Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở Việt Nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:169

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Nghiên cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở Việt Nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới" trình bày các nội dung chính sau: Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa ở người bệnh mắc xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam; Xác định được các biến thể mang tính di truyền theo phả hệ trong gia đình của người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở Việt Nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM Nguyễn Thị Thu Hường NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN Ở NGƯỜI BỆNH MẮC BỆNH XIRÔ NIỆU, RỐI LOẠN CHU TRÌNH CHUYỂN HÓA URÊ VÀ BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ Ở VIỆT NAM BẰNG CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Thu Hường NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN Ở NGƯỜI BỆNH MẮC BỆNH XIRÔ NIỆU, RỐI LOẠN CHU TRÌNH CHUYỂN HÓA URÊ VÀ BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ Ở VIỆT NAM BẰNG CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI Nghiên cứu biến đổi gen ở các Người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rốNam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Nguyễn Huy Hoàng 2. TS. Nguyễn Thị Kim Liên Hà Nội, 2022
i LỜI CAM ĐOAN Nghiên cứu sinh xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chính bản thân dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Nguyễn Huy Hoàng và TS. Nguyễn Thị Kim Liên. Những kết quả thu được trong luận án là mới, trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu Hường
ii LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu sinh xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Huy Hoàng, Viện trưởng Viện nghiên cứu hệ gen và TS. Nguyễn Thị Kim Liên, Phó Trưởng phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, định hướng và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu sinh trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như thực hiện luận án. Nghiên cứu sinh xin cảm ơn sự hỗ trợ, giúp đỡ, ủng hộ và tham gia nhiệt tình của các cán bộ thuộc Phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen; TS.BS.Vũ Chí Dũng và các bác sỹ Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương trong suốt thời gian thực hiện luận án. Bằng những tình cảm chân thành nhất, nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó. Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo; Cán bộ Phòng Quản lý tổng hợp, Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt, hỗ trợ nghiên cứu sinh thực hiện các thủ tục cần thiết để hoàn thành chương trình học tập và luận án. Nhân dịp này, nghiên cứu sinh cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, tập thể cán bộ giảng viên Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho nghiên cứu sinh trong quá trình học tập và nghiên cứu. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài thuộc Chương trình phát triển khoa học cơ bản trong lĩnh vực Hoá học, Khoa học sự sống, Khoa học trái đất và Khoa học biển giai đoạn 2017 - 2025, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Chương trình sau tiến sỹ tạo nguồn lực khoa học công nghệ cho Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm KHCNVN, nghiên cứu sinh xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ quý báu của Viện Hàn lâm KHCNVN. Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ, tạo điều kiện của Ban Giám hiệu Trường Đại học Hồng Đức, tập thể cán bộ, giảng viên Khoa Nông Lâm Ngư nghiệp và Phòng Quản lý đào tạo, Trường Đại học Hồng Đức đã ủng hộ, tạo điều kiện cho nghiên cứu sinh trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án. Cuối cùng, nghiên cứu sinh bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình, bố, mẹ, anh, chị, chồng, con, bạn bè đồng nghiệp đã luôn tin tưởng và là nguồn động viên tinh thần lớn lao đối với nghiên cứu sinh trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu Hường
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... vi DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... ix MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 1.1. Bệnh xirô niệu (MSUD) ....................................................................................... 3 1.1.1. Khái niệm .......................................................................................................... 3 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh ............................................................................................... 3 1.1.3. Di truyền phân tử .............................................................................................. 4 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán .................................................................. 6 1.1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh xirô niệu trên thế giới và ở Việt Nam ................... 7 1.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê ............................................................. 11 1.2.1. Khái niệm ........................................................................................................ 11 1.2.2. Cơ chế bệnh sinh.............................................................................................. 11 1.2.3. Di truyền phân tử ............................................................................................ 13 1.2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê trên thế giới và ở Việt Nam ................................................................................................................ 20 1.3. Bệnh loạn dưỡng cơ ........................................................................................... 26 1.3.1. Khái niệm ........................................................................................................ 26 1.3.2. Phân loại bệnh ................................................................................................. 26 1.3.3. Tình hình nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ trên thế giới và ở Việt Nam ........ 34 1.4. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) ..................................................... 38 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 41 2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 41 2.2. Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ người bệnh ...................................................... 42 2.2.1. Bệnh xirô niệu ................................................................................................. 42 2.2.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê .......................................................... 42 2.2.3. Bệnh loạn dưỡng cơ ........................................................................................ 43
iv 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 43 2.3.1. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................... 43 2.3.2. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 43 2.4. Đạo đức trong nghiên cứu .................................................................................. 43 2.5. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ .............................................................................. 44 2.6. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 44 2.6.1. Tách chiết DNA tổng số .................................................................................. 45 2.6.2. Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa bằng hệ thống Illumina ..................... 45 2.6.3. Sàng lọc các biến thể trên các gen chứa biến thể liên quan ............................ 48 2.6.4. Kiểm chứng biến thể có tiềm năng gây bệnh .................................................. 49 2.6.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh .............. 51 2.6.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) .......................... 54 2.6.7. Cơ sở dữ liệu ................................................................................................... 56 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 58 3.1. Bệnh xirô niệu (MUSD) ..................................................................................... 58 3.1.1. Kết quả lâm sàng ............................................................................................. 58 3.1.2. Tách chiết DNA tổng số .................................................................................. 59 3.1.3. Kết quả giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa ............................................... 59 3.1.4. Kiểm chứng biến thể ....................................................................................... 65 3.1.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh .............. 68 3.1.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) .......................... 73 3.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD) ................................................. 75 3.2.1. Kết quả lâm sàng ............................................................................................. 75 3.2.2. Tách chiết DNA tổng số .................................................................................. 76 3.2.3. Kết quả giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa................................................. 77 3.2.4. Kiểm chứng biến thể ........................................................................................ 81 3.2.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh .............. 84 3.2.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) .......................... 86 3.3. Bệnh loạn dưỡng cơ (MD) ................................................................................. 88
v 3.3.1. Kết quả lâm sàng ............................................................................................. 88 3.3.2. Tách chiết DNA tổng số .................................................................................. 89 3.3.3. Kết quả giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa ............................................... 89 3.3.4. Kiểm chứng biến thể ....................................................................................... 93 3.3.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh .............. 95 3.3.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) .......................... 97 CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN ..................................................................................... 99 4.1. Bệnh xirô niệu (MUSD) ..................................................................................... 99 4.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD) ............................................... 109 4.3. Bệnh loạn dưỡng cơ ......................................................................................... 116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 122 Kết luận ................................................................................................................... 122 Kiến nghị ................................................................................................................. 122 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ....................................................... 123 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ........................................................ 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 125 PHỤ LỤC ....................................................................................................................P
vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ tiếng Anh đầy đủ Nghĩa tiếng Việt dùng trong luận án aa Amino acid ACMG American Colleges of Medical Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di Genetics and Genomics truyền Y học Hoa Kỳ Di truyền gen trội trên nhiễm sắc thể AD Autosomal dominant thường Di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể AR Autosomal recessive thường ASL Argininosuccinic acid lyase ASS Argininosuccinic acid synthetase BCAA Brand chain amino acid Branched-chain ketoacid BCKDH Ketoacid dehydrogenase mạch nhánh dehydrogenase Branched-chain α ketoacid BCKDHA dehydrogenase Branched-chain β ketoacid BCKDHB dehydrogenase BDK BCKD kinase BDP BCKD phosphatase CK Creatine kinase CMD Congenital muscular dystrophy Loạn dưỡng cơ bẩm sinh CP Carbarmoyl phosphate CPSI Carbamyl phosphate synthetase I CSDL Cơ sở dữ liệu Dihydrolipoamide DBT dehydrogenase DD Distal muscular dystrophy Loạn dưỡng cơ vùng ngọn chi DLD Dihydrolipoamit transacylase DM Myotonic dystrophy Loạn dưỡng tăng trương lực cơ DNA Deoxyribonucleotide acid DQ Developmental quotient Chỉ số phát triển ExAC Exome aggregation consortium F Family Gia đình Facio -scapulo - humeral FSHD Loạn dưỡng cơ mặt -vai- cánh tay muscular dystrophy GATK Genome analysis toolkit HET Heterozygous Dị hợp tử hg19 Human genome assembly 19 HMM Hidden Markov model Mô hình thống kê Markov ẩn
vii HOM Homozygous Đồng hợp tử LAMA2 Laminine-2 LGMD Limb-girdle muscular dystrophy Loạn dưỡng cơ vùng gốc chi MAF Minor allele frequency Tần số allen MAF Minor allele frequency Tần số allen hiếm MD Muscular dystrophy Loạn dưỡng cơ MK Marker Thang chuẩn MRI Magnetic resonance imaging Hình ảnh cộng hưởng từ MSUD Maple syrup urine disorder Bệnh xirô niệu NAG N-acetylglutamate NGS Next generation sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới NST Nhiễm sắc thể OTC Orinithinetranscarbamylase PM Pathogenic moderate Gây bệnh mức trung bình PolyPhen-2 Polymorphism phenotyping v2 PP Pathogenic supporting Gây bệnh mức hỗ trợ PS Pathogenic strong Gây bệnh mạnh PVS Pathogenic very strong Gây bệnh rất mạnh Q Quality Chất lượng RI Reliability index Chỉ số độ tin cậy RNA Ribonucleic acid SIFT Sorting intolerant from tolerant SMG Serine-methionine-glycine SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình đơn Single strand conformation SSCP Đa hình sợi đơn polymorphism STR Short tandem repeat STT Số thứ tự TLTK Tài liệu tham khảo UCD Urea cycle disorder Rối loạn chu trình chuyển hóa urê WES Whole exome sequencing Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các gen liên quan đến bệnh xirô niệu…………………………………….4 Bảng 2.1. Thông tin về người bệnh và gia đình ........................................................41 Bảng 2.2. Điểm chất lượng .......................................................................................47 Bảng 2.3. Trình tự các đoạn mồi ...............................................................................50 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt khuếch đại từng vùng gen ...............................................51 Bảng 2.5. Quy tắc phân loại biến thể trên cơ sở kết hợp các tiêu chí .......................56 Bảng 3.1. Thông tin lâm sàng và cận lâm sàng của người bệnh mắc xirô niệu ........58 Bảng 3.2. Thông tin đọc trình tự của người bệnh R01, R02, R03, R04 .....................61 Bảng 3.3. Kết quả phân tích và dự đoán biến thể trong toàn bộ vùng gen mã hóa ở người bệnh R01, R02, R03, R04 ...............................................................................62 Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc biến thể có tiềm năng gây bệnh ở người bệnh R01, R02, R03, R04....................................................................................................................63 Bảng 35. Phân tích tiềm năng gây bệnh của các biến thể ở người bệnh R01, R02, R03, R04 bằng một số công cụ tin sinh ....................................................................70 Bảng 3.6. Phân loại các biến thể tiềm năng gây bệnh MUSD theo tiêu chí của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) ...................................73 Bảng 3.7. Thông tin lâm sàng và cận lâm sàng của người bệnh mắc rối loạn chu trình chuyển hóa urê ..................................................................................................76 Bảng 3.8. Thông tin đọc trình tự của người bệnh R05, R06, R07 ..............................78 Bảng 3.9. Kết quả phân tích và dự đoán biến thể trong toàn bộ vùng gen mã hóa của người bệnh R05, R06, R07 ........................................................................................79 Bảng 3.10. Kết quả sàng lọc biến thể tiềm năng gây bệnh ở người bệnh R05, R06, R07 ............................................................................................................................80 Bảng 3.11. Kết quả phân tích biến thể IVS7+1G>A bằng phần mềm MaxEntScan::score5ss ...............................................................................................85 Bảng 3.12. Phân tích ảnh hưởng của biến thể thay thế c.365A>T; p.E122V trên gen OTC bằng một số công cụ tin sinh .............................................................................85 Bảng 3.13. Phân loại tiềm năng gây bệnh UCD của các biến thể theo tiêu chí của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) ..........................87 Bảng 3.14. Thông tin lâm sàng và cận lâm sàng của người bệnh mắc loạn dưỡng cơ88 Bảng 3.15. Thông tin đọc trình tự của người bệnh R08, R09 và Bố, Mẹ ...................91 Bảng 3.16. Kết quả phân tích và dự đoán biến thể trong toàn bộ vùng gen mã hóa của người bệnh R08, R09 và Bố, Mẹ ...............................................................................92 Bảng 3.17. Kết quả sàng lọc biến thể có tiềm năng gây bệnh loạn dưỡng cơ ..........93 Bảng 3.18. Phân tích ảnh hưởng của 02 biến thể c.778C>T (p.H260Y) và c.2987G>A (p.C996Y) trên gen LAMA2 bằng một số công cụ tin sinh ...................95 Bảng 3.19. Phân loại các biến thể ở người bệnh loạn dưỡng cơ theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) ..........................98 Bảng 4.1. Các biến thể thay thế đã được công bố tại exon 10 của gen BCKDHB..101 Bảng 4.2. Các biến thể thay thế đã được công bố tại exon 9 của gen BCKDHB....104 Bảng 4.3. Các biến thể thay thế đã được công bố tại exon 1 của gen BCKDHB....106 Bảng 4.4. Các biến thể thay thế đã được công bố tại exon 4 của gen OTC ............113
ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Quá trình phân giải các amino acid mạch nhánh (BCAA) .........................4 Hình 1.2. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHA ...................................5 Hình 1.3. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHB ...................................5 Hình 1.4. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DBT ............................................5 Hình 1.5. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DLD............................................6 Hình 1.6. Chu trình Urê.............................................................................................12 Hình 1.7. Cấu trúc gen CPS1 ....................................................................................13 Hình 1.8. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen NAGS........................................14 Hình 1.9. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen ASS1 .........................................15 Hình 1.10. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen SLC25A13 ..............................16 Hình 1.11. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen ASL .........................................16 Hình 1.12. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen ARG1 ......................................18 Hình 1.13. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen SLC25A15 ..............................18 Hình 1.14. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen OTC ........................................19 Hình 1.15. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen LAMA2 ...................................33 Hình 2.1. Sơ đồ chi tiết quy trình nghiên cứu ...........................................................45 Hình 2.2. Quy trình phân tích và chú giải biến thể ...................................................47 Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose 1% của người bệnh R01, R02, R03, R04 và các thành viên trong gia đình ..............................................59 Hình 3.2. Phả hệ và các biến thể trên gen BCKDHB ở gia đình người bệnh R01 ....65 Hình 3.3. Phả hệ và các biến thể trên gen BCKDHB ở gia đình người bệnh R02 ....66 Hình 3.4. Phả hệ và các biến thể trên gen BCKDHB ở gia đình người bệnh R03 ....67 Hình 3.5. Phả hệ và biến thể trên gen DBT ở gia đình người bệnh R04 ...................68 Hình 3.6. Kết quả phân tích các biến thể trên gen BCKDHB, DBT bằng một số công cụ tin sinh. (a) PON-P2, (b) PROVEAN, (c) PANTHER, (d) Fathmm. ..................69 Hình 3.7. Gióng hàng trình tự amino acid bị thay thế xung quanh vị trí biến thể giữa các loài.......................................................................................................................71 Hình 3.8. Cấu trúc 3D của protein BCKDHB xung quanh các vị trí biến thể ..........72 Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose 1% của người bệnh R05, R06, R07 và các thành viên trong gia đình. .....................................................77 Hình 3.10. Phả hệ và biến thể trên gen OTC ở gia đình người bệnh R05 ................82
x Hình 3.11. Phả hệ và biến thể trên gen OTC ở gia đình người bệnh R06 ................83 Hình 3. 2. Phả hệ và biến thể trên gen OTC ở gia đình người bệnh R07 .................84 Hình 3.13. Gióng hàng trình tự amino acid bị thay thế xung quanh vị trí biến thể giữa các loài ..............................................................................................................86 Hình 3.14. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose 1% của người bệnh loạn dưỡng cơ R08, R09 và Bố Mẹ...........................................................................89 Hình 3.15. Phả hệ và biến thể trên gen LAMA2 ở gia đình người bệnh R08, R09 ...94 Hình 3.16. Phân tích biến thể p.H260Y và p.C996Y trên gen LAMA2 ....................96 Hình 3.17. Dự đoán các liên kết disulfide của biến thể p.H260Y và p.C996Y trên chuỗi polypeptide của protein LAMA2 bằng công cụ ScanProsite. .........................97
1 MỞ ĐẦU Tại Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có một cuộc điều tra hay thống kê chính thức về các bệnh hiếm gặp. Hiện nay, Việt Nam có duy nhất một câu lạc bộ dành cho các người bệnh mắc bệnh hiếm tại Bệnh viện Nhi Trung ương, được thành lập vào ngày 11/11/2014. Ngày 16/5/2019, Bộ Y tế tổ chức phiên họp đầu tiên của Hội đồng tư vấn về quản lý bệnh hiếm. Theo số liệu của Bộ Y tế, Việt Nam có khoảng 6 triệu người đang sống chung với các căn bệnh hiếm. Trong đó, hơn 50% trường hợp phát hiện bệnh hiếm là ở trẻ em, có tới 30% trẻ mang bệnh tử vong trước 5 tuổi và được xếp hàng thứ hai trong các nguyên nhân gây tử vong sơ sinh tại Việt Nam. Thêm vào đó, 80% các hội chứng hiếm gặp có nguyên nhân di truyền và trẻ sẽ mắc bệnh suốt đời. Bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ là ba trong những bệnh hiếm gặp ở trẻ nhỏ. Giai đoạn khởi phát bệnh các bệnh này phụ thuộc vào mức độ nghiêm trọng khác nhau của bệnh. Do đó, việc chẩn đoán sớm và chính xác nguyên nhân gây bệnh là cơ sở để đưa ra các liệu pháp điều trị phù hợp, hạn chế được những biến chứng nghiêm trọng. Tuy nhiên, mức độ nghiêm trọng và phổ lâm sàng rộng cùng với số lượng người bệnh hạn chế là các lý do gây khó khăn cho các bác sĩ và chuyên gia y tế trong việc đưa ra các chẩn đoán chính xác. Giải trình tự Sanger là phương pháp thường được sử dụng trong chẩn đoán các bệnh di truyền nói chung và bệnh hiếm gặp nói riêng. Công việc này cần được thực hiện trên tất cả các gen liên quan đến bệnh, do đó tiêu tốn nhiều thời gian và cần đến chi phí lớn. Năm 2005, sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) cho phép phân tích đồng thời nhiều hoặc thậm chí tất cả các gen, nhờ đó có thể khắc phục được nhược điểm nêu trên. Trong đó, phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES), một trong những ứng dụng của NGS, đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc xác định gen gây bệnh theo di truyền Mendel do vùng gen mã hóa chỉ chiếm 1% hệ gen nhưng số lượng bệnh do biến thể nằm trong vùng này lên tới 85%. Thực tế đã chứng minh, hàng chục nghìn biến thể gen đã được xác định trong vùng gen mã hóa ở nhiều người mắc bệnh phức tạp như: tim mạch, thần kinh, chuyển hóa…. Trên cơ sở đó, phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES) được sử dụng để xác định nguyên nhân di truyền ở các người mắc bệnh xirô niệu, rối
2 loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ ở Việt Nam. Kết quả thu được có thể là cơ sở hỗ trợ các bác sĩ đưa ra liệu pháp điều trị thích hợp cho người bệnh và đề xuất các phương án tư vấn di truyền cho gia đình người bệnh. Xuất phát từ những lý do nêu trên nghiên cứu sinh đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở Việt Nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới”. Mục tiêu nghiên cứu - Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa ở người bệnh mắc xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam; - Xác định được các biến thể mang tính di truyền theo phả hệ trong gia đình của người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu 1. Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu một số người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê, loạn dưỡng cơ và các thành viên trong gia đình. 2. Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa của một số người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ. 3. Phân tích số liệu, phát hiện các đột biến di truyền trên các gen liên quan đến bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ. 4. Phân tích in silico dự đoán ảnh hưởng của các đột biến đến chức năng protein tương ứng.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Bệnh xirô niệu (MSUD) 1.1.1. Khái niệm Bệnh xirô niệu (MSUD) là một rối loạn chuyển hóa hiếm gặp, di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Cơ thể của người bệnh không thể chuyển hóa được các amino acid mạch nhánh (BCAA) bao gồm leucine, isoleucine và valine. Sự tích tụ của các amino acid này trong nước tiểu tạo ra mùi đặc trưng và là nguồn gốc tên của bệnh. Nếu không được điều trị kịp thời, bệnh có thể tiến triển đến co giật, hôn mê và thậm chí tử vong sớm, thường trước 3 tháng tuổi. Xirô niệu là bệnh hiếm gặp với tỷ lệ mắc ước tính khoảng 1/185.000 trên toàn thế giới [1]. Tuy nhiên, ở các quốc gia có tỷ lệ hôn nhân cận huyết cao, con số này có thể lớn hơn [2]. Đến nay, tỷ lệ mắc bệnh xirô niệu ở Việt Nam chưa được thống kê đầy đủ và chính thức. 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh Bệnh xirô niệu gây ra do biến thể xuất hiện trên gen BCKDHA, BCKDHB, DBT và DLD, mã hóa tương ứng cho các tiểu đơn vị E1α, E1β, E2, E3 của phức hợp α-ketoacid dehydrogenase mạch nhánh (BCKD). Phức hợp BCKD xúc tác quá trình khử carboxyl hóa các α-ketoacid mạch nhánh, bước thứ hai trong quá trình phân giải các amino acid mạch nhánh. Biến thể trên các gen mã hóa làm suy giảm hoặc mất chức năng của phức hợp, từ đó dẫn đến sự tích tụ các amino acid mạch nhánh như leucine, isoleucine, valine trong máu và các α-ketoacid mạch nhánh trong máu và nước tiểu [3]. Sự tích lũy các chất này có thể gây tổn thương hệ thần kinh thông qua việc ngăn cản quá trình tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh quan trọng và quá trình myelin hóa xảy ra ở các tế bào thần kinh [3]. Leucine, isoleucine, valine là 03 amino acid thiết yếu, không thể tự tổng hợp ở động vật có vú và được đưa vào cơ thể qua đường thức ăn. Do BCAA cần thiết cho quá trình tổng hợp protein, các acid béo mạch nhánh, chất dẫn truyền thần kinh nên quá trình dị hóa các BCAA được kiểm soát chặt chẽ, thông qua phức hợp enzyme BCKD. Bước đầu tiên trong quá trình dị hóa BCAA là chuyển nhóm amin của leucine, isoleucine, valine cho α-ketoglutarate (α-KG) tạo thành glutamate và các ketoacid mạch nhánh (BCKA) tương ứng bao gồm α-ketoisocaproate (KIC), α keto- methylvalate (KMV), α-ketoisovalerate (KIV), với sự xúc tác của aminotransferase
4 (Hình 1.1). Bước tiếp theo là quá trình khử carboxyl oxy hóa thông qua phức hợp BCKD. Ở người mắc bệnh xirô niệu, bước này bị gián đoạn. Hình 1.1. Quá trình phân giải các amino acid mạch nhánh (BCAA) [4] Quá trình chuyển gốc amin của BCAA được thực hiện nhờ vào vai trò xúc tác của aminotransferase tạo sản phẩm là các ketoacid mạch nhánh (BCKA): α-ketoisocaproate (KIC), α-keto-β-methylvalerate (KMV), α-ketoisovalerate (KIV) (phản ứng 1). Quá trình khử carboxyl oxi hóa của các ketoacid mạch nhánh (BCKA) được thực hiện nhờ phức hợp a-ketoacid dehydrogenase mạch nhánh (BCKD) (phản ứng 2) [4]. 1.1.3. Di truyền phân tử BCKD là enzyme điều hòa quan trọng nhất trong con đường dị hóa của các BCAA, nằm trong ty thể, gồm 03 thành phần xúc tác decarboxylase E1, dihydrolipoyl transacylase E2, dihydrolipoamide dehydrogenase E3 và 02 enzyme điều hòa (BCKD kinase, BCKD phosphatase) [5]. Các thành phần E1 (02 tiểu đơn vị α và 02 tiểu đơn vị β), E2 và E3 được mã hóa lần lượt bởi các gen BCKDHA, BCKDHB, DBT, DLD đều nằm trong nhân (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Các gen liên quan đến bệnh xirô niệu Gen Vị trí Số amino acid Số exon BCKDHA 19q13.2 445 9 BCKDHB 6q14.1 392 11 DBT 1q21.2 482 11 DLD 7q31.1 486 11 Thành phần E1, được tạo nên từ 02 tiểu phần E1α và 02 tiểu phần E1β. Gen mã hóa cho tiểu đơn vị E1α, BCKDHA, nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể 19 tại
5 vị trí 19q13.2 (Hình 1.2). Gen BCKDHA gồm 9 exon, mã hóa cho một mRNA 1,6 kb và được dịch mã thành 378 aa với một trình tự dẫn đầu dài 45 aa. Hình 1.2. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHA (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp) Gen BCKDHB mã hóa cho tiểu đơn vị E1β nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 6 tại vị trí 6q14.1, gồm 11 exon, mã hóa cho một mRNA 1,4 kb và dịch mã thành 342 aa với một trình tự dẫn đầu dài 50 aa (Hình 1.3). Hình 1.3. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHB (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp) Thành phần E2, là một dihydrolipoyl transacylase (DBT), tồn tại dưới dạng homo-24mer hình bát giác đối xứng trong phức hợp BCKD, giữ vai trò như là “lõi” chức năng của phức hợp do sự có mặt của các vùng lipoyl. Thành phần này hoạt động như cánh tay xoay dài để chuyển giao, tiếp nhận các chất trung gian giữa các trung tâm hoạt động hoặc tiểu đơn vị khác của phức hợp. Gen mã hóa cho thành phần E2, DBT, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 1 tại vị trí 1p21.2 (Hình 1.4). Gen DBT gồm 11 exon, mã hóa cho một mRNA 1,46 kb và dịch mã thành 421 amino acid với một trình tự dẫn đầu có kích thước 56 aa. Hình 1.4. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DBT (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp)
6 Thành phần E3, tồn tại như một homodimer trong phức hợp BCKD. Gen mã hóa cho thành phần E3, DLD, nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 7 tại vị trí 7q31.1 (Hình 1.5). Gen DLD gồm 11 exon, mã hóa 02 mRNA 2,2 kb và 2,4 kb, dịch mã thành 509 aa với một trình tự dẫn đầu có chiều dài không xác định. Thành phần E1 và E2 xuất hiện duy nhất trong phức hợp BCKD, trong khi thành phần E3 có mặt trong hai enzyme ty thể khác (pyruvate dehydrogenase và phức hợp α- ketoglutarate dehydrogenase, giữ vai trò quan trọng trong chu trình Krebs). Thành phần này còn được gọi là protein L của hệ thống phân cắt glycine ty thể. Hình 1.5. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DLD (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp) 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán Dựa vào triệu chứng lâm sàng, MSUD được phân loại thành 05 kiểu, không có mối tương quan chặt chẽ giữa kiểu gen và kiểu hình bao gồm kiểu cổ điển, trung gian, không liên tục, đáp ứng thiamine và thiếu E3. Bệnh xirô niệu kiểu cổ điển và kiểu thiếu E3 thường khởi phát ngay trong thời kỳ sơ sinh, trong khi các kiểu còn lại có thể xuất hiện bất cứ giai đoạn nào khi người bệnh phải đối mặt với các yếu tố stress. Các triệu chứng lâm sàng của MSUD phụ thuộc vào mức độ hoạt động của phức hợp BCKD. Ở người bệnh kiểu cổ điển, hoạt tính của BCKD < 2%, mùi xirô xuất hiện trong ráy tai ngay sau khi sinh và trong nước tiểu ở tuần đầu tiên [4]. Nếu không được điều trị kịp thời, các triệu chứng ở trẻ sơ sinh có thể tiến triển thành cáu kỉnh, thờ ơ, bú kém, ngưng thở, thậm chí hôn mê và tử vong sớm do phù não. Ở những người lớn tuổi, tăng leucine gây ra hiện tượng đau, chán ăn, nôn, mệt mỏi cơ, thay đổi mức độ của ý thức, các triệu chứng tâm thần, rối loạn vận động và mất điều hòa. Trong thời kỳ dị hóa protein nội sinh (sốt, nhiễm trùng, vận động quá sức, chấn thương hoặc phẫu thuật), những người mắc bệnh xirô niệu có thể bị suy thoái thần kinh do nhiễm độc leucine cấp tính [2] . Hoạt tính của enzyme BCKD ở những người mắc bệnh xirô niệu kiểu trung
7 gian lên tới 30%. Những người này có thể có biểu hiện khỏe mạnh trong thời kỳ sơ sinh, mặc dù có thể có mùi xirô trong ráy tai. Trong những năm đầu đời, người bệnh có thể gặp phải các vấn đề về ăn uống, kém tăng trưởng về thể chất, thiểu năng trí tuệ và dễ mắc các triệu chứng thần kinh tương tự như người mắc MUSD thể cổ điển. Người mắc bệnh xirô niệu kiểu không liên tục, thường không xuất hiện triệu chứng. Sự phát triển về thể chất và thần kinh ở người bệnh kiểu này bình thường ngay cả khi không áp dụng chế độ ăn kiêng. Ở các trạng thái dị hóa, các đặc điểm lâm sàng và sinh hóa của người bệnh có thể tương tự như người mắc bệnh thể cổ điển, do đó, người bệnh cần được kiểm soát tương tự như người bệnh ở thể nặng. Bệnh xirô niệu kiểu đáp ứng với thiamine là một kiểu hình hiếm gặp liên quan đến các biến thể gây bệnh trên gen DBT mã hóa tiểu đơn vị E2 của phức hợp BCKD. Người bệnh có các triệu chứng tương tự như bệnh xirô niệu kiểu trung gian, thường được điều trị bằng cách kết hợp giữa chế độ ăn kiêng BCAA và bổ sung thiamine. Tuy nhiên, đã từng xuất hiện người bệnh đáp ứng đầy đủ với thiamine nhưng không cần đến chế độ ăn kiêng. Hoạt động của protein DBT liên quan đến 03 phức hợp enzyme ty thể bao gồm phức hợp alpha-ketoacid dehydrogenase (BCKD), α-ketoglutarate dehydrogenase (αKGDH) và pyruvate dehydrogenase (PDH). Vì vậy, người bệnh MUSD thiếu E3 có phổ kiểu hình rộng, từ các biểu hiện thần kinh khởi phát sớm đến bệnh gan khởi phát ở người trưởng thành. Bệnh thường gặp nhất là thể nặng với các triệu chứng lâm sàng như nhiễm toan chuyển hóa, bệnh não, khó khăn trong việc ăn uống, suy gan và tử vong sớm. Bên cạnh đó, người mắc bệnh xirô niệu còn tăng nồng độ lactate, alanine và α-ketoglutarate, là các yếu tố có liên quan đến sự rối loạn chức năng ty thể [6]. Người bệnh có biểu hiện rối loạn chức năng gan có thể đi kèm với các dấu hiệu và triệu chứng ở mọi lứa tuổi, các đợt tái phát của bệnh gan giảm dần theo tuổi, thường bị kích hoạt bởi trạng thái tăng chuyển hóa. 1.1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh xirô niệu trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Từ phát hiện đầu tiên của Menkes và cộng sự (1954) đến nay, nhiều nghiên cứu về bệnh MUSD đã được tiến hành ở các quốc gia trên thế giới. Năm 1960, sự sai hỏng trong quá trình khử các α-ketoacid mạch nhánh có nguồn gốc từ leucine, isoleucine, valine được phát hiện là nguyên nhân gây bệnh MUSD. Từ các dòng tế
8 bào được chọn ngẫu nhiên của 63 người bệnh MUSD, Nellis và Danner (2001) xác định được tần suất biến thể ở gen mã hóa cho tiểu đơn vị E1α, E1β, E2 tương ứng là 33%, 38%, 19% [7]. Phân tích tiền sử gia đình và xét nghiệm biến thể p.Y393N trên gen BCKDHA, nhóm nghiên cứu của Morton (20022) phát hiện được 36/219 người mắc MUSD trong 11 năm (1990-2001) [8]. Bảy biến thể trong đó 01 biến thể trên BCKDHA (p.C219W); 04 biến thể trên BCKDHB (p.H156Y, p.V69G, IVS9del3bp, c.1109ins8bp) và 02 biến thể trên DBT (p.H391R, p.S133X) được tìm thấy ở các người bệnh MUSD, người Isreal bằng phương pháp phân tích hoạt tính và cấu trúc của enzyme [9]. Kết quả giải trình tự bộ gen DBT ở 13 gia đình người Philippine mắc bệnh MUSD sàng lọc được 01 biến thể mất đoạn lớn gây ra bởi sự tái tổ hợp không tương đồng giữa đoạn lặp L1 ở intron 10 và đoạn lặp Alu ở exon 11, dẫn đến đoạn mRNA 239 bp được chèn vào phía sau exon 10, tạo đuôi exon mới [10]. Năm 2005, phương pháp khối phổ được sử dụng phát hiện nồng độ BCAA tăng cao trong máu, cho phép phát hiện bệnh MUSD 24 - 48 giờ sau sinh, trước khi xuất hiện các triệu chứng của bệnh não. Vì thế, người bệnh có thể được can thiệp kịp thời mà không cần đến sử dụng đến các chất giải độc tố ngoại sinh, nhờ đó giảm nguy cơ tổn thương não trong giai đoạn đặc biệt dễ bị tổn thương đồng thời giảm đáng kể chi phí điều trị. Sàng lọc bằng phương pháp giải trình tự Sanger ở 33 người Tây Ban Nha, 15 biến thể trên BCKDHA, 14 biến thể trên BCKDHB và 7 biến thể trên DBT được phát hiện [11]. Bằng phương pháp giải trình tự Sanger, 15 người bệnh MUSD từ Đức, Áo, Thụy Sỹ được giải trình tự các gen BCKDHA, BCKDHB, DBT và phát hiện được 06 biến thể thay thế trên BCKDHA, 10 biến thể trên BCKDHB và 04 biến thể trên DBT [12]. Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng lớp mỏng, 21 người bệnh người Philippine (10 bé trai, 11 bé gái, từ 2 - 14 ngày tuổi) được chẩn đoán MUSD trong giai đoạn 1999 - 2004 [13]. Phương pháp so sánh nồng độ leucine trong máu khô và huyết tương được áp dụng thành công để phân biệt các kiểu MUSD ở 19 trẻ sơ sinh ở Đức và Áo trong giai đoạn 1999 - 2005 [14]. Phương pháp Sanger được sử dụng để giải trình tự tất cả exon của các gen BCKDHA, BCKDHB, DBT ở nhóm 32 người mắc MUSD thể cổ điển nặng và nhẹ, người Thổ Nhĩ Kỳ. Kết quả phát hiện được 27 biến thể, hầu hết ở dạng đồng hợp tử (chiếm 92%), cụ thể 12 biến thể trên BCKDHA (37% số người bệnh), 10 biến thể trên BCKDHB (chiếm 44% số người bệnh), 05 biến thể trên DBT (chiếm 19% số người bệnh) [15]. Một biến thể