Khảo sát mức độ nhạy cảm của candida spp. với fluconazol và ketoconazol

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHẠY CẢM CỦA CANDIDA SPP.<br /> VỚI FLUCONAZOL VÀ KETOCONAZOL<br /> Nguyễn Thị Thúy Anh**, Nguyễn Vũ Giang Bắc*, Nguyễn Đinh Nga*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Việc sử dụng thường xuyên một số kháng sinh kháng nấm trong điều trị là nguyên nhân gây<br /> ra sự kháng thuốc ở Candida albicans là vi nấm chiếm tỉ lệ cao trong các ca nhiễm nấm. Ngoài ra, theo một số báo<br /> cáo gần đây tỉ lệ Candida non albicans gây bệnh ngày càng tăng.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát mức độ nhạy của các chủng Candida gây bệnh ở niêm mạc miệng và âm<br /> đạo với ketoconazol và fluconazol.<br /> Vật liệu và phương pháp: sử dụng phương pháp khuếch tán theo hướng dẫn của NCCLS M44-A và<br /> phương pháp pha loãng theo hướng dẫn của NCCLS M27-A2 nhưng sử dụng môi trường Mueller Hinton bổ<br /> sung glucose và xanh methylen (MHB-GMB) trong thí nghiệm để xác định mức độ nhạy của 30 chủng Candida<br /> albicans và 36 chủng Candida non albicans với ketoconazol và fluconazol.<br /> Kết quả: Kết quả nhận được từ cả hai phương pháp đều cho thấy tỉ lệ kháng thuốc của các chủng Candida<br /> chưa cao. Phương pháp pha loãng sử dụng môi trường Mueller Hinton bổ sung xanh methylen giúp đánh giá<br /> được các chủng nhạy tùy thuộc liều với MIC cao hơn mức nhạy.<br /> Kết luận: Để sử dụng liều điều trị bệnh Candida thích hợp cần xác định MIC để phát hiện các chủng nhạy<br /> tùy thuộc liều.<br /> Từ khóa: Candida albicans, Candida non albicans, MIC, MHA-GMB, MHB-GMB.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON THE ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY OF CANDIDA SPP.<br /> TO FLUCONAZOLE AND KETOCONAZOL.<br /> Nguyen Thi Thuy Anh, Nguyen Dinh Nga, Nguyen Vu Giang Bac<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 450 - 454<br /> Background: Over the past few decades, Candida spp. are the most common of fungal pathogens and the<br /> emergence of drug resistant Candida spp. become an important problem in therapy.<br /> Objective: To determine the antifungal susceptibility of Candida isolates to ketoconazole and fluconazole.<br /> Material and methods: The antifungal activity against 66 trains of Candida spp. of ketoconazole and<br /> fluconazole were determine by the Disk diffusion method and the dilution method according to the guidline of<br /> NCCLS M44-A and M27-A2.<br /> Outcome: MIC values and the inhibited zone sizes address that Candida spp. were sensible to fluconazole<br /> and ketoconazole in high ratio.<br /> Conclusion: Disk diffusion test are easy to set up and provide an screening test. However, it is better to<br /> confirm by dilution method. Results outcome in the dilution method used MHB-BMB was agree to which of disk<br /> diffusion method.<br /> Key words: Candida albicans, Candida non albicans, MIC, MHA-GMB, MHB-GMB.<br /> *Đại học Y Dược TP. HCM, Khoa Dược **Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP. HCM<br /> Tác giả liên hệ: PGS. TS. Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908 83 69 69 Email: nganguyendinh@yahoo.com<br /> <br /> 450<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bệnh do vi nấm gây ra gia tăng nhanh chóng<br /> bắt đầu từ thập niên 1990 đến nay, đặc biệt ở<br /> người suy giảm miễn dịch. Candida spp. là vi<br /> nấm gây bệnh thường gặp nhất, với Candida<br /> albicans chiếm tỉ lệ cao trên 80%, tuy nhiên các<br /> báo cáo gần đây cho thấy các bệnh nhiễm nấm<br /> với Candida non albicans chiếm tỉ lệ tăng dần(2,6).<br /> Amphophtericin B, fluconazol, itraconazol và<br /> ketoconazol là những thuốc thường dùng điều<br /> trị bệnh do Candida spp., ngoài ra còn có các<br /> thuốc mới, ít độc tính hơn, như amphophtericin<br /> B cấu trúc lipid, voriconazol, caspofungins,<br /> micafungins nhưng giá thành cao và chưa phổ<br /> biến ở Việt Nam. Vì vậy ketoconazol,<br /> itraconazol, nhất là fluconazol được các bác sĩ<br /> lâm sàng lựa chọn nhiều. Do các thuốc kháng<br /> nấm nhóm azole kể trên được sử dụng thường<br /> xuyên trong điều trị, Candida spp. trở nên đề<br /> kháng với các azole và đây là nguyên nhân làm<br /> kéo dài thời gian điều trị hoặc thất bại trong<br /> điều trị các bệnh nhiễm do Candida. Trong phạm<br /> vi đề tài chúng tôi khảo sát mức độ nhạy cảm<br /> của Candida spp. với ketoconazol và fluconazol<br /> là 2 trong 3 thuốc thường được lựa chọn trong<br /> điều trị ở Việt Nam.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> 66 chủng Candida spp. phân lập từ bệnh<br /> nhân nhiễm Candida niêm mạc miệng và âm đạo<br /> từ 2008 đến 2009. Dựa vào các đặc điểm nuôi<br /> cấy trên môi trường Sabouraud, thạch bột ngô,<br /> Czapek – Dox bổ sung 1% Tween 80 và huyết<br /> thanh đã xác định 30 chủng thuộc Candida<br /> albicans và 36 chủng thuộc Candida non albicans.<br /> Candida albicans 10231 được sử dụng làm<br /> chủng đối chứng. Mức độ nhạy với fluconazol<br /> của Candida albicans 10231 xác định bằng<br /> phương pháp khuếch tán, môi trường MHAGMB theo hướng dẫn của NCCLS M44-A cho<br /> đường kính vòng ức chế từ 43-45 mm. MIC = 2<br /> μg/ml khi xác định bằng phương pháp pha<br /> loãng trên môi trường MHB-GMB.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Chất kháng nấm<br /> Ketoconazole chất chuẩn đối chiếu, lô<br /> 50030107, hàm lượng 99,63%.<br /> Fluconazole USP, lô FLU-09 12 085, hàm<br /> lượng 99,41%.<br /> Môi trường: Mueller Hinton Broth (Merck),<br /> Mueller Hinton Agar (Merck) và Czapeck-Dox<br /> ((Merck).<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu(2,4,5)<br /> Các chủng Candida spp. được xác định mức<br /> độ nhạy với ketoconazol và fluconazol với hai<br /> phương pháp:<br /> Phương pháp khuếch tán theo đúng hướng<br /> dẫn NCCLS M44, sử dụng đĩa giấy tẩm<br /> fluconazol 25 μg và ketoconazol 15 μg. Môi<br /> trường thạch Mueller Hinton bổ sung 2%<br /> glucose và xanh methylen 5 μg/ml (MHAGMB). Thử nghiệm được ủ ở 37 oC trong 24<br /> giờ. Đường kính vòng ức chế được đọc ở mức<br /> 80% sự ức chế.<br /> Phương pháp pha loãng: nồng độ tối thiểu<br /> ức chế sự phát triển của vi nấm (MIC) được thực<br /> hiện trong môi trường lỏng Mueller Hinton bổ<br /> sung 2% glucose và xanh methylen 5 μg/ml<br /> (MHB-GMB). Kết quả được xác định bằng mắt<br /> thường, sau 24 và 48 giờ ủ ở 37 oC.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với<br /> fluconazol và ketoconazol xác định bằng<br /> phương pháp khếch tán<br /> Bảng 1. Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với<br /> fluconazol xác định bằng phương pháp khuếch tán.<br /> Chủng nấm<br /> Candida albicans<br /> Candida non<br /> albicans<br /> <br /> Số Đường kính vòng ức chế (mm)<br /> chủng<br /> ≥ 19<br /> 15-18<br /> ≤ 14<br /> 30<br /> 36<br /> <br /> 29<br /> 33<br /> <br /> 0<br /> 2<br /> <br /> 1<br /> 1<br /> <br /> Theo hướng dẫn của NCCLS M44-A, dựa<br /> vào đường kính vòng ức chế để qui định mức<br /> độ nhạy cảm của Candida spp. với fluconazol,<br /> thực hiện trên môi trường MHA-GMB được<br /> chia thành 3 mức, nhạy (S) khi đường kính<br /> vòng ức chế ≥ 19 mm; nhạy tùy thuộc liều<br /> <br /> 451<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> (SDD) khi đường kính vòng ức chế từ 15-18<br /> mm và đề kháng (R) với đường kính vòng ức<br /> chế ≤ 14 mm.<br /> Bảng 2. Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với<br /> ketoconazol xác định bằng phương pháp khuếch tán<br /> Chủng nấm<br /> <br /> Số chủng Đường kính vòng ức chế<br /> (mm)<br /> ≥ 30<br /> 23-29<br /> ≤ 22<br /> Candida albicans<br /> 8<br /> 6<br /> 1<br /> 1<br /> Candida non<br /> 12<br /> 9<br /> 0<br /> 3<br /> albicans<br /> <br /> Đối với ketoconazole, các chủng phân lập<br /> được xác định là nhạy (S) khi đường kính<br /> vòng ức chế ≥ 30 mm; nhạy tùy thuộc liều<br /> (SDD) khi đường kính vòng ức chế từ 23-29<br /> mm và đề kháng (R) với đường kính vòng ức<br /> chế ≤ 22 mm.<br /> <br /> Candida<br /> albicans<br /> Candida non<br /> albicans<br /> <br /> 30<br /> <br /> 29<br /> <br /> 29<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 36<br /> <br /> 19<br /> <br /> 12<br /> <br /> 16<br /> <br /> 11<br /> <br /> 1<br /> <br /> 13<br /> <br /> Bảng 4. Nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp. của<br /> ketoconazol.<br /> Chủng nấm<br /> <br /> Số<br /> chủng<br /> <br /> ≤8<br /> <br /> Khoảng MIC µg/ml<br /> 8-16<br /> ≥ 16<br /> <br /> 24 48 24 48 24 48<br /> giờ giờ giờ giờ giờ giờ<br /> Candida<br /> albicans<br /> Candida non<br /> albicans<br /> <br /> 21<br /> <br /> 16<br /> <br /> 16<br /> <br /> 5<br /> <br /> 5<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 12<br /> <br /> 12<br /> <br /> 12<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> So sánh mức độ nhạy cảm của Candida<br /> spp. với ketoconazol và fluconazol xác<br /> định bằng phương pháp pha loãng và<br /> phương pháp khuếch tán<br /> <br /> Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với<br /> fluconazol và ketoconazol xác định bằng<br /> phương pháp pha loãng<br /> <br /> Theo hướng dẫn của NCCLS M27-A2, mức<br /> độ kháng nấm men của fluconazol và<br /> ketoconazol được qui định như sau:<br /> <br /> Mức độ nhạy của Candida spp. được xác<br /> định bằng phương pháp pha loãng, sử dụng<br /> môi trường MHB-GMB. Kết quả được xác định<br /> sau 24 giờ và 48 giờ ủ ở 37 oC. Điểm dừng đọc<br /> kết quả được xác định ở 80% ức chế sự phát<br /> triển của vi nấm.<br /> <br /> Fluconazole: nhạy (S) khi MIC ≤ 8 μg/ml;<br /> trung gian (SDD) khi MIC từ 16-32 μg/ml; và<br /> đề kháng (R) khi MIC ≥ 64 μg/ml. Ketoconazol:<br /> nhạy (S) khi MIC < 8 μg/ml; trung gian (SDD)<br /> khi MIC từ 8- 16μg/ml; và đề kháng (R) khi<br /> MIC > 16 μg/ml<br /> <br /> Bảng 3. Nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp. của<br /> fluconazol<br /> <br /> Dựa vào đường kính vòng ức chế và nồng<br /> độ tối thiểu ức chế Candida spp., mức độ nhạy<br /> của Candida spp. với fluconazol và ketoconazol<br /> được tóm tắt ở bảng 5 và bảng 7.<br /> <br /> Chủng nấm<br /> <br /> Số<br /> chủng<br /> <br /> ≤8<br /> <br /> Khoảng MIC µg/ml<br /> 16-32<br /> ≥ 64<br /> <br /> 24 48 24 48 24 48<br /> giờ giờ giờ giờ giờ giờ<br /> <br /> Bảng 5. So sánh mức độ nhạy cảm của Candida spp. với fluconazol và ketoconazol.<br /> Chủng nấm<br /> <br /> Phương pháp<br /> <br /> Thời gian đọc<br /> kết quả<br /> <br /> Candida albicans<br /> <br /> Khuếch tán<br /> Pha loãng<br /> <br /> Candida non albicans<br /> <br /> Khuếch tán<br /> Pha loãng<br /> <br /> 24h<br /> 24h<br /> 48h<br /> 24h<br /> 24h<br /> 48h<br /> <br /> Mức độ nhạy cảm với chất kháng nấm (%)<br /> S<br /> SDD<br /> R<br /> FLC<br /> KTZ<br /> FLC<br /> KTZ<br /> FLC<br /> KTZ<br /> 96,67<br /> 75,00<br /> 0<br /> 12,5<br /> 3,33<br /> 12,5<br /> 96,67<br /> 76,19<br /> 0<br /> 23,81<br /> 3,33<br /> 0<br /> 96,67<br /> 76,19<br /> 0<br /> 23,81<br /> 3,33<br /> 0<br /> 91,67<br /> 75,00<br /> 5,55<br /> 0<br /> 2,78<br /> 25,00<br /> 52,78<br /> 100<br /> 44,44<br /> 0<br /> 2,78<br /> 0<br /> 30,55<br /> 100<br /> 30,55<br /> 0<br /> 36,11<br /> 0<br /> <br /> S: nhạy; SDD: nhạy cảm tùy thuộc liều; R: đề kháng; FLC: fluconazol; KTZ: ketoconazol<br /> <br /> 452<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> BÀN LUẬN<br /> Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với<br /> fluconazol và ketoconazol<br /> Khi xác định mức độ nhạy của Candida spp.<br /> với ketoconazol và fluconazol bằng phương<br /> pháp khuếch tán, theo đúng hướng dẫn và bàn<br /> luận kết quả của NCCLS M44-A, chúng tôi nhận<br /> thấy tỉ lệ kháng thuốc của các chủng Candida<br /> albicans và Candida non albicans phân lập từ niêm<br /> mạc miệng và âm đạo bệnh nhân không cao,<br /> 1/30 và 1/36 với fluconazol; 1/8 và 3/12 với<br /> ketoconazol (bảng 1 và 2). Kết quả nhận được từ<br /> phương pháp pha loãng cũng cho kết quả tương<br /> tự. So với công bố của Trần Phủ Mạnh Siêu và<br /> Hồ Quang Thắng(6), sự đề kháng với ketoconazol<br /> và fluconazol của các chủng Candida albicans và<br /> C. tropicalis phân lập từ phết họng, đàm, dịch<br /> rửa phế quản, nước tiểu chiếm tỉ lệ rất cao từ<br /> 26,67% đến 100%. Tuy nhiên do các tác giả<br /> không cho biết đã thực hiện kháng sinh đồ ở<br /> môi trường nuôi cấy nào, nồng độ kháng sinh<br /> trong mỗi đĩa giấy và tiêu chuẩn xác định mức<br /> độ nhạy hoặc kháng thuốc, nên khó tìm ra lý do<br /> của sự khác biệt này.<br /> <br /> So sánh giữa phương pháp pha loãng và<br /> phương pháp khuếch tán,<br /> Phương pháp khuếch tán là phương pháp<br /> được sử dụng thường qui ở các bệnh viện để xác<br /> định mức độ nhạy của các chủng lâm sàng với<br /> kháng sinh sử dụng trong điều trị. Phương pháp<br /> đơn giản, ít tốn thời gian, giúp chọn thuốc thích<br /> hợp trong điều trị nhanh nhất.<br /> Phương pháp pha loãng cho sự tương quan<br /> cao giữa các phòng thí nghiệm và có mối tương<br /> quan tốt hơn giữa kết quả in vitro và hiệu quả<br /> điều trị. Để xác định nồng độ tối thiểu ức chế sự<br /> phát triển của nấm men của các chất kháng nấm<br /> bằng phương pháp pha loãng, theo hướng dẫn<br /> của NCCLS M27-A2, thử nghiệm được thực<br /> hiện với môi trường RPMI với đệm MOPS. Đây<br /> là môi trường khá đắt tiền, qui trình điều chế<br /> phức tạp. Vì vậy chúng tôi sử dụng môi trường<br /> lỏng Mueller Hinton bổ sung glucose và xanh<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> methylen để xác định nồng độ tối thiểu ức chế<br /> Candida spp. Đây là môi trường được NCCLS<br /> M44-A hướng dẫn sử dụng để xác định mức độ<br /> nhạy của nấm men với các chất kháng nấm bằng<br /> phương pháp khuếch tán. Môi trường Mueller<br /> Hinton có công thức ổn định, được dùng thông<br /> dụng cho vi khuẩn, cách điều chế đơn giản.<br /> Bằng cách so sánh với kết quả nhận được từ<br /> phương pháp khuếch tán đã được chuẩn hóa<br /> bởi NCCLS M44-A, để tìm sự tương quan giữa<br /> hai phương pháp.<br /> Kết quả thực nghiệm cho thấy, môi trường<br /> MHB-GMB cho bước nhảy rõ ràng, ít bị ảnh<br /> hưởng của hiện tượng kéo đuôi (trailing<br /> growth), gây khó khăn cho việc xác định MIC ở<br /> Candida. MIC xác định sau 24 giờ cho tương<br /> quan tốt hơn với phương pháp khuếch tán.<br /> Tỉ lệ các chủng đề kháng với ketoconazol và<br /> fluconazol của C. albicans không khác biệt đáng<br /> kể giữa hai phương pháp. Tuy nhiên, phương<br /> pháp pha loãng có thể phát hiện được các chủng<br /> có mức độ nhạy tùy thuộc liều với MIC cao hơn.<br /> Ở Candida non albicans, khi sử dụng phương<br /> pháp pha loãng, đọc kết quả sau 24 giờ đã phát<br /> hiện được các chủng nhạy tùy thuộc liều cao<br /> hơn phương pháp khuếch tán (16/36 chủng có<br /> MIC trung gian, so với 0/36 chủng ở phương<br /> pháp khuếch tán), nếu đọc kết quả sau 48 giờ, tỉ<br /> lệ chủng kháng thuốc tăng cao so với phương<br /> pháp khuếch tán (13/36 so với 1/36). Qua kết quả<br /> khảo sát, các chủng Candida albicans phân lập từ<br /> niêm mạc miệng và âm đạo của bệnh nhân vẫn<br /> còn nhạy với ketoconazol và fluconazol. Đối với<br /> Candida non albicans, khi dùng phương pháp<br /> khuếch tán đã được chuẩn hóa của NCCLS<br /> M44-A, chưa phát hiện nguy cơ kháng thuốc<br /> cao, tuy nhiên mức độ nhạy với fluconazol và<br /> ketoconazol của các chủng này đã giảm với tỉ lệ<br /> chủng nhạy tùy thuộc liều tăng cao đến 44,44%.<br /> Trong một số công bố khác của Huang và<br /> cs., khi nghiên cứu sự tương quan giữa giá trị<br /> MIC in vitro và hiệu quả điều trị in vivo nhận<br /> thấy ở những ca Candida nhiễm trùng huyết<br /> ngay khi có MIC của fluconazol < 32 μg cũng đã<br /> <br /> 453<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> kém đáp ứng với fluconazol khi điều trị. Vì vậy<br /> chúng tôi đề nghị, để có sự tương quan tốt giữa<br /> kết quả in vitro và lâm sàng, ngoài việc sàng lọc<br /> nhanh kháng sinh thích hợp bằng phương pháp<br /> khuếch tán, nếu có điều kiện có thể sử dụng môi<br /> trường MHB-GMB xác định thêm MIC của<br /> kháng sinh đã chọn để chọn liều điều trị hợp lý.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Cảm ơn: Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn Khoa Dược, Đại<br /> học Y Dược TP. HCM đã cung cấp kinh phí và tạo điều kiện<br /> nghiên cứu.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> <br /> 454<br /> <br /> Anaissie EJ., McGinnis MR. & Pfaller MA. (2003) Clinical<br /> Mycology. Churchill Livingstone, p. 161-163.<br /> <br /> 6.<br /> <br /> Capoor MR and cs. (2005) Emergence of Non-albicans<br /> Candida Species and antifungal resistance in a tertiary care<br /> hospital. Jpn. J. Infect. Dis., 58, 344-348.<br /> Ernst EJ. và Rogers PD (2007), “Methods in Molecular<br /> medicine”, Antifungal agent - methods and protocols, Voll.188,<br /> Humana Press Inc, Totowa, NJ, pp. 3-7.<br /> Sheehan DJ., Pfizer (2003), Susceptibility of global isolates of<br /> Candida species to fluconazole and Voriconazole by disk<br /> diffusion. Foccus on Fungal Infections 13.1.<br /> The national committee for clinical laboratory standards<br /> (1996) Reference method for broth dilution antifungal<br /> susceptibility testing of yeasts, Approve standard-second<br /> edition”, NCCLS document M27-A2.22(15).<br /> Trần Phủ Mạnh Siêu, Hồ Quang Thắng (2010). Tình hình<br /> nhiễm vi nấm Candida spp. trên các bệnh nhân nhập viện tại<br /> bệnh viện Nhiệt đới TP. HCM năm 2009. Tạp chí Y học, phụ<br /> bản số 1, tập 14, tr. 206-212.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br />