Khảo sát mức độ nhạy cảm của candida spp. với fluconazole

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHẠY CẢM CỦA CANDIDA SPP.<br /> VỚI FLUCONAZOLE<br /> Nguyễn Thị Thúy Anh*, Trần Cát Đông**, Nguyễn Đinh Nga**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Việc sử dụng thường xuyên fluconazole trong điều trị là nguyên nhân gây ra sự kháng thuốc ở<br /> Candida albicans và Candida non albicans.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát mức độ nhạy của Candida spp. phân lập từ bệnh nhân nhiễm nấm tại 5<br /> Bệnh viện ở TP. HCM. với fluconazole. Định danh các chủng Candida kháng fluconazole bằng PCR.<br /> Vật liệu và phương pháp: Mức độ nhạy của 129 chủng Candida với fluconazole được thực hiện bằng<br /> phương pháp khuếch tán theo NCCLS M44-A. Định danh các chủng Candida non albicans bằng giải trình tự<br /> vùng ITS.<br /> Kết quả: 93.64% chủng Candida albicans trong thử nghiệm nhạy với fluconazole. 5/19 chủng Candida non<br /> albicans kháng fluconazole có trình tự ITS tương đồng với trình tự ITS loài Candida glabrata và Candida<br /> tropcalis.<br /> Bàn luận và kết luận: Tỷ lệ Candida non albicans kháng fluconazole cao hơn C. albicans. Vì vậy cần sử<br /> dụng môi trường thích hợp để định danh Candida hoặc thực hiện kháng sinh đồ để chọn thuốc kháng nấm thích<br /> hợp.<br /> Từ khóa: Candida albicans, Candida non albicans, fluconazole, MHA – GMB,PCR<br /> <br /> ABSTRACT<br /> SURVEY ON SUSCEPTIBILITY OF CANDIDA SPP. TO FLUCONAZOLE<br /> Nguyen Thi Thuy Anh, Tran Cat Dong, Nguyen Đinh Nga<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 - 2012: 83 - 85<br /> Background: Over the past few decades, Candida spp. are the most common of fungal pathogens and the<br /> emergence of drug resistant Candida spp. become an important problem in therapy.<br /> Objective: to determine the antifungal susceptibility of Candida isolates to fluconazole.<br /> Material and methods: The antifungal activity against 129 trains of Candida spp. of fluconazole were<br /> determined by the Disk diffusion method according to the guidline of NCCLS M44-A. The PCR amplification of<br /> the internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) is used for species identification.<br /> Outcome: 93,64% of Candida albicans were sensible to fluconazole. 5/19 resistant strains are identified<br /> belong to Candida glabrata and Candida tropicalis.<br /> Conclusion: Disk diffusion test are simple to set up to propose a reasonable antifungal agent for physicians<br /> Key words: Candida albicans, Candida non albicans, MIC, MHA-GMB, MHB-GMB.<br /> chóng từ đầu thập niên 1990 đến nay, đặc biệt ở<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> người suy giảm miễn dịch. Một số báo cáo<br /> Bệnh do Candida gây ra gia tăng nhanh<br /> ngoài nước cảnh báo việc sử dụng fluconazole<br /> <br /> <br /> Trường Đại học Khoa học tự nhiên  Đại học Y Dược TP. HCM<br /> Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Đinh Nga<br /> ĐT: 0908 836969 Email: nganguyendinh@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Ký Sinh Trùng<br /> <br /> 83<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> <br /> thường xuyên trong điều trị, cộng với tỉ lệ bệnh<br /> do Candida non albicans đang có khuynh hướng<br /> tăng dần(1,6) có thể là nguyên nhân làm kéo dài<br /> thời gian hoặc thất bại trong điều trị bệnh do<br /> Candida. Để tìm hiểu mức độ đáp ứng của<br /> Candida phân lập từ một số bệnh nhân Việt Nam<br /> với fluconazole, trong phạm vi đề tài chúng tôi<br /> khảo sát mức độ nhạy của Candida spp. với<br /> fluconazole in vitro.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> 129 chủng Candida spp. phân lập từ bệnh<br /> nhân nhiễm Candida ở 5 bệnh viện tại TP. Hồ<br /> Chí Minh từ tháng 5 đến tháng 8 năm 2011.<br /> Candida albicans ATCC 10231, được sử dụng làm<br /> chủng đối chứng, nhạy với fluconazole với<br /> đường kính vòng kháng nấm từ 38-40 mm<br /> <br /> Chất kháng nấm<br /> Fluconazole USP, lô FLU-09 12 085, hàm<br /> lượng 99,41%.<br /> Môi trường<br /> Mueller Hinton Broth (Merck) và CzapeckDox ((Merck).<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Để xác định mức độ nhạy của Candida spp.<br /> với fluconazolee<br /> Chúng tôi sử phương pháp khuếch tán theo<br /> hướng dẫn của NCCLS M44-A(2, 4) với các điều<br /> kiện thử nghiệm như sau: Đĩa giấy tẩm<br /> fluconazole 25 µg, thạch Mueller Hinton bổ<br /> sung 2% glucose và xanh methylen 5 µg/ml<br /> (MHA-GMB). Đo đường kính vòng ức chế sau<br /> 24 giờ ủ ở 370C.<br /> Dựa vào đường kính vòng ức chế, mức độ<br /> nhạy của Candida spp với fluconazole được<br /> NCCLS M44 chia thành 3 mức, nhạy (S) khi<br /> đường kính vòng ức chế ≥ 19 mm; nhạy tùy<br /> thuộc liều (SDD) khi đường kính vòng ức chế từ<br /> 15-18 mm và đề kháng (R) với đường kính vòng<br /> ức chế ≤ 14 mm.<br /> <br /> 84<br /> <br /> Định danh Candida spp.<br /> Phân nhóm Candida albicans và Candida<br /> non albicans: Dựa vào các đặc điểm sợi nấm giả<br /> - bào tử bao dầy trên môi trường thạch bột ngô<br /> và sự tạo ống mầm trong huyết thanh sau 3-4<br /> giờ ủ ở 37 oC(5)<br /> Đinh danh Candida non albicans đến mức<br /> loài bằng PCR(3): Sử dụng cặp mồi ITS1 (5’ TCC<br /> GTA GGT GAA CGT GCG G 3’) và ITS4 (5' TCC<br /> TCC GCT TAT TGA TAT GC 3'). Phản ứng PCR<br /> được thực hiện trong ống eppendorf 0.2 ml với<br /> thể tích hỗn hợp là 50 l có thành phần phản<br /> ứng như sau: 1 M mỗi mồi, 0,5 mM dNTP, 2<br /> mM MgSO4 ,1X buffer và 1U Taq Polymerase.<br /> Tiền biến tính DNA trong 950C, 10 phút, 1 chu<br /> kỳ. Chu kỳ khuếch đại gồm 30 chu kỳ: biến tính<br /> 950C, 45 giây, gắn mồi 500C, 45 giây, kéo dài<br /> 720C, 2 phút, hoàn chỉnh 720C, 10 phút, 1 chu kỳ.<br /> Sản phẩm tinh sạch ADN được đem gửi đi giải<br /> trình tự tại công ty Macrogen, Hàn Quốc. Kết<br /> quả giải trình tự được nhận biết bằng bộ phần<br /> mềm Lasergene 7.1 và công cụ BLAST (NCBI).<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Phân nhóm Candida spp.<br /> Trong 129 chủng Candida spp. ly trích từ<br /> bệnh nhân, 110/129 chủng thuộc Candida albicans<br /> và 19/129 chủng thuộc Candida non albicans.<br /> <br /> Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với<br /> fluconazole<br /> Kết quả ở bảng 1 cho thấy chỉ có ba chủng C.<br /> albicans được phân lập từ bệnh nhân nhiễm HIV<br /> và một chủng C. albicans từ bệnh nhân lao ở<br /> bệnh viện Phạm Ngọc Thạch kháng fluconazole,<br /> chiếm 3,64%.<br /> Nếu chỉ tính trên số ca phân lập từ phết<br /> họng của bệnh nhân HIV ở bệnh viện Nhiệt Đới,<br /> có 11.43% trường hợp C. albicans kém nhạy với<br /> fluconazole. Tỉ lệ này thấp hơn 1/2 so với báo<br /> cáo của Trần Phủ Mạnh Siêu (26,67%)(6).<br /> <br /> Chuyên Đề Ký Sinh Trùng<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> (93,64%) (2,73%) (3,64%) (73,68 (26,32%)<br /> %)<br /> <br /> Bảng 1. Mức độ nhạy của Candida spp. với<br /> fluconazole<br /> Số chủng Candida spp. đáp ứng với tác<br /> động của fluconazole<br /> Nguồn phân<br /> C. non albicans<br /> lập<br /> C. albicans (n = 110)<br /> (n=19)<br /> S<br /> SDD<br /> R<br /> S<br /> R<br /> Bệnh viện Q4<br /> 15<br /> 0<br /> 0<br /> 0<br /> 0<br /> (n=15)<br /> BV. Nhiệt Đới<br /> 31<br /> 1<br /> 3<br /> 14<br /> 3<br /> (n=52)<br /> BV Phạm<br /> Ngọc Thạch<br /> 23<br /> 0<br /> 1<br /> 0<br /> 2<br /> (n=26)<br /> BV. Pháp Việt<br /> 28<br /> 2<br /> 0<br /> 0<br /> 0<br /> (n=30)<br /> Bệnh viện X<br /> 7<br /> 0<br /> 0<br /> 0<br /> 0<br /> (n=7)<br /> Tổng cộng<br /> 104<br /> 3<br /> 4<br /> 14<br /> 5<br /> <br /> Tỉ lệ Candida non albicans kém nhạy và kháng<br /> fluconazole cao hơn C. albicans. Theo Trần Phủ<br /> Mạnh Siêu(6), trong 8 chủng C. tropicalis phân lập<br /> từ phết họng và phết lưỡi bệnh nhân HIV ở<br /> bệnh viện Nhiệt Đới, 25% chủng kháng<br /> fluconazole. Ở nghiên cứu của chúng tôi, các<br /> chủng kháng fluconazole chiếm khoảng 26,32%.<br /> <br /> Định danh các chủng Candida non albicans<br /> bằng giải trình tự vùng ITS<br /> Năm chủng Candida non albicans kháng<br /> fluconazole gồm PNT20, PNT31, PNT33, ND31,<br /> ND32 được để giải trình tự vùng ITS. Vì vùng<br /> ITS kích thước ngắn nên chúng tôi chỉ dùng một<br /> phản ứng với một mồi tương ứng cho mỗi mẫu.<br /> <br /> Bảng 2. Kết quả định danh của 7 chủng Candida non albicans<br /> Chủng<br /> ND31<br /> <br /> Description<br /> <br /> Max score<br /> 1282<br /> <br /> Total score<br /> 1282<br /> <br /> Querry coverage<br /> 100%<br /> <br /> E value<br /> 0.0<br /> <br /> Max ident<br /> 99%<br /> <br /> C. glabrata<br /> <br /> ND32<br /> <br /> C. glabrata<br /> <br /> 1079<br /> <br /> 1079<br /> <br /> 100%<br /> <br /> 0.0<br /> <br /> 99%<br /> <br /> PNT20<br /> <br /> C. tropicalis<br /> <br /> 693<br /> <br /> 693<br /> <br /> 100%<br /> <br /> 0.0<br /> <br /> 98%<br /> <br /> PNT31<br /> <br /> C. tropicalis<br /> <br /> 800<br /> <br /> 800<br /> <br /> 97%<br /> <br /> 0.0<br /> <br /> 98%<br /> <br /> PNT33<br /> <br /> C. tropicalis<br /> <br /> 728<br /> <br /> 728<br /> <br /> 100%<br /> <br /> 0.0<br /> <br /> 99%<br /> <br /> Dựa trên Query coverage, Max ident cao<br /> nhất và E value thấp nhất theo kết quả bảng 3:<br /> Hai chủng ND31, ND32 có sự gần đồng nhất về<br /> trình tự ITS với Candida glabrata. Ba chủng PNT<br /> 20, PNT 31, PNT 33 có sự gần đồng nhất về trình<br /> tự ITS với C. tropcalis.<br /> Candida glabrata và Candida tropcalis là những<br /> loài thường gây bệnh ở người suy giảm miễn<br /> dịch, gây khó khăn cho việc điều trị. Do vậy, để<br /> điều trị cho đối tượng bệnh nhân này, cần sử<br /> dụng môi trường thích hợp để định danh<br /> Candida hoặc thực hiện kháng sinh đồ để chọn<br /> thuốc kháng nấm thích hợp.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> 6.<br /> <br /> Infect. Dis., 58: 344-348<br /> Ernst EJ ( 2007). Methods in Molecular medicine. In: Ernst EJ và<br /> Rogers PD. Antifungal agent - methods and protocols, Vol.188, pp<br /> 3-12. Humana Press Inc, Totowa, NJ<br /> Korabecna M (2007). The Variability in the Fungal Ribosomal<br /> DNA (ITS1, ITS2 and 5.8S rRNA Gene): its Biological Meaning<br /> and Application in Medical Mycology. Communicating Current<br /> Research and Educational Topics and Trends in Applied<br /> Microbiology A. Méndez – Villas (Ed)<br /> NCCLS (2004). Method for antifungal disk diffusion susceptibility<br /> testing of yeasts; approved guideline. NCCLS document M44-A,<br /> NCCLS, Wayne, PA, 19087-1898<br /> Pfaller MA, McGinnis MR (2003). The laboratory and clinical<br /> mycology. In: Anaissie EJ, McGinnis MR. & Pfaller M.A. Clinical<br /> Mycology, p 55-74. Churchill Livingstone<br /> Trần Phủ Mạnh Siêu, Hồ Quang Thắng (2010). Tình hình nhiễm<br /> vi nấm Candida spp. trên các bệnh nhân nhập viện tại Bệnh viện<br /> Nhiệt Đới TP. HCM năm 2009. Tạp chí Y học, phụ bản số 1, tập<br /> 14, tr 206-212<br /> <br /> Capoor MR et al (2005). Emergence of Non-albicans Candida<br /> Species and antifungal resistance in a tertiary care hospital. Jpn. J.<br /> <br /> Chuyên Đề Ký Sinh Trùng<br /> <br /> 85<br /> <br />