độ riêng của enzyme<br /> subtilis nằm gần bên ngoài sẽ có khả năng protease thu nhận được giảm dần theo từng<br /> thoát ra khỏi hạt gel. Vì vậy, khi nồng độ mẻ, và đến mẻ thứ 4, hoạt độ riêng (11,359<br /> alginate càng thấp thì số lượng tế bào thoát ra UI/mg) chỉ đạt 50% so với hoạt độ ở mẻ ban<br /> ngoài sẽ càng nhiều do nồng độ alginate càng đầu (25,331 UI/g). Tuy nhiên khi so sánh hàm<br /> thấp thì sẽ làm cấu trúc của alginate càng lỏng lượng protein qua từng mẻ nhận thấy hàm<br /> lẻo và cấu trúc lỗ xốp càng lớn. lượng protein giảm ít và ổn định qua từng mẻ<br /> Hình 4.<br /> Sở dĩ hoạt tính, hàm lượng và hoạt độ<br /> riêng đều giảm dần qua các mẻ có thể là do<br /> chủng B. subtilis qua mỗi mẻ sẽ yếu dần làm<br /> <br /> <br /> 112<br />  Tạp chí Đại học Công nghiệp<br /> <br /> <br /> <br /> giảm khả năng phân giải các chất dinh dưỡng 30% so với enzyme thô). Nguyên nhân của kết<br /> và sinh tổng hợp enzym protease nên kết quả quả trên có thể là do acetone có khả năng<br /> giảm dần. tương tác với nước bằng phản ứng dehydrat<br /> hóa, làm giảm lượng nước liên kết với các<br /> Như vậy, khi sử dụng tế bào vi sinh vật<br /> phân tử protein. Trong khi đó ethanol là dung<br /> đã được cố định bằng hạt gel Aginate qua 4<br /> môi có khả năng dehydrat hóa protein mạnh<br /> lần nuôi cấy mẻ thì hoạt độ riêng của enzyme<br /> hơn acetone. Điều này làm cho nó dễ dàng gây<br /> giảm còn 50% so với lần đầu tiên, đây chính là<br /> biến tính protein, kể cả những protein không<br /> hướng ứng dụng mang lại ưu điểm vượt trội so<br /> phải là protease. Việc làm biến tính protease<br /> của enzyme do tế bào cố định tao thành so với<br /> và những protein tạp khác không phải là<br /> enzyme tự do.<br /> protease dẫn đến hàm lượng protein cao nhưng<br /> hoạt tính lại thấp, kết quả là hoạt độ riêng và<br /> hiệu suất thu hồi hoạt tính cũng thấp (Hình 5).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Sự biến thiên hàm lượng, hoạt<br /> độ riêng của enzyme protease ở các mẻ khi<br /> nuôi tế bào cố định.<br /> Khảo sát điều kiện tinh sạch enzyme Hình 5. Hoạt độ riêng của enzyme<br /> protease protease ở các điều kiện tinh sạch khác nhau.<br /> Enzyme protease thu nhận được tinh Khảo sát điều kiện hoạt động của<br /> sạch thành enzyme bán tinh khiết bằng dung enzyme protease<br /> môi hữu cơ (cồn 96o và acetone) ở các tỷ lệ<br /> khác nhau. Kết quả thu nhận được thể hiện ở Từ kết quả và đồ thị cho thấy protease<br /> Hình 5 cho thấy hoạt độ riêng của các enzyme của B.subtilis hoạt động mạnh nhất ở 40oC.<br /> bán tinh khiết ở từng phương pháp tinh sạch Vượt quá nhiệt độ này, hoạt tính enzyme sẽ<br /> đều cao hơn so với hoạt độ riêng của enzyme giảm dần từ 50oC đến 70oC, đặc biệt là ở<br /> protease thô ban đầu. khoảng từ nhiệt độ 60oC đến 70oC, hoạt tính<br /> giảm mạnh. Nguyên nhân có thể là do ở nhiệt<br /> Kết quả cho thấy acetone có khả năng độ 40oC. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích của<br /> tinh sạch enzyme protease tốt hơn so với cồn enzyme protease, nó giúp thúc đẩy enzyme<br /> tuyệt đối ở các tỷ lệ thay đổi từ 1:1 đến 1:4, hoạt động, làm tăng tốc độ phản ứng của<br /> khi tinh sạch bằng acetone ở tỷ lệ 1:2 thì thu enzyme - cơ chất, vì vậy tại nhiệt độ này<br /> được enzyme bán tinh khiết có hoạt độ cao protease cho hoạt tính cao nhất. Từ nhiệt độ<br /> nhất (196.042 UI/mg) tăng 52% so với enzyme 40oC trở lên, hoạt tính protease giảm dần là do<br /> thô. Trong khi đó, khi tinh sạch bằng cồn tuyệt khi vượt quá khoảng nhiệt độ tối thích (40oC),<br /> đối, hoạt độ enzyme bán tinh khiết cao nhất enzyme sẽ dần bị biến tính và mất hoạt tính<br /> thu nhận được ở tỷ lệ 1:3 (136.498 UI/mg tăng phân giải. Đồng thời, khi nhiệt độ càng tăng<br /> <br /> 113<br /> Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate<br /> <br /> <br /> <br /> cao thì sự biến tính enzyme sẽ càng tăng làm Hình 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH<br /> cho hoạt tính enzyme protease càng giảm thấp lên hoạt độ riêng của enzyme protease.<br /> và không có khả năng phục hồi hoạt tính. Do Kết quả trên có thể giải thích như sau:<br /> đó, hoạt tính protease giảm dần từ 40oC xuống pH 7 cho hoạt tính protease cao nhất là do đây<br /> 70oC. Ở nhiệt độ 30oC, protease cho hoạt tính là khoảng pH phù hợp, giúp tăng khả năng<br /> thấp là do nhiệt độ này chưa đạt đến khoảng hoạt động của các nhóm chức ở trung tâm hoạt<br /> nhiệt độ tối thích để thúc đẩy sự hoạt động của động của protease. Ở pH 6 protease có hoạt<br /> enzyme, enzyme còn bị ức chế một phần nên tính thấp có thể do đây là điểm pH gần điểm<br /> hoạt tính của protease tại nhiệt độ này còn đẳng điện của protease vì phần lớn enzyme -<br /> thấp. protein có điểm đẳng điện ở khoảng acid nên<br /> Từ kết quả và biểu đồ cho thấy pH 7 là enzyme có xu hướng bị kết tủa và biến tính do<br /> pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme pH đẳng điện làm giảm khả năng hòa tan của<br /> protease ở chủng B.subtilis cố định. Còn ở các enzyme, điều này làm cho hoạt tính protease<br /> mốc pH còn lại thì tại pH 6 cho hoạt tính tại pH 6 rất thấp. Ở khoảng pH từ 8 – 9,<br /> enzyme thấp nhất, tại pH 8 và pH 9 thì hoạt protease cũng cho hoạt tính giảm dần. Điều<br /> tính enzyme giảm dần, nhưng vẫn cao hơn so này có giải thích là do tại pH kiềm độ phân ly<br /> với pH 6. của các nhóm chức hoạt động của protease bị<br /> hạn chế và phần nào ảnh hưởng đến hoạt tính<br /> phân giải cơ chất của protease.<br /> IV. KẾT LUẬN<br /> Đề tài đã cho thấy khả sử dụng tế bào vi<br /> khuẩn B. subtilis cố định để thu nhận enzyme<br /> protease ở nồng độ algiante thích hợp là 2%.<br /> Trong thời gian nuôi cấy 24 giờ, các tế bào B.<br /> subtilis cố định cho protease có hoạt độ riêng<br /> cao nhất là 24 giờ, còn ở B. subtilis tự do là 48<br /> giờ. Sau 4 lần tái sử dụng, hoạt độ enzyme do<br /> tế bào B. subtilis cố định giảm 50% so với ban<br /> đầu, điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc<br /> sử dụng tế bào vi sinh vật cố định trong thực<br /> tế. Đồng thời enzyme protease của chủng cố<br /> định có hoạt độ riêng cao hơn so với chủng tự<br /> do, từ đó có thể thấy enzyme protease từ<br /> chủng cố định tinh sạch hơn so với chủng tự<br /> do. Tác nhân kết tủa tốt nhất để thu protease là<br /> acetone ở tỉ lệ thể tích dịch chiết enzyme: thể<br /> tích acetone là 1:2. Nhiệt độ thích hợp để<br /> protease cho hoạt tính cao nhất là 40oC và pH<br /> thích hợp là pH 7.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 114<br />  Tạp chí Đại học Công nghiệp<br /> <br /> <br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Adinarayana, K., Bapi Raju, K. V. V. S. N., & Ellaiah, P. (2004), "Investigations on<br /> alkaline protease production with B. subtilis PE-11 immobilized in calcium alginate gel<br /> beads", Process Biochemistry, 39(11), 1331-1339. doi: 10.1016/s0032-9592(03)00263-2<br /> 2. Adinarayana, K., Jyothi, B., & Ellaiah, P. (2005), "Production of alkaline protease with<br /> immobilized cells of Bacillus subtilis PE-11 in various matrices by entrapment technique",<br /> AAPS PharmSciTech, 6(3), E391-397. doi: 10.1208/pt060348<br /> 3. Clarke, S. K. (1953), "A simplified plate method for detecting gelatine-liquefying<br /> bacteria", J Clin Pathol, 6(3), 246 - 248.<br /> 4. Cupp-Enyard, C. (2008). Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a<br /> Substrate, J Vis Exp(19). doi: 10.3791/899<br /> 5. Konsoula, Z., & Liakopoulou-Kyriakides, M. (2006), "Thermostable α-amylase<br /> production by Bacillus subtilis entrapped in calcium alginate gel capsules", Enzyme and<br /> Microbial Technology, 39(4), 690-696. doi: 10.1016/j.enzmictec.2005.12.002<br /> 6. Kruger, N. (1994), "The Bradford Method for Protein Quantitation, In J. Walker (Ed.)",<br /> Basic Protein and Peptide Protocols (Vol. 32, pp. 9-15): Humana Press.<br /> 7. Kumar, C. G., & Takagi, H. (1999), "Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial<br /> viewpoint", Biotechnol Adv, 17(7), 561-594.<br /> 8. Lượng, N. Đ. (2004), Công nghệ Enzyme Việt Nam, NXB Giáo dục.<br /> 9. Nghĩa, N. Đ. (1996), Nghiên cứu cấu trúc và tính chất tạo gel của acid alginic tách ciết từ<br /> một số loài rong mơ Việt Nam, Paper presented at the Hội nghị hóa học Đại học Bách khoa<br /> Hà Nội, Đại học Bách khoa Hà Nội.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 115<br />