Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây keo lai phân lập được ở Xuân Mai, Chương Mỹ - Hà Nội

Chia sẻ: Elysale25 Elysale25 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:59

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Việc sử dụng các chế phẩm sinh học từ VSV là rất cần thiết và việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm g y bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật xây dựng một nền nông nghiệp an toàn và bền vững. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm chi tiết nội dung bài viết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây keo lai phân lập được ở Xuân Mai, Chương Mỹ - Hà Nội

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP .................oo0oo................... KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP T ỂN ỌN NG N Ứ T Ố ỦNG Ạ N Ả N NG N ẤT NG N ỐNG NẤ G ỆN TRÊN CÂY KEO N Ậ ĐƢ Ở XUÂN MAI ƢƠNG Ỹ - HÀ N I NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : Th.s Nguyễn Thị Minh Hằng Sinh viên thực hiện : Bùi Văn Tuấn Mã sinh viên : 1453071774 Lớp : K59B – CNSH Khóa học : 2014 - 2018 Hà Nội, 2018
LỜI CẢ ƠN Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự động viên, khích lệ cũng với sự hƣớng dẫn nhiệt tình và chu đáo của các cô, chú, anh chị và cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh Hóa sinh, thuộc Viện Công nghệ sinh học m nghiệp Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn s u sắc tới Th.s. Nguyễn Thị Minh Hằng – GV Viện Công nghệ sinh họcLâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo hƣớng dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành báo cáo Luận văn tốt nghiệp. Nhóm tôi cũng ch n thành cảm ơn tập thể cán bộ, công nhân viên Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam đã quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành báo cáo một cách tốt nhất. Cuối cùng cả nhóm xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện. Hà Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2018 Sinh viên thực hiện ùi ăn Tuấn
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC NH MỤ HIỆU H VI T TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................ 1 HƢỢNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. Tổng quan về cây keo............................................................................................. 3 1.1.1 Tình hình trồng keo lai tại Việt Nam .................................................................. 3 1.1.2. Các bệnh do nấm hại gây ra trên cây keo lai..................................................... 3 1.2. Giới thiệu về xạ khuẩn ........................................................................................ 5 1.2.1. Vị trí phân loại và sự phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên ............................... 5 1.2.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn .................................................................... 7 1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................................................................10 1.3. Phƣơng pháp ph n loại xạ khuẩn ........................................................................11 1.3.1. Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống.......................................................11 1.3.2. Phân loại theo phƣơng pháp hiện đại...............................................................13 1.4. Đại cƣơng về chất kháng sinh..............................................................................13 1.4.1. Chất kháng sinh (Antibiotic) ...........................................................................13 1.4.2. Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh ...............................................................14 1.4.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn.....................................................15 1.4.4. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn.............................................16 1.5. Ứng dụng của chất kháng sinh ............................................................................17 1.5.1. Ứng dụng trong y học .......................................................................................17 1.5.2. Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y ......................................18 1.6. Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật........................................................20 1.6.1. Ƣu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme ............................................20 1.6.2. Tuyển chọn các chủng sinh enzyme cao từ tự nhiên ....................................21 1.6.3. Một số enzyme phổ biến có nguồn gốc từ vi sinh vật ..................................22
hƣơng 2 NGUYÊN IỆU - MỤC TIÊU – NỘI UNG PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU.............................................................................................................23 2.1. Nguyên liệu ...........................................................................................................23 2.1.1. Mấu đất ...............................................................................................................23 2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................................23 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất ............................................................................23 2.2. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................................24 2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................24 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................................25 2.4.1. Phƣơng pháp ph n lập nấm bệnh .....................................................................25 2.4.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn từ đất ...........................................................25 2.4.3. Phƣơng pháp thuần khiết và bảo quản giống ..................................................27 2.4.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh ...................................................27 2.4.5. Phƣơng pháp lên men thu sinh khối tế bào xạ khuẩn.....................................28 2.4.6. Xác định hoạt tính enzyme của xạ khuẩn bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch ........................................................................................................................29 2.4.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................................29 hƣơng 3 T QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................30 3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn ...................................................................................30 3.1.1. Phân lập xạ khuẩn ..............................................................................................30 3.1.2. Phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu ............................................................31 3.1.3. thuần khiết và lƣu trữ giống XK phân lập đƣợc .............................................33 3.2. Phân lập, thuần khiết và lƣu trữ giống nấm gây bệnh trên cây keo lai ............33 3.2.1. Phân lập nấm gây bệnh .....................................................................................33 3.2.2. Thuần khiết và bảo quản chủng giống.............................................................34 3.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh ................................35 3.3.1. Tuyển chọn sơ bộ ban đầu bằng phƣơng pháp thỏi thạch .............................35 3.3.2. Tuyển chọn các chủng XK có HTKS cao .......................................................37 3.5. Thử nghiệm hoạt tính enzyme ngoại bào của 2 chủng XK tuyển chọn ..........41 3.5.1. Xác định hoạt tính của các loại enzyme ngoại bào ........................................41
3.6. Nghiên cứu đặc điểm hình thái 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme cao ................................................................................................................42 3.6.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của 2 chủng XK tuyển chọn ...........................42 3.6.2. Quan sát đặc điểm hình thái và cuống sinh bào tử của một số chủng xạ khuẩn dƣới k nh hiển vi ...............................................................................................43 K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ....................................................................................45 TÀI LIỆU THAM KHẢO
N Ụ Ệ Ữ T TẮT CFU Colony Forming Unit BVTT Bảo vệ thực vật GI Môi trƣờng Gause I VSV Đ Vi sinh vật kiểm định HSKS Hệ sợi kh sinh HSCC Hệ sợi cơ chất TB Tế bào VSV Vi sinh vật CMC Cacborxyl Methy cellulose CKS hất háng sinh HTKS Hoạt t nh kháng sinh XK Xạ khuẩn HTSH Hoạt t nh sinh học VK Vi khuẩn G Gram G(+) Gram dƣơng G(-) Gram âm
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. háng sinh đƣợc phát hiện qua các năm [6] ............................................14 Bảng 3.1. Sự phân bố của xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau ...............................30 Bảng 3.2. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu...........................31 Bảng 3.3 HTKS của 27 chủng XK với 3 chủng nấm LPT1, LPT2 và LPT3 ........35 Bảng 3.4. HTKS của 27 chủng xạ khuẩn theo nhóm màu .......................................36 Bảng 3.5. HTKS của 2 chủng XK tuyển chọn bằng phƣơng pháp thỏi thạch ......37 Bảng 3.6 HTKS của 2 chủng X đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng GI lỏng ở các khoảng thời gian khác nhau ........................................................................................38 Bảng 3.7. Hoạt tính enzyme của 2 chủng XK ...........................................................41 Bảng 3.8. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 2 chủng XK tuyển chọn ...................43 Bảng 3.9: Kết quả quan sát cuống sinh bảo tử và hình dạng bào tử của 2 chủng XK tuyển chọn (dƣới HV trƣờng ở vật kính X40) ................................................44
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn [44]............................................................................... 7 Hình 1.2. Hình dạng cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng Streptomyces cinereoruber subp [6] ..................................................................................................10 Hình 3.1. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu ......................................32 Hình 3.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của một số chủng XK theo nhóm màu 32 Hinh3.3 Một số chủng X đƣợc thuần khiết ...........................................................33 Hình 3.4: Nấm bệnh ph n lập trên môi trƣờng P ................................................34 Hình 3.5: ác chủng nấm bệnh đã đƣợc thuần khiết ................................................34 Hình 3.6 HTKS của chủng xạ khuẩn X ĐV12 lên 3 chủng nấm gây bệnh..........39 Hình 3.7 HTKS của chủng xạ khuẩn X Đ 9 lên 3 chủng nấm gây bệnh............39 Hình 3.8. HTKS của 2 chủng XK kháng nấm hại cấy keo lai ................................40 Hình 3.9. Hoạt tính enzym của dịch lên men 2 chủng X đã tuyển chọn .............42
ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một nƣớc nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa ẩm lƣợng mƣa lớn, nền nhiệt độ và độ ẩm không khi cao là điều kiện hết sức thuận lợi cho vi sinh vật phát triển trong đó có rất nhiều các loại vi sịnh vật có hại gây ảnh hƣởng tới đời sống con ngƣời và đặc biệt là với quá trình sản xuất nông nghiệp. Có rất nhiều vi sinh vật gây bệnh cho động vật, thực vật và theo ghi nhận hàng năm g y thiệt hại lớn cho ngành sản xuất nông – lâm – ngƣ nghiệp. Để giảm thiểu sự nguy hại của vi sinh vật gây bệnh chúng ta đã sử dụng 1 lƣợng lớn chất bảo vệ thực vật hóa học tuy đem lại hiệu quả nhanh và tức thời xong hệ lụy của nó để lại không hề nhỏ. Các chất độc hóa học khó tan, lắng đọng, gây ô nhiễm nguồn nƣớc không kh đất... ảnh hƣởng xấu tới cuộc sống con ngƣời và sinh vật. Chính vì vậy tại Hội nghị tƣ vấn khu vực h u Thái Bình ƣơng của F O năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của trƣơng trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lƣợc là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phá hoại của vi sinh vật gây bệnh. Một trong những hƣớng giải quyết tối ƣu đƣa ra là sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh chất kháng sinh, chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Xạ khuẩn là một trong các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh đƣợc quan t m hàng đầu, bởi khả năng sinh chất kháng sinh với hàm lƣợng lớn đa dạng và hoạt tính cao. Trong tổng số các chất kháng sinh đƣợc ghi nhận sinh ra từ vi sinh vật thì có tới 80% là do xạ khuẩn, trong số đó có những kháng sinh có khả năng kháng nấm gây bệnh Keo lai là tên gọi viết tắt của giống lai tự nhiên giữa hai loài keo tai tƣợng (Acacia mangium) và keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Giống lai này đƣợc Messrs Hepbum và Shim phát hiện năm 1972 trong những hàng cây trồng ven đƣờng. Năm 1978 khi xem xét các mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản thực vật ở Queensland ( ustralia) Pedkey đã xác nhận đó là giống lai tự nhiên giữa keo tai tƣợng và keo lá tràm. Trong tự nhiên keo lai cũng đƣợc phát hiện ở Papu NewGuinea (Turn bull,1986; Grinfin, 1988)[27], eo lai đã đƣợc 1
nghiên cứu nhân giống thành công bằng hom (Griffin, 1991). Năm 1996 diện tích trồng cây Keo lai khoảng 15.000ha thì đến hết năm 2004 diện tích trồng c y eo lai đã hơn 127.000ha đến nay ƣớc tính diện tích trồng Keo lai khoảng 200.000ha. Nhƣng bên cạnh đó hàng năm nấm g y bệnh trên c y keo lai g y hậu quả rất nặng nề ảnh hƣởng lớn tới năng suất cũng nhƣ chất lƣợng sản phẩm c y giống, việc sử dụng thuốc hóa học BVTT gây ảnh hƣởng xấu tới sức khỏe con ngƣời, vật nuôi và môi trƣờng sống. Vì vậy việc sử dụng các chế phẩm sinh học từ VSV là rất cần thiết và việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm g y bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật x y dựng một nền nông nghiệp an toàn và bền vững. Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên theo xu hƣớng của công nghệ sinh học thế giới hiện nay cũng nhƣ để góp phần khai thác nguồn lợi VSV phong phú của khu vực Xuân Mai tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Tu n họn v n hiên u ts h n hu n h năn sinh hất hán sinh h n nấ ệnh trên o i ph n p ư Xuân Mai - Chươn Mỹ - Hà N i" 2
Ƣ NG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây keo 1.1.1 Tình hình trồng keo lai t i Việt Nam Keo lai là tên gọi viết tắt của giống lai tự nhiên giữa hai loài keo tai tƣợng (Acacia mangium) và keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Giống lai này đƣợc Messrs Hepbum và Shim phát hiện năm 1972 trong những hàng cây trồng ven đƣờng. Năm 1978 khi xem xét các mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản thực vật ở Queensland ( ustralia) Pedkey đã xác nhận đó là giống lai tự nhiên giữa keo tai tƣợng và keo lá tràm. Trong tự nhiên keo lai cũng đƣợc phát hiện ở Papu NewGuinea (Turn bull,1986; Grinfin, 1988) [27] Hiện nay keo lai đƣợc trồng rất nhiều quốc gia trên thế giới : Australia, Papua new Guinea va Indonexia , Malaixia, Philippin phù hợp với nhiều ñiều kiện sinh thái, cây phát triển nhanh, trồng dễ sống, trong một chu kỳ cho một sinh khối lớn hơn các loài keo khác và chất lƣợng gỗ cũng đẹp. Sinh trƣởng và sản lƣợng: Qua các số liệu khảo nghiệm và trồng rừng thực tế thì sinh trƣởng c y keo lai sinh trƣởng rất nhanh và cho sinh khối lớn hơn rất nhiều so với các loài cây keo bố mẹ và các giống keo lai khác. Những giống đã qua chọn lọc và khảo nghiệm có thể đạt năng suất 18 - 25 m3/ha/năm ở các tỉnh miền Bắc, 30 - 40m3/ha/năm ở các tỉnh Đông Nam Bộ [27]. Keo lai có khả năng cố định đạm và khả năng cải tạo đất cao hơn eo tai tƣợng và Keo lá tràm, phù hợp với điều kiện đất trống đồi núi trọc ở nƣớc ta, gỗ keo lai có thể làm nguyên liệu giấy ván dăm sử dụng trong xây dựng đóng đồ mộc… tăng thu nhập đáng kể cho ngƣời trồng rừng. Vì thế eo lai đang là nhóm cây có diện tích trồng rừng lớn nhất ở nƣớc ta những năm gần đ y. Năm 1996 diện tích trồng cây Keo lai khoảng 15.000ha thì đến hết năm 2004 diện tích trồng c y eo lai đã hơn 127.000ha đến nay ƣớc tính diện tích trồng Keo lai khoảng 200.000ha. 1.1.2. Các bệnh do nấm h i gây ra trên cây keo lai 3
Các bệnh do nấm hại gây ra trên cây keo lai gồm 4 loại bệnh tiêu biểu ệnh phấn trắng lá keo o nấm Oidium sp g y ra. Nấm bệnh mọc trên bề mặt lá non chồi non để hút dinh dƣỡng làm cho lá xoăn lại màu n u vàng khô chết nhƣng lá không rụng. Bệnh bắt đầu phát sinh vào tháng 11 nặng nhất là tháng 3 - 4. Trong điều kiện th ch nghi và thời tiết m u bệnh rất dễ l y lan thành dịch. Sợi nấm có thể qua đông trên đốm vàng của lá già để năm sau x m nhiễm lá mới. ệnh thán thƣ (đốm than) o nấm Colletotrichum gloeosporioi g y ra. Bệnh phát sinh g y hại trên lá chủ yếu ở đầu ngọn lá và mép lá. úc đầu lá mất màu rồi lan rộng dần vào phiến lá vết bệnh có thể làm khô đến nửa lá. Vết bệnh màu n u xám hoặc n u đen trên bề mặt vết bệnh có các đốm chấm đen nhỏ lúc trời ẩm có thể thấy nhiều bộ màu hồng. Trên cành non vết bệnh lõm xuống chung quanh có viền đen và giữa vết bệnh có các chấm đen nhỏ. Bệnh g y hại c y keo ở vƣờn ƣơm và rừng trồng làm c y sinh trƣởng chậm. Bệnh phát triển mạnh vào tháng 3 - 5 tháng 6 giảm dần. ệnh đen thân o nấm Macrophomina phaseolina Tassi g y ra. Ban đầu gốc biến thành màu n u lá mất màu xanh bệnh phát triển dần lên ngọn làm lá khô héo rũ xuống phần vỏ th n co ngót tầng trong vỏ thối đen xốp hoặc dạng bột. Trong đó mọc nhiều hạch nấm màu đen. Nấm bệnh có thể x m nhiễm vào phần gỗ phần tủy gỗ biến thành màu n u đen và lan dần đến phần rễ c y nhổ c y lên chỉ còn lại phần gỗ. Trong mùa nắng nóng nhiệt độ mặt đất lên cao phần gốc c y bị tổn thƣơng tạo điều kiện cho bệnh x m nhập g y hại. Ở những khu vực t ch tụ nhiều nƣớc tỷ lệ c y bệnh càng tăng lên rõ rệt. 4
Sau thời tiết mƣa phùn 10 - 15 ngày bệnh bắt đầu phát sinh. Về sau tăng dần đến tháng 10. Nặng nhất là các tháng 6 7 8. ệnh nấm hồng o nấm Corticium salmonicolor Berk & Br g y ra ở những vùng có lƣợng mƣa cao. Bệnh thƣờng xuất hiện vào đầu mùa mƣa dấu hiệu đầu tiên bằng mắt thƣờng cũng dễ dàng nhận thấy có những đám màu trắng xuất hiện trên bề mặt vỏ th n c y hay cành c y ở ph a bị che bóng thƣờng ở vị tr từ 1/5 đến 1/4 chiều cao của c y t nh từ ngọn. Đến cuối mùa mƣa lớp màu hồng da cam này nhạt dần màu trở nên màu trắng bẩn vỏ c y bị nứt ra để lộ một phần gỗ sợi nấm x m nhiễm vào th n cành c y cũng nhƣ toàn bộ lá của của c y từ chỗ bị nấm x m nhiễm lên đến ngọn bị héo chết có màu n u và không rụng ngay. Đỉnh ngọn c y bị chết đổ gẫy từ chỗ gốc c y mọc chồi mới. Trƣờng hợp nặng toàn bộ c y bị chết. 1.2. Giới thiệu về xạ khuẩn 1.2.1. Vị trí phân lo i và sự phân b x khu n trong tự nhiên Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc Tenericutes (gồm vi khuẩn gram dƣơng và xạ khuần, thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nh n sơ (prokaryota) [35]. Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ 110 chi và 1000 loài trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại đƣợc xếp vào nhóm XK hiếm [12,43]. Streptomyces đặc biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ bằng các enzyme ngoại bào. Một phần rất lớn các chất kháng sinh đƣợc sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces, trong đó đƣợc biết đến nhất là streptomycin, erythromycin, tetracyclin [41]. Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh 5
trƣởng hiếu khí và tạo khuẩn ty ph n nhánh tƣơng tự nhƣ nấm. Tên xạ khuẩn – actinomycete – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) và ban đầu xạ khuẩn đƣợc coi là vi nấm vì chúng sinh trƣởng giống với nấm. Mạng lƣới phân nhánh của thể sợi thƣờng phát triển ở cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong (tạo thành hệ sợi cơ chất) [28]. Đ y là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn. Xạ khuẩn là VK G(+) có tỷ lệ G+ cao (>55%) trong N . Đa số xạ khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất nƣớc và xác thực vật. Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng về mặt sinh thái trong vòng tuần hoàn tự nhiên. Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó ph n hủy nhƣ humic acid trong đất [43]. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignhin bằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và các peoxidase ngoại bào [34]. Các chủng xạ khuẩn xuất hiện trong môi trƣờng giàu chất hữu cơ nhƣ các compost ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu nhiệt (thermophilic) [40], và ở cống rãnh nƣớc thải nơi mà các xạ khuẩn chứa mycolic acid kết hợp với việc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn định đặc trƣng [38]. Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30º và pH trung t nh là điều kiện tối ƣu cho xạ khuẩn phát triển. Mặc dầu vậy, nhiều loài đã đƣợc phân lập ở các môi trƣờng khắc nghiệt ví dụ nhƣ Arthrobacter ardleyensis ƣa lạnh đƣợc phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [28] và Nocardiopis alkaliphila đƣợc phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH 9,5 - 10 [31]. 6
1.2.2. Đặ i m sinh học c a x khu n 1.2.2.1. Đặ i m hình thái * Khuẩn lạc Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với đƣờng k nh thay đổi trong khoảng 0,2 - 1 µm đến 2 - 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [11,13]. ch thƣớc và khối lƣợng hệ sợi thƣờng không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Đ y là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đƣờng kính rất lớn thay đổi từ 5 - 50 µm, dễ quan sát bằng mắt thƣờng. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thƣờng chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. ch thƣớc và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và tùy vào điều kiện nuôi cấy nhƣ thành phần môi trƣờng, nhiệt độ độ ẩm… Đƣờng kính của mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 - 2 mm nhƣng cũng có khuẩn lạc đạt tới đƣờng kính 1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tƣơng đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Hình 1.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn [12] 7
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất nhƣ: S độc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ… có thể đƣợc t ch lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay đƣợc tiết ra môi trƣờng. * Khuẩn ty Trên môi trƣờng cơ chất đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào trong môi trƣờng gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất - substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dƣỡng. Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản. Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhƣng cũng có loại (nhƣ chi Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi kh sinh. hi đó HS S vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dƣỡng [8]. 1.2.2.2. Cấu t o tế bào x khu n Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tƣơng tự VK G(+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lƣới, dày 10 – 20 nm có cấu tạo tƣơng tự thành tế bào của VK G(+), thành phần chủ yếu là peptidoglucan tạo nên một lớp vách tế bào tƣơng đối vững chắc. Ph n t ch dƣới kính hiển vi điện tử thành tế bào XK gồm ba lớp: lớp ngoài cùng dày 60Aº, lớp trong và lớp giữa dày 50 º. ăn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn đƣợc chia thành 4 nhóm chính [5,9]: Nhóm I: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này. Nhóm II: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các chi: Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella… 8
Nhóm III: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic. Thuộc nhóm này có các chi: Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia… Nhóm IV: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic arabinose và galactose. Thuộc nhóm này gồm các chi: Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia… Thành tế bào có kết cấu dạng lƣới có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Ngoài ra thành tế bào X có thể cho phép nhiều chất nhƣ: hất kháng sinh axit amin và nhiều hợp chất khác có k ch thƣớc tƣơng đối lớn đi qua một cách dễ dàng. ác chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng cũng thẩm thấu một cách chọn lọc qua thành tế bào. Màng sinh chất là lớp tế bào nằm ngay sát dƣới thành tế bào dày khoảng 7 5 - 10 nm chức năng chủ yếu là điều hòa sự hấp thu các chất dinh dƣỡng vào tế bào tham gia vào quá trình hình thành bào tử. Tế bào chất của X gồm một số thành phần chủ yếu nhƣ: thể nh n không bào và thể ẩn nhập. Nh n của tế bào X không có cấu trúc điển hình chỉ là nhiễm sắc thể không có màng bao bọc. hi còn non toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty. 1.2.2.3. Sự hình th nh o tử hu n Bào tử xạ khuẩn đƣợc hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đ y là cơ quan sinh sản đặc trƣng cho xạ khuẩn. Trên mỗi cuống sinh bào tử mang 30 - 100 bào tử đôi khi có thể mang tới 200 bào tử. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lƣợn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thƣờng có hình trụ, 9
ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [10]. Bào tử xạ khuẩn đƣợc bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 - 400Aº chia làm 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh nhƣ nhiệt độ, pH… Hình dạng k ch thƣớc chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tƣơng đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trƣờng có nguồn nitơ khác nhau [14]. Hình 1.2. Hình d n u n sinh o tử v ề ặt o tử h n Streptomyces cinereoruber subp [6] 1.2.3. Đặ i m sinh lý, sinh hóa XK thuộc nhóm sinh vật dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng rƣợu, axit hữu cơ , lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, muối nitra, muối amoon ure amino axit pepton để làm nguồn nito. Tuy nhiên khả năng 10
hấp thụ các chất này không giống nhau ơ các loài hay các chủng khác nhau. Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu kh ƣa ẩm, một số t ƣa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho X sinh trƣởng là 25 - 300C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ƣu cho sinh tổng hợp S thƣờng chỉ nằm trong khoảng 18 - 280 . Độ ẩm thích hợp đối với X dao động trong khoảng 40 – 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 – 7,5 XK không có giới tính [44]. Xạ khuẩn có khả năng hình thành enzym và các S nên đƣợc ƣớng dụng vào nhiều lĩnh vực của đời sống . Để phân loại xạ khuẩn đến loài ngƣời ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý sinh hóa khác nhƣ khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nito, nhu cầu các chất k ch th ch sinh trƣởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ƣu khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trƣờng, mỗi quan hệ với chất kìm hãm sinh trƣởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất đặc trƣng khác cảu XK[23]. 1.3. Phươn pháp ph n o i x khu n 1.3.1. Phân lo i th o phươn pháp tru ền th ng Trong các đặc điểm hóa phân loại, thành phần hóa học của thành tế bào đƣợc coi là đặc điểm quan trọng nhất. ác đặc điểm hóa phân loại khác nhƣ thành phần đƣờng, menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỉ lệ GC trong ADN của genom cũng mang t nh đặc trƣng cho loài và có ý nghĩa quan trọng trong phân lạo XK. ác đặc điểm sinh lý sinh hóa thƣờng đƣợc kết hợp sử dụng trong phân loại XK là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nito, nhu câu của các chất k ch th ch sinh trƣởng, khả năng ph n hủy các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym. Bên cạnh đó các chỉ tiêu khác nhu mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trƣờng, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trƣởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với 11
CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất đặc trƣng khác của XK cũng đƣợc tiến hành ph n t ch đồng thời [11] 12