Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)" được nghiên cứu với mục tiêu: Đánh giá được khả năng tái sinh và tiếp nhận gen của các giống đậu tương Việt Nam phục công tác chuyển gen; Thiết kế thành công vector chuyển gen mang gen đích (gen Atore1) có khả năng nâng cao năng suất hạt thông qua việc kéo dài tuổi thọ của bộ lá ở cây đậu tương.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------- NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƢỚNG NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG (GLYCINE MAX (L.) Merr.) Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hà Nội - 2023
Công trình đƣợc hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Khuất Hữu Trung 2. GS.TS. Ngô Xuân Bình Phản biện 1: ................................................................................ Phản biện 2: ................................................................................ Phản biện 3: ................................................................................ Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện Họp tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi……giờ……,ngày……tháng……năm 2023. Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư Viện Quốc gia 2. Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ở Việt Nam, đậu tương được xếp vào nhóm cây trồng quan trọng thứ ba sau lúa và ngô. Tuy nhiên nhưng năm gần đây diện tích đậu tương của Việt Nam giảm mạnh, tính đến năm 2021, sản lượng và diện tích đậu tương giảm 70-75% so với năm 2010. Nguyên nhân chủ yếu của tình trạng này là do năng suất đậu tương của Việt Nam rất thấp chỉ đạt 1,5 tấn/ha (bằng ½ năng suất trên thế giới). Vì vậy, Việt Nam thiếu hụt 3,5 - 5 triệu tấn đậu tương/năm, phải nhập khẩu với kim ngạch 2 - 3 tỉ USD/năm, gần tương với giá trị xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam hiện nay. Thực tế trên cho thấy, để phát triển sản xuất đậu tương, Việt Nam cần đầu tư đẩy mạnh nghiên cứu tạo các giống đậu tương có năng suất cao đảm bảo sản xuất có hiệu quả thay thế nhập khẩu. Cây đậu tương là cây trồng chuyển gen được trồng ở nhiều quốc gia, đến năm 2021 diện tích đậu tương chuyển gen lên đến gần 100 triệu ha, chiếm 50% tổng diện tích cây trồng chuyển gen trên thế giới, chiếm 78% diện tích canh tác đậu tương toàn cầu. Các tính trạng phổ biến ở cây đậu tương chuyển gen là: kháng sâu, kháng, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, nâng cao hàm lượng dầu [10]. Xu hướng hiện nay chuyển gen ở cây đậu tương nói riêng và cây trồng nói chung đó là tiếp tục cải biến di truyền với các tính trạng chống chịu và nhất là các tính trạng nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng. Một trong những hướng chọn tạo giống cho năng suất cao những năm gần đây được nhiều nhà chọn giống quan tâm đó là kéo dài thời gian sinh trưởng của bộ lá bằng cách đưa gen xác định tính trạng “trẻ lâu” (juvenile trait) vào các giống chín sớm thông qua lai tạo hoặc cải biến di truyền bằng chuyển gen/chỉnh sửa gen [48], [51]. Năm 1997, tác giả Oh và cs đã phân lập được 5 dòng gen đột biến của gen ORE1 từ cây Arabidopsis (lần lượt được đặt tên là: ore 1, 2, 3, 9 và 11) có biểu hiện kéo dài tuổi thọ của bộ lá và nâng cao năng suất hạt [105]. Năm 2015, trường Đại học DongA (Hàn Quốc) đã thành công trong việc chuyển gen Ore1 vào cây lúa, kết quả là làm
2 năng suất lúa 15-25%. Trên cơ sở những kiến thức hiểu biết trước đó, chúng tôi đã xác định hướng nghiên cứu chuyển gen ore1 vào cây đậu tương và tiến hành đề tài “N n u u ển n t o ớn n n o n n su t ạt ở đậu t ơn (Glycine max (L.) Merr.)”. Kết quả của đề tài có ý nghĩa quan trọng, góp phần phát triển kỹ thuật cải biến di truyển tạo ra các giống đậu tương có năng suất cao phục vụ sản xuất. 2. Mục tiêu của đề tài 2.1. Mụ t u tổn quát Nghiên cứu chuyển gen tạo các dòng đậu tương mang gen kìm hãm già hoá của bộ lá (gen Atore1) theo hướng nâng cao năng suất hạt trên giống đậu tương của Việt Nam. 2.2. Mụ t u ụ t ể - Đánh giá được khả năng tái sinh và tiếp nhận gen của các giống đậu tương Việt Nam phục công tác chuyển gen. - Thiết kế thành công vector chuyển gen mang gen đích (gen Atore1) có khả năng nâng cao năng suất hạt thông qua việc kéo dài tuổi thọ của bộ lá ở cây đậu tương. - Tạo được các dòng đậu tương chuyển gen mang gen đích Atore1 và bước đầu đánh giá được biểu hiện của gen ở các dòng đậu tương chuyển gen. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý n ĩ k o ọ - Kết quả của luận án là tiền đề cho việc ứng dụng kỹ thuật di truyền hiện đại (chuyển gen, chỉnh sửa gen) nhằm tạo ra các giống đậu tương có năng suất cao hơn, có khả năng chống chịu tốt hơn. - Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở khoa học và thực tiễn cho việc hoàn thiện kỹ thuật tái sinh các giống đậu tương cho chuyển gen, thiết kế vector chuyển gen, chuyển gen, sàng lọc đánh giá cây chuyển gen; xây dựng cơ sở phương pháp luận đánh giá chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử có kiểu gen ổn định để chọn lọc giống đậu tương chuyển gen ở Việt Nam.
3 - Kết quả nghiên cứu của luận án có giá trị làm tư liệu, tài liệu cho giảng dạy, nghiên cứu sâu hơn về chuyển gen ở cây đậu tương nói riêng và ở cây trồng nói chung. 3.2. Ý n ĩ t ự t ễn Tạo được các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T0, T1, T2, tạo được một số dòng chuyển gen Atore1 đồng hợp tử thế hệ T3 có tuổi thọ của bộ lá kéo dài hơn và cho năng suất cao hơn giống đối chứng không chuyển gen. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đố t ợng nghiên c u Cây mô hình Arabidopsis thaliana. 30 giống đậu tương của Việt Nam (bao gồm các giống trồng đại trà và các giống địa phương), 02 giống đậu tương mô hình là Kwangan (KW) và William82. 4.2. Phạm vi, thời gian nghiên c u Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính (nhà lưới) tại Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên trong thời gian từ năm 2019 - 2022. 5. Những đóng góp mới của luận án - Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu về chuyển gen nâng cao năng suất ở cây đậu tương thông qua việc kéo dài tuổi thọ của bộ lá ở Việt Nam. Luận án nghiên cứu có tính hệ thống về đặc điểm tái sinh phục vụ chuyển gen, thiết kế vector, kỹ thuật chuyển gen. - Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở khoa học để xây dựng cơ sở dữ liệu và phương pháp luận về nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen ở cây đậu tương. Trong đó, tối ưu hóa được các điểu kiện tái sinh in vitro và lựa chọn được các giống đậu tương thích hợp cho tái sinh là ĐT22, VX93, ĐVN11, ĐVN9, ĐVN6, ĐVN5, ĐVN10, ĐT26. - Nhân dòng thành công gen Atore1, thiết kế thành công cấu trúc vector chuyển gen pER8-Atore1 mang gen kìm hãm già hóa bộ
4 lá Atore1, thử nghiệm trên cây mô hình Arabidosis co thế vector và gen hoạt động tốt, sẵn sàng cho việc chuyển gen vào cây đậu tương. Kết quả thiết kế vector là cơ sở lý luận để thiết kế hệ thống vector chuyển gen cho đối tượng thực vật nhằm nâng cao việc ứng dụng kỹ thuật di truyền hiện tại và tương lại. Thành công trong việc tạo được cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0, T1, T2 và T3, sử dụng chất chỉ thị, phân tích PCR, phân tích biểu hiện hình thái, phân tích Southern để sàng lọc cây chuyển gen qua các thế hệ. Nhất là đã thành công trong việc chọn lọc được 02 dòng chuyển gen đồng hợp tử thế hệ T3, ổn định về kiểu gen, có tuổi thọ của bộ lá dài hơn từ 17 - 22 ngày so với đối chứng, và có năng suất cao hơn đối chứng không chuyển trên trên 18%. Việc thành công trong chọn lọc được dòng đồng hợp tử ở thế hệ thứ 3 (T3) là cơ sở khoa học có tính thuyết phục cao trong việc hương đến chọn thành giống đậu tương chuyển gen. 6. ố cục của luận án uận án được trình bày trong 145 trang (không kể tài liệu tham khảo và phần phụ lục): ở đầu (5 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu và cơ sở khoa học của đề tài (35 trang), Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu (20 trang), Chương 3: ết quả nghiên cứu và thảo luận (83 trang), ết luận và đề nghị (2 trang). Tài liệu tham khảo được sử dụng 143 tài liệu, trong đó có 22 tài liệu Tiếng Việt và 121 tài liệu Tiếng nh. uận án có 55 bảng, 44 hình, 4 công trình đã công bố (02 trên tạp chí quốc tế có uy tín và 02 trên tạp chí trong nước). CHƢƠNG 1. T NG QUAN T I IỆU V CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI uận án đã tham khảo và tóm lược các tài liệu Tiếng Việt và Tiếng nh, với các nội dung liên quan bao gồm: 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam; 2. Tình hình nghiên cứu chuyển gen đậu tương trên thế giới; 3. Tình hình nghiên cứu chuyển
5 gen đậu tương trong nước; 4. Tổng quan tình hình nghiên cứu về tính trạng gen có khả năng nâng cao năng suất hạt ở đậu tương. 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và Việt Nam Cây đậu tương là cây trồng quan trọng trên thế giới và Việt Nam, là cây công nghiệp - thực phẩm sử dụng cho nhiều ứng dụng trong đời sống: làm thực phẩm cung cấp dinh dưỡng cho con người, thức ăn gia súc, dược phẩm... Trên thế giới đậu tương là một trong 8 loại hạt có dầu thiết yếu quan trong nhất trong thực phẩm và công nghiệp dược phẩm, thực phẩm. Năm 2019 - 2020, diện tích đậu tương trên thé giới là 120,50 triệu ha, sản lượng đạt 333,67 triệu tấn. Ở Việt nam, cây đậu tương là cây lấy hạt quan trọng thứ 3 sau lúa và ngô. Năm 2020 - 2021, diện tích trồng đậu tường chỉ còn 35.000 ha, diện tích giảm 75% và sản lượng giảm trên 70% so với năm 2010. Trong khi nhu cầu về hạt đậu tương rát lớn, vì vậy Việt Nam phải nhập khẩu 3,5 - 5 triệu tấn đậu tương/ năm với giá trị 2 - 3 tỷ USD, gần tương đương với giá trị xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam hiện nay. Thực tế trên cho thấy, để phát triển sản xuất đậu tương, Việt Nam cần đầu tư đẩy mạnh nghiên cứu tạo các giống đậu tương có năng suất và chất lượng cao phục vụ sản xuất trong nước. 1.2. Tình hình nghiên cứu chuyển gen đậu tƣơng trên thế giới Đến năm 2020, cây trồng chuyển gen được áp dụng ở 29 quốc gia, áp dụng nhiều nhất là đậu tương, ngô, bông và cải dầu. Đậu tương là cây trồng chuyển gen có diện tích lớn nhất với 91,9 triệu ha, chiếm 48% diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu. Năm 2021, các nhà khoa học trên thế giới đang tập trung nghiên cứu, phát triển cây trồng biến đổi gen cho hơn 60 loại cây trồng khác nhau với hơn 380 sự kiện chuyển gen. Trong số đó, cây đậu tương đứng thứ 4 với 30 sự kiện chuyển gen. Các tính trạng chuyển gen ở cây đậu tương gồm: kháng sâu, bệnh hại, chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng năng suất hạt, tăng hàm lượng dầu hạt. Diện tích đậu tương chuyển gen chiếm 80% tỏng diện tích đậu tương toàn cầu, nghĩa là thế giới có 20% diện tích canh tác đậu tương sử dụng giống truyển thống không chuyển gen.
6 1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen đậu tƣơng trong nƣớc Giai đoạn 2007 - 2008, Trần Thị Cúc Hòa và cs đã công bố các kết quả nghiên cứu thử nghiệm về chuyển gen trên cây đậu tương và đưa ra kết luận có 5 giống có thể sử dụng làm vật liệu chuyển gen, hiệu quả chuyển gen của các dòng thử nghiệm đạt từ 1,5 đến 5% [11], [12]. Năm 2010, Nguyễn Tiến Dũng và cs đã nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tương Việt nam thông qua gen chỉ thị GUS cho thấy tỷ lệ tiếp nhận và mức độ biểu hiện gen ở các giống rất khác nhau, dao động từ 16 đến 90% [5]. Năm 2012 - 2017, Nguyễn Văn Đồng và cs đã nghiên cứu quy trình biến nạp gen kháng sâu Cry1b và gen liên quan đến kháng hạn GmNAC004 vào giống đậu tương Việt Nam thông qua vi khuẩn A. tumefaciens [8], [9]. Lò Thanh Sơn và cs (2015) đã nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ vào đậu tương ĐT84 [18]. Tác giả Đặng Trọng ương và cs (2015) tiến hành chuyển gen và tạo được hai dòng chuyển gen (BC2F1/DT2008 và BC2F1/ðT26) mang gen cp4-epsps và có khả năng kháng thuốc diệt cỏ [15]. Các nghiên cứu trong nước về chuyển gen trên cây đậu tương tuy đã có những tiến bộ quan trọng, nhưng cũng chỉ là bước đầu, chưa có giống đậu tượng chuyển gen được đưa ra đánh giá ở diện rộng trên đồng ruộng. 1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu về tính trạng gen có khả năng nâng cao năng suất hạt ở đậu tƣơng Năm 1997, nhóm nghiên cứu của Oh và cs đã phân tích sàng lọc hơn 25.000 dòng gen đột biến cây Arabidopsis và phát hiện 5 dòng có biểu hiện kéo dài tuổi thọ lá đặt tên là ore 1, 2, 3, 9 và 11. Trong đó, Ore1có bộ lá kéo dài hơn các cây đối chứng 15 ngày. Hàm lượng diệp lục ở lá cây ore1 vẫn được duy trì trên 50% sau 6h che tối và 30% ở lá sau 48 ngày tuổi trong khi đó ở cây đối chứng diệp lục mất 90% và hoàn toàn sau cùng thời gian trên. Thêm vào đó hàm lượng enzyme Rubisco tham gia quá trình quang hợp ở cây mang gen ore1 cao hơn đối chứng trong suốt quá trình sinh trưởng của lá [106]. Sau phát hiện này, gen ore1 được các nhà khoa học nghiên
7 cứu ứng dụng chuyển gen để tạo các dạng cây trồng có bộ lá xanh lâu hơn và vì thế năng cao khả năng quan hợp và năng suất cây trồng, trong Báo cáo luận văn tiến sĩ, nghiên cứu sinh đã sử dụng gen Atore1 phân lập từ cây Arabidopsis để ứng dụng chuyển gen vào cây đậu tương. CHƢƠNG 2. VẬT IỆU, NỘI DUNG V PHƢƠNG PH P NGHI N CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Nghiên cứu sử dụng cây mô hình Arabidopsis thaliana; 30 giống đậu tương của Việt Nam (bao gồm các giống trồng đại trà và các giống địa phương) và 02 giống đậu tương mô hình. Các vector tách dòng pBluescript, vector chuyển gen pER8, chủng vi khuẩn E. coli DH5, Agrobacterium GV3101, EHA105, do trường Đại học DongA (Hàn Quốc) cung cấp trong khuôn khổ hợp tác nghiên cứu giữa trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên và trường Đại học DongA (Hàn Quốc). 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Nghiên c u khả n n tá s n bằng kỹ thuật nuôi c y in vitro và khả n n t ếp nhận gen của một số giốn đậu t ơn để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen 2.2.2. Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm ãm à ó lá Or 1 và đán á b ểu hiện trên cây Arabidopsis 2.2.3. Chuyển gen kìm hãm già hóa lá Ator 1 vào đậu t ơn và đán á á dòn u ển gen 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính (nhà lưới) tại Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên. Thời gian thực hiện từ năm 2019 - 2022. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Nghiên c u khả n n tá s n bằng kỹ thuật nuôi c y in vitro và khả n n t ếp nhận gen của một số giốn đậu t ơn để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen
8 2.4.1.1. Nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro của các giống đậu tương 2.4.1.2. Đánh giá khả năng tiếp nhận gen của các giống đậu tương 2.4.2. Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm ãm à ó lá Or 1 và đán á b ểu hiện trên cây Arabidopsis 2.4.2.1. Nghiên cứu tách dòng gen kìm hãm già hóa lá Atore1. 2.4.2.2. Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa lá Atore1 2.4.2.3. Đánh giá khả năng biểu hiện của gen kìm hãm già hóa lá Atore1 trên cây mô hình Arabidopsis thaliana 2.4.3. Chuyển gen kìm hãm già hóa lá Ator 1 vào đậu t ơn và đán á á dòn u ển gen 2.4.3.1. Nghiên cứu chuyển gen Atore1 vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2.4.3.2. Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen 2.4.3.3. Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 và đánh giá biểu hiện gen 2.4.3.4. Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương chuyển gen Các thí nghiệm đồng ruộng được gieo trồng, chăm sóc, theo dõi, đánh giá theo QCVN 01-58:2011/BNNPTNT về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng của giống đậu tương Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành tại Thông tư số 48 /2011/TT- BNNPTNT ngày 05/7/2011. 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học bằng phần mềm icrosoft ffice Excel 2010 và phần mềm Sirichai Statistics Version 6.00. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
9 3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tƣơng để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen Hình 3.1. Một số hình ảnh thực hiện các bƣớc tiến hành thí nghiệm Ghi chú: A- Hạt được khử trùng trong dung dịch NaClO 15%; B- Nuôi cấy hạt nảy mầm trên môi trường nẩy mầm (GM); C- Hạt nảy mầm sau 3 ngày nuôi cấy; D- Tạo vật liệu nuôi cấy (a- đường cắt chia đôi làm hai mảnh lá mầm, b- khoảng cách từ nốt lá mầm đến điểm cắt (c) tại trụ dưới 3mm); E- Mẫu cấy được loại bỏ chồi đỉnh; F- Mẫu cấy tái sinh trên môi trường tái sinh chồi (SIM). Hình 3.2. Ảnh hƣởng của I A (1,0mg/l) đến khả năng ra rễ ở giống ĐT26 sau 3 tuần nuôi cấy Vô trùng bằng NaCl nồng độ 15% trong 15 phút cho kết quả tốt nhất, đạt tỷ lệ 90,7% số mẫu sống, không nhiễm và nảy mầm tốt; B P hàm lượng 1,5 mg/l cho cho kết quả tái sinh chồi, tạo đa chồi tốt nhất; inetin ham lượng 1,5 - 2 mg/l cho khẳ năng tái sinh chồi cao. Tuy nhiên B P cho khả năng tái sinh tốt hơn ở cùng nồng độ; GA3 hàm lượng từ từ 0,5 - 1,0mg/l có khả năng kéo dài chồi đồng thời chồi khỏe mạnh cân đối hơn so với các nồng độ khác; IBA hàm lượng 1 mg/l có khả năng tăng cường ra rễ của mẫu nuôi cấy để tạo
10 cây hoàn chỉnh, tỷ lệ ra rễ đạt từ 62,3% - 99,7 %. Có thể sử dụng nồng độ này để tăng cường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. Các giống có khả năng tái sinh và khả năng tiếp nhận gen cao thuộc nhóm giống canh tác đang trồng phổ biến ở khu vực miền núi phía Bắc gồm: ĐT22; VX93; ĐVN11; ĐVN9; ĐVN6; ĐVN5; ĐVN10; ĐT26; V … Khả năng tái sinh cao gần như tương đương với giống W và William 82, có thể sử dụng làm vật liệu chuyển gen. 3.2. Kết quả tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa lá Ore1 và đánh giá biểu hiện trên cây Arabidopsis 3.2.1. Tách dòng gen kìm hãm già hóa Atore1 E. coli DH5a Hình 3.3. Sơ đồ nhân dòng gen Atore1 Ghi chú: A- Gắn gen Atore1 tại vị trí enzyme cắt giới hạn Ascl và SpeI vào Vector nhân dòng pBluescipt (pBS); B- Chuyển vector vào chùng Ecoli DH5 và nuôi cấy tạo khuẩn lạc. Hình 3.4. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gen Atore1 bằng PCR và enzyme cắt giới hạn Ghi chú: A- Sản phẩm PCR chọn khuẩn lạc mang gen Atore1 (cặp mồi T3 và Atore1-F). Đoạn khuếch đại kích thước khoảng 1,1 kb
11 tương ứng với kích thước gen Atore1; B- Kiểm tra đoạn chèn bằng enzyme cắt hạn chế NotI và SpeI cho hai đoạn 4 kb và 1,1kb tương ứng với kích thước vector pBS-UBQ14 và gen Atore1. 3.2.2. T ết kế v tor u ển n m n n kìm ãm à ó lá Atore1 Hình 3.5. Hình vẽ cấu trúc vector chuyển gen Atore1 Ghi chú: A- vector nhân dòng pBluescipt cắt đoạn gen pUBQ14::Atore1 tại vị trí enzyme cắt giới hạn AscI và SpeI; B- vector chuyển gen pER8 được chèn cấu trúc pUBQ14::Atore1 trong vùng RB và LB. Hình 3.6. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gen Atore1 bằng PCR và enzyme cắt giới hạn Ghi chú: A- PCR khuẩn lạc để chọn khuẩn lạc tái tổ hợp pER8- UBQ14::Atore1 sử dụng cặp mồi pER8-R và Atore1-F. Mũi tên chỉ đoạn khuếch đại kích thước khoảng 1,1kb tương ứng với kích thước mong muốn; B- Kiểm tra đoạn chèn bằng enzyme cắt hạn chế AscI và SpeI cho hai đoạn 11,9kb và 2,1kb tương ứng với kích thước vector pER8 và UBQ14::Atore1 3.2.3. Đán á k ả n n b ểu ện ủ n kìm ãm à hóa lá Atore1 trên cây Arabidopsis 3.2.3.1. Chuyển gen Atore1 vào cây mô hình Arabidopsis
12 ảng 3.1. Kết quả chuyển gen Atore1 cây Arabidopsis thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (T0) Thí nghiệm Số cây biến nạp Số cây thu hạt TN1 6 6 TN2 6 6 Tổng cộng 12 12 Kết quả chuyển gen vào cây mô hình Arabidopsis tổng hợp ở Bảng 3.1, thu được 12 hạt T0, sau đó hạt T0 được nuôi cấy chăm sóc để phục vụ cho chọn lọc và đánh giá ở các thế hệ tiếp theo. 3.2.3.2. Chọn lọc cây Arabidopsis chuyển gen T1 mang gen Atore1 Cây T1 được chọn lọc bằng chất chọn lọc (Kanamycin và phân tích PCR). Tổng số 1.000 cây T1 được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc bổ sung 50mg/l kanamycin, kết quả thu được 267 cây sống sót và 733 cây chết. Kết quả này cho thấy hiệu quả chọn lọc cây chuyển gen tương đối cao (26,75%). 3.2.3.3. Đánh giá cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 bằng PCR ở thế hệ T1 Trong số những cây T1 sống sót trên môi trường kanamycin, nhóm nghiên cứu lấy mẫu của 50 cây để kiểm tra sự hiện diện của gen Atore1 bằng PCR, xác định được 48 cây dương tính mang gen Atore1. Kết quả phân tích PCR cho thấy các mẫu dương tính chứng tỏ các cây chuyển gen đã mang gen chuyển Atore1. 3.2.3.4. Đánh giá biểu hiện gen thông qua hình thái của cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T1 Cây T1 đã kiểm tra bằng PCR được trồng và chăm sóc đánh giá hình thái và thu hạt cho thế hệ T2. Sơ bộ đánh giá hình thái cho thấy cây chuyển gen thế hệ T1 có lá màu xanh đậm, số lá nhiều hơn so với đối chứng không chuyển gen (Hình 3.7).
13 Hình 3.7. Hình thái lá của cây Arabidopsis chuyển gen (T1) Ghi chú: A- Cây chuyển gen Atore1, lá xanh đậm, lá dày hơn so với đối chứng; B- Cây đối chứng không chuyển gen, lá màu xanh nhạt, thời gian sinh trưởng ngắn hơn cây chuyển gen. 3.2.2.5. Đánh giá cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 bằng PCR ở thế hệ T2 Dựa trên kết quả phân tích PCR và đánh giá hình thái ở thế hệ T1, nhóm nghiên cứu lựa chọn 15 dòng mang gen Atore1 để đánh giá ở thế hệ T2. Kết quả phân tích PCR cho thấy tất cả 15 dòng T2 chuyển gen này đều cho kết quả dương tính với gen Atore1 (Hình 3.8). Điều này chứng tỏ các gen chuyển Atore1 đã được di truyền sang thế hệ sau (T2). Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen Atore1 ở cây Arabidopsis chuyển gen thế hệ T2 Ghi chú: M-DNA marker, (-), (+) đối chứng âm và đối chứng dương, từ 1-15 là thứ tự các mẫu kiểm tra. 3.2.3.6. Đánh giá biểu hiện gen thông qua hình thái lá ở cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T2
14 Bảng 3.2. Hình thái lá của cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T2 Kích thƣớc lá (cm) Ký hiệu mẫu Số lƣợng lá Màu sắc Dài Rộng Atore1 (D1-15) 20 - 24 Xanh đậm 1,3 - 1,8 0,7 - 0,9 Wt (ĐC) 16 Xanh nhạt 2,01 0,8 Cây chuyển gen thế hệ T2 có lá xanh đậm và số lá nhiều hơn so với đối chứng không chuyển gen. Từ kết quả nghiên cứu mục 3.2 cho thấy, nhóm nghiên cứu đã nhân dòng thành công gen Atore1, đã thiết kế thành công vector chuyển gen mang gen đích Atore1, chuyển hệ thống vector vào cây mô hình Arabidopsis, gen đích Atore1 đã biểu hiện tương đối tốt, cây chuyển gen có số lá nhiều hơn, lá xanh đậm hơn so với đối chứng không chuyển gen vì vậy có thời gian sinh trưởng dài hơn. Kết quả là tiền đề cho chuyển gen vào cây đậu tương. 3.3. Kết quả chuyển gen kìm hãm già hóa lá Atore1 vào cây đậu tƣơng và đánh giá các dòng chuyển gen 3.3.1. Nghiên c u chuyển n Ator 1 vào đậu t ơn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Từ kết quả nghiên cứu tái sinh in vitro tiến hành nuôi cấy tạo vật liệu cho biến nạp. Sau quá trình biến nạp đã thu được 12 cây T0 chuyển gen Atore1, trong đó 8 cây đủ tiêu chuẩn được đưa ra trồng. 3.3.2. Chọn lọ và đán á biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu t ơn u ển gen 3.3.2.1. Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 ảng 3.3. Kết quả sàng lọc cây đậu tƣơng chuyển gen T0 ngoài đồng ruộng Tổng số cây Số cây kháng Số cây không STT kiểm tra Basta kháng Basta 1 8 7 1
15 Sàng lọc cây chuyển gen bằng Basta cho thấy (Bảng 3.3) trong 8 cây T0 có 7 cây kháng thuốc và 1 cây không kháng thuốc (phương pháp sàng lọc bằng Basta đươc thể hiện ở Hình 3.9). Hình 3.9. Hình ảnh sàng lọc cây đậu tƣơng chuyển gen sau 3 ngày bằng thuốc diệt cỏ asta Ghi chú: A- Lá cây không chuyển gen bị chết khi quét Basta (vạch kẻ màu vàng giữa lá); B và C- lá cây chuyển gen Atore1 kháng lại Basta. Vạch kẻ ngang giữa lá chỉ vị chí quét thuốc diệt cỏ Basta; D- Cây chuyển gen được sàng lọc bằng phương pháp phun Basta. Mũi tên chỉ cây không chuyển gen bị chết do không có khả năng kháng Basta. Từ 7 cây T0 kháng thuốc diệt cỏ tiếp tục phân tích PCR để xác định sự hiện diện của gen đích (Atore1), kết quả cho thấy cả 7 cây T0 đều dương tính với gen Atore1. 3.3.2.2. Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen thế hệ thế hệ T1 - Chọn lọc cây chuyển gen Atore1 thế hệ T1 bằng thuốc diệt cỏ Basta và phân tích PCR: ảng 3.4. Kết quả chọn lọc các cây đậu tƣơng chuyển gen Atore1 thế hệ T1 bằng thuốc diệt cỏ asta Số hạt Số cây Số cây Số cây Tỷ lệ cây Gene T0 đƣợc nảy kiểm tra kháng kháng gieo mầm phun Basta basta Basta (%) Atore1 121 98 98 8 8,2 Cây T1 được sàng lọc bằng thuốc diệt cỏ basta. Khi cây được 3 lá, tiến hành kiểm tra bằng thuốc diệt cỏ basta nồng độ 0,2%. Sau 5
16 ngày tiến hành kiểm tra lặp lại (sàng lọc bằng cách kẻ vạch thuốc basta lên lá cây đậu tương). Sau 2 lần kiểm tra tiến hành thống kê cây kháng thuốc và cây không kháng. Kết quả cho thấy, trong tổng số 98 cây kiểm tra có 8 cây kháng thuốc diệt cỏ basta. Lá của 8 cây này sinh trưởng bình thường và không có biểu hiện bị chết ở phần xử lý thuốc. Tỷ lệ cây chuyển gen T1 kháng thuốc diệt cỏ Basta đạt được là 8,2% (Bảng 3.4). Cây kháng thuốc (8 cây) được kiểm tra sự hiện diện của gen Atore1 và gen Bar bằng PCR, kết cả 8 mẫu kiểm tra đều dương tính với hai gen nêu trên (Hình 3.10, 3.11), điều này cho thấy 8 cây T1 mang đích Atore1. Hình 3.10. Kết quả phân tích biểu hiện của gen chọn lọc ar bằng PCR của các cây đậu tƣơng chuyển gen T1 Hình 3.11. Kết quả phân tích biểu hiện gen Atore1 của các cây đậu tƣơng chuyển gen T1 - Đánh giá biểu hiện gen ở cây chuyển gen Atore1 thế hệ T1 thông hình thái, độ bền lá và hàm lƣợng diệp lục: Trong 8 dòng T1, có 4 dòng là các dòng 1, 5, 7, 8 tuổi thọ của lá không có sự sai khác so với đối chứng, các dòng còn lại là dòng 2, 3, 4 và 6 có tuổi thọ của bộ lá dài hơn so với đối chứng chuyển gen từ 16 đến 26 ngày, đồng thời hàm lượng diệp lục (giai đoạn hạt chắc và chín) của 4 dòng nêu trên cao hơn so với đối chứng từ 53,5% đến 58,5%. Kết quả cho thấy, gen chuyển Atore1 đã biểu hiện tốt và tác động kéo dài thời gian sinh trưởng bộ lá ở cây đậu tưởng chuyển gen. - Đánh giá biểu hiện gen ở cây đậu tƣơng chuyển gen Atore1 thế hệ T1 bằng Southern blot:
17 Hình 3.12. Kết quả lai Southern của các dòng đậu tƣơng mang gen Atore1 thế hệ T1 Ghi chú: M- DNA molecular Weight Marker II; P- Plasmid; wt- cây đối chứng không chuyển gen; dòng chuyển gen Atore1 (#3, #5); (*) số băng hiển thị khi cắt bởi enzyme BamHI ở các dòng chuyển gen. Thí nghiệm lai Southern blot được thực hiện bằng phương pháp không sử dụng đồng vị phóng xạ với bộ kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Hình 3.12). Hình ảnh kết quả lai Southern cho dòng chuyển gen Atore1 thế hệ T1 có nhiều băng lai. ết quả này chứng tỏ gen đích Atore1 đã được gắn kết ở nhiều vị trí chưa ổn định, vì vậy cần phải chọn lọc ở các thế hệ tiếp theo. 3.3.2.3. Chọn lọc cây đậu tương chuyển gen kìm hãm già hóa lá Atore1 ở thế hệ T2 - Chọn lọc cây đậu tƣơng chuyển gen Atore1 thế hệ T2 bằng thuốc diệt cỏ Basta và phân tích PCR: ảng 3.5. Kết quả chọn lọc các cây đậu tƣơng chuyển gen Atore1 thế hệ T2 bằng thuốc diệt cỏ asta Số cây kiểm tra Số cây kháng Tỷ lệ cây kháng phun Basta Basta Basta (%) 335 287 85,67 Kết quả chọn lọc bằng Basta (Bảng 3.5) cho thấy đã chọn được 287 cây kháng Basta (85,67%). Kết quả phân tích cây chuyển gen Atore1 kháng thuốc diệt cỏ Basta ở thế hệ T2 bằng phản ứng PCR khuếch đại gen kháng thuốc diệt cỏ - gen Bar và gen đích Atore1. Kết quả cho thấy, toàn bộ cây
18 chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ Basta đều mang gen Bar có kích thước khoảng 480bp và gen Atore1 kích thước khoảng 1,1kb. Kết quả này cho thấy, tất cả các cây chuyển gen Atore1 thế hệ T2 đều mang gen đích. - Đánh giá biểu hiện gen thông qua hình thái, độ bền lá và hàm lƣợng diệp lục: Kết quả cho thấy, cây chuyển gen T2 có tuổi thọ lá dài hơn từ 14,5 đến 27,8 ngày với đối chứng. Hàm lượng diệp lục của cây chuyển gen cao hơn so với đối chứng không chuyển gen ở tất cả các giai đoạn nghiên cứu. Cụ thể: giai đoạn hạt chắc hàm lượng diệp lục từ 88,6 đến 92,43 (đối chứng là 72,8), giai đoạn chín làm lượng diệp lục là 43,7 đến 60,6 (trong khi đối chứng chỉ còn 15,7). Điều này cho thấy gen Atore1 đã biểu hiện tốt ở cây chuyển gen T2. - Đánh giá biểu hiện gen ở cây chuyển gen Atore1 thế hệ T2 bằng Southern blot: Lựa chọn 03 cây chuyển gen thế hệ T2 thuộc dòng Atore1-2, Atore1-5 và Atore1-6 để phân tích Southern. Kết quả cho thấy, các cây chuyển gen có nhiều băng hiển thị trên màng lai. Kết quả này chứng tỏ ở thế hệ T2 gen đích Atore1 vẫn chưa ổn định ở các dòng Atore1-2, Atore1-5 và Atore1-6 (Hình 3.13). Vì vậy, cần tiến hành chọn lọc dòng đồng hợp tử của gen Atore1 ở các thế hệ tiếp theo để tạo dòng ổn định về mặt di truyền. Hình 3.13. Kết quả lai Southern của các dòng đậu tƣơng mang gen Atore1 thế hệ T2