Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Đánh giá sự thay đổi tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:130

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của Luận án nhằm tìm ra phương thức tác động của điều kiện vi trọng lực mô phỏng lên sự phát triển của hucMSC, thông qua việc xác định các thay đổi về hình thái tế bào, sự tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào của hucMSC trong điều kiện in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Đánh giá sự thay đổi tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Hồ Nguyễn Quỳnh Chi ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚC KHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ CUỐNG RỐN NGƯỜI TRONG ĐIỀU KIỆN VI TRỌNG LỰC MÔ PHỎNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Hồ Nguyễn Quỳnh Chi ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚC KHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ CUỐNG RỐN NGƯỜI TRONG ĐIỀU KIỆN VI TRỌNG LỰC MÔ PHỎNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS. Hoàng Nghĩa Sơn Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2021
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa hề đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc rõ ràng và đƣợc phép công bố. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 04 năm 2021 Học viên thực hiện Hồ Nguyễn Quỳnh Chi
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến Thầy - PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn, ngƣời đã luôn tận tâm chỉ dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn chỉnh đề tài này. Xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này. Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này. Xin chân thành cảm ơn đề tài: “Nghiên cứu đánh giá sự thay đổi trong cấu trúc bộ khung tế bào cơ thể sống trong điều kiện mô phỏng trạng thái vi trọng lực (simulated microgravity)”, thuộc Chƣơng trình Khoa học công nghệ vũ trụ, mã số: CNVT/16-20 đã hỗ trợ cho nghiên cứu. Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thành Long, ngƣời đã hƣớng dẫn tận tình và giúp tôi có cơ hội đƣợc thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn Thầy, Cô, các anh chị đồng nghiệp, các bạn sinh viên đã và đang nghiên cứu tại Viện Sinh học Nhiệt đới đã luôn động viên giúp đỡ tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu. Con xin cảm ơn ba, mẹ, em đã luôn ở bên con, động viên con trong mọi lúc khó khăn. Tp. HCM, ngày 19 tháng 04 năm 2021 Hồ Nguyễn Quỳnh Chi
iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ................................................................... vi DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... ix TÓM TẮT .................................................................................................................xii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 5 1.1. Vai trò của các nghiên cứu sinh học trong không gian ........................................ 5 1.2. Giới thiệu về vi trọng lực và vi trọng lực mô phỏng............................................ 6 1.2.1. Vi trọng lực ..................................................................................................... 6 1.2.2. Vi trọng lực mô phỏng .................................................................................... 8 1.3. Các hệ thống mô phỏng vi trọng lực .................................................................... 9 1.3.1. Clinostat ........................................................................................................ 10 1.3.2. Buồng quay ................................................................................................... 13 1.3.3. Máy định vị ngẫu nhiên................................................................................ 14 1.4. Tế bào gốc trung mô cuống rốn ......................................................................... 15 1.4.1. Khái niệm ...................................................................................................... 15 1.4.2. Lợi ích của tế bào gốc trung mô cuống rốn .................................................. 16 1.5. Sự tăng sinh tế bào ............................................................................................. 17 1.5.1. Định nghĩa..................................................................................................... 17 1.5.2. Các yếu tố điều hòa chu kỳ tế bào ................................................................ 18 1.5.3. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của vi trọng lực lên sự tăng sinh tế bào ...... 19 1.6. Quá trình apoptosis ............................................................................................ 20 1.6.1. Khái niệm ...................................................................................................... 20 1.6.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến apoptosis ............................................................ 22 1.6.3. Phương pháp đánh giá apoptosis ................................................................. 23 1.7. Nhân và tế bào chất ............................................................................................ 26
iv 1.7.1. Định nghĩa và vai trò của nhân và tế bào chất ............................................. 26 1.7.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thái nhân và tế bào chất ............................ 26 1.8. Bộ khung xƣơng tế bào ...................................................................................... 27 1.8.1. Khái niệm ...................................................................................................... 27 1.8.2. Cấu trúc khung xương tế bào ........................................................................ 27 1.8.3. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của vi trọng lực lên khung xương tế bào ..... 29 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 31 2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 31 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ cần thiết ......................................................................... 31 2.1.2. Môi trường và hóa chất sử dụng ................................................................... 32 2.1.3. Tế bào gốc trung mô ..................................................................................... 33 2.1.4. Hệ thống vi trọng lực mô phỏng (clinostat 3D) ............................................ 33 2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................... 35 2.2.1. Nuôi cấy tế bào ............................................................................................. 36 2.2.1.1. Phương pháp giải đông ........................................................................... 36 2.2.1.2. Phương pháp cấy chuyền ......................................................................... 36 2.2.1.3. Phương pháp đông lạnh .......................................................................... 36 2.2.2. Đánh giá các chỉ thị marker của tế bào gốc trung mô ................................. 37 2.2.3. Thử nghiệm vi trọng lực ................................................................................ 38 2.2.4. Đánh giá sự tăng sinh tế bào ........................................................................ 39 2.2.4.1. Đánh giá mật độ tế bào ........................................................................... 39 2.2.4.2. Đánh giá chu kỳ tế bào ............................................................................ 39 2.2.5. Đánh giá quá trình apoptosis ....................................................................... 44 2.2.5.1. Thu hoạch tế bào...................................................................................... 44 2.2.5.2. Đánh giá tỉ lệ apoptosis ........................................................................... 44 2.2.5.3. Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis..... 45 2.2.6. Đánh giá sự thay đổi hình thái nhân và tế bào chất ..................................... 46 2.2.6.1. Thu hoạch và cố định tế bào .................................................................... 46 2.2.6.2. Đánh giá sự thay đổi hình thái nhân ....................................................... 46 2.2.6.3. Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào chất ............................................. 46 2.2.7. Đánh giá sự thay đổi cấu trúc khung xương tế bào ...................................... 47 2.2.7.1. Thu hoạch tế bào...................................................................................... 47
v 2.2.7.2. Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi ......... 47 2.2.7.3. Đánh giá biểu hiện mức dịch mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi ........... 48 2.2.7.4. Đánh giá sự tái cấu trúc bộ khung vi ống, vi sợi trong tế bào ................ 49 2.2.8. Phương pháp thống kê .................................................................................. 50 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 51 3.1. Đánh giá các chỉ thị marker của tế bào gốc trung mô ........................................ 51 3.2. Đánh giá sự tăng sinh tế bào .............................................................................. 52 3.2.1. Sự thay đổi mật độ tế bào ............................................................................. 52 3.2.2. Sự thay đổi chu kỳ tế bào .............................................................................. 53 3.2.2.1. Tỉ lệ các pha trong chu kỳ tế bào ............................................................. 53 3.2.2.2. Biểu hiện mức độ phiên mã các gene điều hòa chu kì tế bào .................. 54 3.2.2.3. Biểu hiện mức độ dịch mã các gene điều hòa chu kì tế bào .................... 55 3.3. Đánh giá quá trình apoptosis .............................................................................. 58 3.3.1. Tỉ apoptosis ................................................................................................... 58 3.3.2. Biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis ......................... 58 3.4. Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào ................................................................. 59 3.4.1. Sự thay đổi hình thái nhân ............................................................................ 59 3.4.2. Sự thay đổi hình thái tế bào chất .................................................................. 63 3.5. Đánh giá cấu trúc khung xƣơng tế bào .............................................................. 66 3.5.1. Biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi .............................. 66 3.5.2. Biểu hiện mức dịch mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi ................................ 67 3.5.3. Đánh giá sự tái cấu trúc bộ khung vi ống, vi sợi trong tế bào ..................... 67 3.6. Tóm tắt ảnh hƣởng của vi trọng lực mô phỏng lên tế bào hucMSC và phƣơng thức ức chế tăng sinh tế bào trong môi trƣờng vi trọng lực mô phỏng ..................... 73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 77 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ......................................................... 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 79 PHỤ LỤC
vi DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 7-AAD 7-amino-actinomycin 7-amino-actinomycin ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphate Bax Bcl-2-associated X protein Protein X liên kết Bcl-2 Bcl-2 B-cell lymphoma 2 Protein lymphoma tế bào B-2 bmMSC Bone marrow mesenchymal Tế bào gốc trung mô tủy xƣơng stem cell CDKs Cyclin-dependent kinases Kinase phụ thuộc cyclin DMEM Dulbecco's modified Eagle Môi trƣờng Dulbecco's modified medium Eagle DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic FBS Fetal bovine serum Huyết thanh thai bò GVHD Graft versus host disease Bệnh ghép chống chủ hucMSC Human umbilical cord Tế bào gốc trung mô cuống rốn mesenchymal stem cell ngƣời ISCT International Society for Hiệp hội liệu pháp tế bào quốc Cellular Therapy tế LSCM Laser scanning confocal Kính hiển vi quét laser đồng tiêu microscopy mRNA Messenger ribonucleic acid Axit ribonucleic thông tin MSC Mesenchymal stem cell Tế bào gốc trung mô NASA National Aeronautics and Cơ quan Hàng không và Vũ trụ Space Administration Hoa Kỳ OD Optical density Mật độ quang PBS Phosphate-buffered saline Phosphate-buffered saline Pen/Strep Penicillin-Streptomycin Penicillin-Streptomycin PI Propidium iodide Propidium iodide PS Phospholipid Màng phospholipid phosphatidylserine phosphatidylserine PVDF Polyvinylidene fluoride Polyvinylidene fluoride
vii qRT-PCR Quantitative reverse Phản ứng định lƣợng chuỗi transcription polymerase chain polymerase phiên mã ngƣợc reaction RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic RPM Random positioning machine Máy định vị ngẫu nhiên RWV Rotating wall vessel Buồng quay SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate– Điện di gel sodium dodecyl polyacrylamide gel sulfate–polyacrylamide electrophoresis SMG Simulated microgravity Vi trọng lực mô phỏng TEM Transmission electron Kính hiển vi truyền qua microscopy TUNEL Terminal dUTP Nick End- Kĩ thuật gắn nhãn cuối dUTP Labeling Nick ucMSC Umbilical cord mesenchymal Tế bào gốc trung mô cuống rốn stem cell
viii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Một số thiết bị chính sử dụng trong đề tài ................................................ 31 Bảng 2.2. Một số dụng cụ chính sử dụng trong đề tài .............................................. 31 Bảng 2.3. Môi trƣờng, hóa chất sử dụng trong đề tài ............................................... 32 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene điều hòa chu kì tế bào .............................................................................................................. 42 Bảng 2.5. Trình tự mồi các gene điều hòa chu kì tế bào .......................................... 42 Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene liên quan đến apoptosis ............................................................................................................. 45 Bảng 2.7. Trình tự mồi các gene liên quan đến apoptosis ........................................ 45 Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene mã hóa khung xƣơng tế bào ................................................................................................... 47 Bảng 2.9. Trình tự mồi các gene mã hóa khung xƣơng tế bào ................................. 47
ix DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Nguyên lý cơ bản của hệ thống clinostat 2D ............................................ 11 Hình 1.2. Mô hình clinostat 2D ................................................................................. 12 Hình 1.3. Mô hình clinostat 3D ................................................................................. 12 Hình 1.4. Mô hình buồng quay (rotating wall vessel-RWV) .................................... 13 Hình 1.5. Mô hình máy định vị ngẫu nhiên (RPM) .................................................. 14 Hình 1.6. Cấu trúc cuống rốn ở ngƣời ...................................................................... 16 Hình 1.7. Chu kỳ tế bào ............................................................................................ 18 Hình 1.8. Hình ảnh tế bào chuột biểu hiện apoptosis dƣới kính hiển vi quang học . 21 Hình 1.9. Hình ảnh tế bào tuyến ức dƣới kính hiển vi điện tử ................................. 22 Hình 1.10. Thành phần cấu trúc khung xƣơng tế bào .............................................. 28 Hình 2.1. Cấu trúc hệ thống máy clinostat 3D tạo môi trƣờng vi trọng lực mô phỏng33 Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu ........................................................... 35 Hình 2.3. Bình nuôi tế bào hucMSC trong thử nghiệm vi trọng lực ........................ 38 Hình 2.4. Đĩa 96 giếng chứa tế bào hucMSC trong thử nghiệm vi trọng lực ........... 38 Hình 2.5. Đĩa nuôi hucMSC đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp WST-1 .................. 39 Hình 2.6. Phƣơng pháp chuyển màng PVDF ........................................................... 43 Hình 3.1. Đánh giá biểu hiện marker ở hucMSC ...................................................... 51 Hình 3.2. Mật độ quang của hucMSC qua đánh giá bằng phƣơng pháp WST-1 ..... 52 Hình 3.3. Chu kì tế bào hucMSC qua phân tích flow cytometry ............................. 54 Hình 3.4. Biểu hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào bằng phƣơng pháp Realtime qRT-PCR........................................................................................... 54
x Hình 3.5. Biểu hiện mức dịch mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào bằng phƣơng pháp Western Blot ..................................................................................................... 55 Hình 3.6. Tỉ lệ tế bào sống và apoptosis ở hucMSC qua phân tích flow cytometry sử dụng phƣơng pháp nhuộm FITC Annexin V ............................................................ 58 Hình 3.7. Biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis ở hucMSC bằng phƣơng pháp Realtime qRT-PCR .................................................................... 59 Hình 3.8. Cƣờng độ nhân của hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App ............................................................................................................................ 60 Hình 3.9. Diện tích nhân của hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App60 Hình 3.10. Hình dạng nhân của hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App ............................................................................................................................ 61 Hình 3.11. Sự phân bố nhân trong mối tƣơng quan giữa hình dạng nhân và cƣờng độ nhân ở hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App .......................... 62 Hình 3.12. Sự phân bố nhân trong mối tƣơng quan giữa diện tích nhân và cƣờng độ nhân ở hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App ............................... 63 Hình 3.13. Hình thái tế bào chất của hucMSC.......................................................... 64 Hình 3.14. Giá trị FSC biểu thị kích thƣớc tế bào ở hucMSC .................................. 65 Hình 3.15. Biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi bằng phƣơng pháp Realtime qRT-PCR........................................................................................... 66 Hình 3.16. Biểu hiện mức dịch mã các protein cấu trúc vi sợi, vi ống bằng phƣơng pháp Western Blot ..................................................................................................... 67 Hình 3.17. Ảnh nhuộm huỳnh quang vi ống của hucMSC trong điều kiện bình thƣờng và điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG).................................................. 69 Hình 3.18. Ảnh nhuộm huỳnh quang vi sợi của hucMSC trong điều kiện bình thƣờng và điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG).................................................. 70 Hình 3.19. Kết quả đánh giá mật độ vi ống của hucMSC......................................... 71
xi Hình 3.20. Kết quả đánh giá mật độ vi sợi actin của hucMSC ................................. 72 Hình 3.21. Sơ đồ tóm tắt ảnh hƣởng của vi trọng lực mô phỏng lên sự tăng sinh tế bào hucMSC .............................................................................................................. 76
xii TÓM TẮT Sinh học trọng lực là ngành khoa học mới và thu hút đƣợc nhiều quan tâm. Các nghiên cứu ứng dụng hệ thống vi trọng lực mô phỏng tại mặt đất có ƣu điểm giúp tiết kiệm chi phí và giảm thiểu rủi ro về con ngƣời. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hệ thống clinostat 3D tạo môi trƣờng vi trọng lực mô phỏng (SMG) với gia tốc 1,3 × 10-3 G cảm ứng lên dòng tế bào gốc trung mô cuống rốn ngƣời (hucMSC). Tế bào hucMSC sau khi nuôi cấy tăng sinh và phân tích các marker đặc trƣng cho tính gốc đƣợc chia làm hai nhóm thí nghiệm: nhóm cảm ứng vi trọng lực mô phỏng (SMG) đƣợc nuôi ở điều kiện 1,3 × 10-3 G và nhóm đối chứng đƣợc nuôi ở điều kiện trọng lực bình thƣờng (1G). Các chỉ tiêu về tăng sinh, apoptosis, hình thái tế bào và cấu trúc khung xƣơng ở hucMSC đƣợc đánh giá. Kết quả đánh giá mật độ tế bào bằng phƣơng pháp WST-1 cho thấy hucMSC giảm tăng sinh trong điều kiện SMG (p ≤ 0,001). Hơn nữa, phân tích flow cytometry cho thấy các tế bào hucMSC ở nhóm SMG có xu hƣớng đi vào pha nghỉ G0/G1 nhiều hơn và giảm tỉ lệ đi vào pha phân chia G2/M (p ≤ 0,01). Thêm vào đó, biểu hiện của các protein liên quan đến chu kỳ tế bào nhƣ Cyclin A, CDK2, CDK4 và CDK6 đều giảm trong môi trƣờng SMG qua đánh giá bằng phƣơng pháp Realtime qRT-PCR và Western Blot. Trong nghiên cứu này, apoptosis đƣợc chứng minh là không làm ảnh hƣởng đến quá trình tăng sinh của hucMSC khi không tìm thấy sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê ở tỉ lệ apoptosis giữa hai nhóm thí nghiệm. Thay vào đó, sự giảm biểu hiện cả ở mức phiên mã và dịch mã của các protein cấu trúc khung xƣơng tế bào nhƣ β-actin và α-tubulin và các protein liên quan đến chu kỳ tế bào ở trên là nguyên nhân của sự giảm tăng sinh ở hucMSC trong môi trƣờng SMG. Bên cạnh làm thay đổi các protein điều hòa chu kỳ tế bào, điều kiện SMG đã làm giảm biểu hiện β-actin cấu trúc vi sợi và α-tubulin cấu trúc vi ống, từ đó ngăn chặn sự hình thành rãnh phân tách và thoi vô sắc cần thiết cho quá trình phân bào.
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trọng lực là một hằng số ảnh hưởng đến cả hiện tượng vật lý và sinh học trong quá trình phát triển sự sống trên Trái Đất. Trọng lực đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hóa hình thái của sinh vật. Để chống lại trọng lực, cơ thể sống cần phát triển các hệ thống hỗ trợ như xây dựng cấu trúc phù hợp, củng cố màng tế bào và điều chỉnh dòng chảy của chất lỏng trong cơ thể. Trong không gian, các phi hành gia đã trải qua những thay đổi sinh lý sâu sắc khi cơ thể họ phải điều chỉnh theo môi trường vi trọng lực. Tất cả các quá trình sinh lý trong cơ thể bị chi phối bởi hoạt động của nhiều loại tế bào chuyên biệt trong các mô khác nhau. Do đó, môi trường vi trọng lực được coi là phát huy tác dụng bất lợi đối với các phi hành gia thông qua những thay đổi trong cấu trúc và chức năng của tế bào. Chính vì những lý do trên, nghiên cứu về những ảnh hưởng của môi trường không gian đến cơ thể sinh vật là rất quan trọng, giúp giảm thiểu những rủi ro cho con người trong quá trình khám phá vũ trụ. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các loại tế bào ở những sinh vật khác nhau hoạt động khác nhau trong không gian so với trên Trái Đất. Do có sự đa dạng lớn về các loại tế bào trong tự nhiên, ảnh hưởng của vi trọng lực (microgravity) lên các tế bào đó vô cùng đa dạng và thường phức tạp. Một số nghiên cứu về vai trò của vi trọng lực đối với sự tăng sinh và biệt hóa tế bào đã chứng minh rằng các tế bào phát triển trong môi trường vi trọng lực phát triển khác với trong điều kiện bình thường dẫn đến những thay đổi trong quá trình phân chia tế bào. Khung xương tế bào (cytoskeleton) cũng là một trong những đối tượng chịu ảnh hưởng lớn dưới tác động của vi trọng lực. Bộ khung xương tế bào hình thành cấu trúc chính của tế bào và bao gồm các tương tác giữa các vi ống (microtubule), vi sợi (microfilament), vi sợi trung gian (intermediate filament) và các protein liên quan. Do đó, khung xương tế bào có liên quan rất lớn đến hình dạng tế bào. Sự bất thường trong hoạt động của các vi ống và vi sợi trong khung xương tế bào có thể có ảnh hưởng bất lợi lên bản thân mỗi tế bào, thậm chí gây những hậu quả rất lớn khi tế bào ở giai đoạn phôi. Các cơ chế của những thay đổi về tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào dưới tác động của vi trọng lực vẫn chưa được chứng minh rõ ràng.
2 Tác động của trọng lực lên nghiên cứu sinh học hiện có thể được thực hiện thông qua các chuyến bay vũ trụ hoặc mô phỏng trên mặt đất. Một số mô hình hệ thống vi trọng lực mô phỏng đã được thiết lập trên mặt đất như các hệ thống clinostat 2D, 3D, RPM (random position machine - máy định vị ngẫu nhiên), buồng quay và tháp rơi để nghiên cứu tác động của vi trọng lực trên mặt đất. Một trong những đối tượng nghiên cứu thường được sử dụng để đánh giá tác động của vi trọng lực mô phỏng là tế bào gốc trung mô, thường thấy là tế bào gốc trung mô từ tủy xương. Những thay đổi của tế bào gốc trung mô tủy xương trong môi trường vi trọng lực mô phỏng tạo ra bởi hệ thống clinostat 2D đã được báo cáo. Hệ thống quay 2D này đã được đưa vào ứng dụng từ lần giới thiệu đầu tiên năm 1879. Mặc dù mô hình này tạo ra vi trọng lực mô phỏng, nó cũng đi kèm với các hiệu ứng ngoài ý muốn. Vì lý do này, hệ thống clinostat 3D đã được phát triển để tạo ra môi trường vi trọng lực mô phỏng chính xác hơn. Tế bào gốc trung mô cuống rốn người (human mesenchymal stem cell - hucMSC) là dòng tế bào tiềm năng và việc thu nhận chúng không vấp phải nhiều vấn đề đạo đức như các dòng tế bào gốc trung mô từ nguồn khác. Tế bào gốc trung mô cuống rốn có khả năng tự làm mới trong khi vẫn duy trì tính đa tiềm năng. Ngoài ra, chúng còn thể hiện nhiều đặc tính miễn dịch lý thú, do đó được coi là một trong những đối tượng nghiên cứu hấp dẫn cho các ứng dụng điều trị khác nhau. Hiện nay, vẫn chưa có nhiều báo cáo về tác động của vi trọng lực lên tế bào gốc trung mô cuống rốn ở người, do đó nghiên cứu sử dụng dòng tế bào này làm đối tượng để đánh giá các ảnh hưởng của vi trọng lực. 2. Mục tiêu của đề tài Từ những lý do trên, nghiên cứu sử dụng hệ thống clinostat 3D để tạo ra môi trường vi trọng lực mô phỏng nhằm đánh giá tác động của điều kiện vi trọng lực lên sự tăng sinh và cấu trúc khung xương của tế bào gốc trung mô cuống rốn người (human mesenchymal stem cells - hucMSC). Mục tiêu của nghiên cứu là tìm ra phương thức tác động của điều kiện vi trọng lực mô phỏng lên sự phát triển của hucMSC, thông qua việc xác định các thay đổi về hình thái tế bào, sự tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào của hucMSC trong điều kiện in vitro. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3 Dòng tế bào gốc trung mô cuống rốn người (hucMSC) được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu của đề tài. Dòng tế bào này được cung cấp bởi Viện Sinh học nhiệt đới và được đánh giá các thay đổi về tăng sinh, hình thái tế bào, apoptosis và cấu trúc khung xương tế bào trong môi trường vi trọng lực mô phỏng tạo ra từ máy clinostat 3D. 4. Nội dung nghiên cứu Các nội dung chính của nghiên cứu bao gồm: ‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên sự tăng sinh tế bào hucMSC. ‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên quá trình apoptosis ở tế bào hucMSC. ‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên sự thay đổi hình thái nhân và tế bào chất ở tế bào hucMSC. ‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên bộ khung xương tế bào ở tế bào hucMSC. 5. Những đóng góp mới của luận án Đề tài được thực hiện theo hướng nghiên cứu mới về khoa học vũ trụ, ứng dụng hệ thống clinostat 3D để tạo ra môi trường vi trọng lực mô phỏng nhằm đánh giá tác động của vi trọng lực lên dòng tế bào hucMSC. Những đóng góp mới của luận án bao gồm: ‒ Nghiên cứu cho thấy điều kiện vi trọng lực mô phỏng làm giảm tăng sinh và làm thay đổi hình thái nhân, tế bào chất đồng thời tái cấu trúc bộ khung xương tế bào ở hucMSC. Sự chết theo chương trình của hucMSC không bị ảnh hưởng trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng. ‒ Nghiên cứu cũng đã mô tả hai phương thức ức chế tăng sinh của điều kiện vi trọng lực mô phỏng lên tế bào hucMSC: phương thức thứ nhất thông qua sự giảm biểu hiện các protein điều hòa chu kỳ tế bào Cyclin A, CDK2, CDK4, CDK6, từ đó cảm ứng tế bào đi vào pha G0/G1 và ngăn chặn tế bào đi vào pha phân chia G2/M; phương thức thứ hai thông qua sự giảm biểu hiện các
4 protein cấu trúc vi sợi và vi ống, làm ức chế sự hình thành thoi vô sắc và rãnh phân tách từ đó làm giảm sự phân chia tế bào.
5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vai trò của các nghiên cứu sinh học trong không gian Nghiên cứu Sinh học không gian là một phần quan trọng các chương trình vũ trụ của các trung tâm vũ trụ trên thế giới như NASA (Cục Hàng không và không gian quốc gia Mỹ), ESA (Cơ quan hàng không châu Âu), JAXA (Cơ quan thám hiểm không gian Nhật Bản). Sinh học không gian đã là một phần của chương trình Khoa học sự sống của NASA từ những năm 1960. NASA ngày càng tập trung vào việc ứng dụng các kỹ thuật tiên tiến hiện đại của công nghệ sinh học, sinh học phân tử, sinh học tế bào để nghiên cứu, khám phá và đánh giá tác động của các chuyến bay trong không gian lên quá trình sinh học. Với các hệ thống công cụ nghiên cứu mạnh của thế kỉ 21, các nhà khoa học sẽ nghiên cứu sâu hơn các cơ chế thích nghi của vi khuẩn, thực vật và động vật đối với môi trường không trọng lực. Điều này sẽ giúp chúng ta hiểu được những cách cơ bản mà các hệ thống sinh vật sử dụng trọng lực để điều hòa quá trình tăng trưởng, quá trình biến dưỡng, sinh sản và phát triển, cũng như hiểu được cách mà chúng sửa chữa các sai hỏng, bảo vệ chúng khỏi bệnh tật, truyền nhiễm. Trong các ngành khoa học được lựa chọn để nghiên cứu, Hội đồng nghiên cứu quốc gia của Mỹ đã đưa ra khuyến nghị nghiên cứu khoa học trong ấn phẩm “Chiến lược Y-Sinh học không gian trong thế kỉ mới” (năm 1998). Ở đây, Hội đồng kêu gọi NASA tập trung nghiên cứu sinh học không gian ở tất cả các cấp độ tổ chức sinh học, từ sinh học phân tử tế bào đến các mô, cơ quan cho đến toàn bộ hệ thống cơ thể dựa trên tất cả các phương pháp nghiên cứu hiện đại. Mục tiêu chính của chương trình nghiên cứu sinh học không gian của NASA bao gồm: - Sử dụng có hiệu quả các đặc tính môi trường vi trọng lực và không gian để nâng cao hiểu biết của chúng ta về sự thích ứng và chức năng của các quá trình sinh học cơ bản trong chuyến bay - Phát triển một nền tảng tri thức khoa học và công nghệ, sẽ góp phần đảm bảo sự an toàn của con người trong quá trình thăm dò không gian - Áp dụng kiến thức và công nghệ không gian để nâng cao khả năng cạnh tranh, giáo dục và chất lượng cuộc sống trên trái đất của người dân. - Các thí nghiệm Sinh học không gian của NASA giúp khám phá cách thức các chuyến bay tác động lên các vi sinh vật, thực vật và động vật trong suốt chu
6 trình sống của chúng. Các yếu tố trên không gian đã cho thấy chúng có ảnh hưởng đến các hệ thống sinh học bao gồm các trường trọng lượng cực tiểu, phóng xạ và từ trường, cũng như các tương tác và stress giữa các loài trong môi trường không gian. Chương trình Sinh học không gian đã được tập trung triển khai ở nhiều nước phát triển mạnh lĩnh vực hàng không không gian. Chương trình này tập trung vào các hướng chính như sau: - Vi sinh vật: nghiên cứu tác động của các chuyến bay không gian lên sự sống, tiến trình sinh học cũng như động lực phát triên của quần thể vi sinh vật - Sinh học phân tử tế bào: nghiên cứu tác động của các chuyến bay không gian lên sự sống mức phân tử và tế bào - Sinh học thực vật: Hiểu được cơ chế đáp ứng và tăng trưởng của thực vật trong các chuyến bay - Sinh học động vật: Xác định các cơ chế cơ bản mà động vật sử dụng để thích ứng với các chuyến bay, đặc biệt là khi trọng lực thay đổi - Sinh học phát triển, sinh sản và tiến hóa: Xác định các tác động của không gian lên sự phát triển, sinh sản và tiến hóa. Từ những ý nghĩa và mục tiêu trên, việc nghiên sinh học không gian đóng vai trò rất quan trọng trong lĩnh vực hàng không vũ trụ. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về tác động của điều kiện không gian (môi trường không trọng lực và vi trọng lực) lên các hệ thống sinh vật sống còn hạn chế bởi nhiều nguyên nhân, trong đó kinh phí thực hiện các thí nghiệm vẫn là nguyên nhân lớn nhất. Đây không chỉ là khó khăn mà chúng ta găp phải, đây cũng là vấn đề khó khăn ở cả các nước có ngành hàng không không gian phát triển như Mỹ, Nhật, châu Âu…Do đó, việc xây dựng, thiết kế các mô hình mô phỏng trạng thái vi trọng lực trong không gian sẽ không chỉ giải quyết vấn đề kinh phí thực hiện thí nghiệm, mà còn tiết kiệm, rút ngắn thời gian nghiên cứu, đánh giá tác động của môi trường vi trọng lực trong không gian lên các hệ thống sinh học. 1.2. Giới thiệu về vi trọng lực và vi trọng lực mô phỏng 1.2.1. Vi trọng lực Trong vũ trụ, các phi hành gia không thể đi lại bình thường như ở Trái Đất mà di chuyển lơ lửng trong không gian. Điều này là do vi trọng lực (microgravity).