intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận án Tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Chia sẻ: ViJensoo ViJensoo | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:200

Thêm vào BST
Báo xấu
73
lượt xem 13
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Công nghệ thực phẩm "Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật" trình bày các nội dung chính sau: Xác định thành phần hóa lý phụ phẩm thịt dè cá tra và máu cá tra; Khảo sát ảnh hưởng của thời gian gia nhiệt và pH đến quá trình thu hồi protein máu cá tra;...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP ĐẶNG MINH HIỀN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TRONG CHẾ BIẾN BỘT PROTEIN THỦY PHÂN TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA SỬ DỤNG LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 2021
  2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ NGÀNH: 62.54.01.01 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TRONG CHẾ BIẾN BỘT PROTEIN THỦY PHÂN TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA SỬ DỤNG LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT NGHIÊN CỨU SINH ĐẶNG MINH HIỀN MSNCS: P1114001 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. NGUYỄN CÔNG HÀ 2021
  3. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Luận án nghiên cứu được hoàn thành tại bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ. Để hoàn thành được luận án này nhờ vào sự nỗ lực của chính tác giả và sự giúp đỡ vô cùng quý báo của giáo viên hướng dẫn, các thầy cô, Cơ quan công tác, Công ty Caseamex, Công ty CP thủy sản Đại Đại Thành, Công ty 404, gia đình và bạn bè. Tôi thật lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc đến: PGs. Ts. Nguyễn Công Hà đã tận tình hướng dẫn, Trao đổi, động viên và giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Quý thầy, cô bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập. Các cán bộ phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm và phòng thí nghiệm Sinh học đất, bộ môn Khoa học đất đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn. Quý Công ty GEPIMEX 404, Công ty CP thủy sản Đại Đại Thành, Caseamex đã tạo điều kiện cho tôi có được nguyên liệu để làm thí nghiệm và hoàn thành luận văn. Cám ơn tất cả bạn bè, anh chị em lớp cao học Công nghệ thực phẩm khóa 19, 20, 21, các em sinh viên đại học Công nghệ thực phẩm khóa 38, 39 đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Đặc biệt, cám ơn gia đình và quý thầy cô đã ủng hộ, động viên, khích lệ và cũng là điểm tựa vững chắc cho tôi trong suốt thời gian học tập. Xin chân thành cám ơn! Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2021 Nghiên cứu sinh Đặng Minh Hiền Ngành Công nghệ Thực phẩm i Khoa Nông Nghiệp
  4. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Cá tra dầu (Pangasius hypophthalmus) được biết đến là một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực của Việt Nam với phi lê là sản phẩm chính của ngành chế biến cá tra được ưa chuộng tại nhiều quốc gia trên thế giới. Một số nghiên cứu đã được tiến hành về quá trình thủy phân các sản phẩm phụ của cá bằng cách sử dụng enzyme; các nghiên cứu tập trung vào việc cải thiện mức độ thủy phân để cải thiện hoạt động chống oxy hóa của chúng; nghiên cứu quá trình thủy phân các sản phẩm phụ của cá tra bằng cách sử dụng nhiều protease và động học thủy phân. Cho đến nay, chưa có thông tin nào về việc thủy phân thịt vây và máu cá tra bằng các enzym protease (bromelain, papain, neutrase) để ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật. Ngoài ra, nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên cho thấy động học thủy phân của các enzyme này trên hai cơ chất và xu hướng thay đổi của hàm lượng acid amin trong quá trình thủy phân protease liên quan đến sự phát triển của vi sinh vật. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật đã được thực hiện với ba nội dung bao gồm: (1) Nội dung 1: tách hàm lượng mỡ trong thịt dè cá, tiến hành thí nghiệm thủy phân trên phụ phẩm thịt dè cá bằng các enzyme bromelain, papain và neutrase, dung dịch thủy phân đem sấy phun thu sản phẩm bột protein thủy phân; (2) Nội dung 2: các thử nghiệm được thực hiện tương tự như nội dung 1 trên phụ phẩm máu cá tra; (3) Nội dung 3: tiến hành nuôi cấy vi sinh vật (vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm mốc Aspergillus oryzae) trên các môi trường là sản phẩm tối ưu của thử nghiệm thủy phân protein thịt dè cá và máu cá. Sau quá trình thực hiện, nghiên cứu đã ghi nhận các kết quả như sau: (1) Nội dung 1: kết quả cho thấy phụ phẩm thịt dè cá tra được tách béo bởi dung dịch NaHCO3 ở nồng độ 0,2%, có khả năng tách béo tốt nhất, hiệu suất thủy phân của các enzyme hiệu quả ở tỷ lệ khối lượng enzyme và cơ chất là 2,25 mg enzyme (mgE)/1,17 g protein (gPro) đối với enzyme bromelain, 1,5 mgE/1,17gPro đối với enzyme papain và 0,625 mgE/0,975 gPro đối với enzyme neutrase; bên cạnh đó, hiệu suất thủy phân tyrosin và đạm amin bằng enzyme bromelain ở thời điểm 240 phút tương ứng 65,25% và 71,02%, của enzyme papain là 57,74% và 67,22%, enzyme neutrase là 42,69% và 52,51%; hàm lượng acid amin tự do tăng theo thời gian thủy phân đồng thời bởi 3 enzyem, lượng acid amin tự do thủy phân bromelain > papain > neutrase. (2) Nội dung 2: Đối với phụ phẩm máu cá tra được tách béo bởi dung dịch NaHCO3 ở nồng độ 0,2%, có khả năng tách béo tốt nhất; hiệu suất thủy phân của các enzyme hiệu quả ở tỷ lệ khối lượng enzyme và cơ chất là 2,1 mg enzyme (mgE)/0,69 g protein (gPro) đối với enzyme bromelain, 1,2 mgE/0,598 gPro đối với enzyme papain và 0,7 mgE/0,690 gPro đối với Ngành Công nghệ Thực phẩm ii Khoa Nông Nghiệp
  5. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ enzyme neutrase; bên cạnh đó, hiệu suất thủy phân tyrosine và đạm amin bằng enzyme bromelain ở thời điểm 240 phút tương ứng 95,93% và 75,65%, của enzyme papain là 76,62% và 70,91%, enzyme neutrase là 59,17% và 63,65%. Hàm lượng acid amin tự do tăng theo thời gian thủy phân đồng thời bởi 3 enzyme, lượng acid amin tự do thủy phân bromelain > papain > neutrase. (3) Nội dung 3: Các sản phẩm thủy phân từ thịt dè và máu cá tra đã được sử dụng làm môi trường dinh dưỡng nuôi chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm mốc Aspergillus oryzae cho thấy hiệu quả tốt hơn so với môi trường peptone thương mại thông qua đường cong tăng trưởng và khả năng sinh tổng hợp protease của các vi sinh vật này trên các môi trường thử nghiệm. Từ khóa: bromelain, papain, neutrase, phụ phẩm cá tra, thủy phân, dịch thủy phân protein. Ngành Công nghệ Thực phẩm iii Khoa Nông Nghiệp
  6. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ ABSTRACT Catfish (Pangasius hypophthalmus) is known as one of the mainly export products of Vietnam with fillets being the main product of pangasius processing, which is popular in many countries around the world. A few studies have been conducted on the enzymatic hydrolysis of fish by-products using enzyme; the studies were focusing on improving degree of hydrolysis in order to improve their antioxidant activity; study the hydrolysis of channel catfish by-products by using multiple proteases and hydrolysis kinetics. Until now, no information has been reported on hydrolysis of fin meat and blood of catfish by protease enzymes (bromelain, papain, neutrase) for application of cultural microorganism. In addition, this study is the first to show hydrolysis kinetics of enzymes on two substrates and the acid amin content pattern changes during protease hydrolysis connecting to develope of microorganism. Therefore, the study on the application of protease enzyme in processing hydrolyzed protein powder from pangasius by-products used as microbial culture medium was carried out with three contents including: (1) Content 1: defatted in fish fin meat, hydrolysis experiment was proceeded on catfish by- products by enzymes bromelain, papain and neutrase, the hydrolysate was spray-dried to obtain hydrolyzed protein powder; (2) Content 2: the tests were performed similarly to content 1 on catfish blood by-product; (3) Content 3: Culturing microorganisms (Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae) on the media was the optimal product of the experiment of hydrolysis of protein fin meat and fish blood. After the conducted experiment, the research has recorded the following results: (1) Content 1: the results showed that pangasius belly by-products were defatted by NaHCO3 solution at a concentration of 0,2%, possibly fat separation the best; the hydrolysis efficiency of enzymes were effective at the enzyme mass to substrate ratio is 2,25 mg enzyme (mgE)/1.17 g protein (gPro) for bromelain enzyme, 1,5 mgE/1,17gPro for papain enzyme and 0,625 mgE/0,975 gPro for neutrase enzyme; besides, the hydrolysis efficiency of tyrosin and amino proteins by bromelain enzyme at 240 minutes to 65,25% and 71,02%, of papain enzyme to 57,74% and 67,22%, enzyme neutrase to 42,69% and 52,51%, corresponding; free amino acid content increases with hydrolysis time at all three enzyems, free amino acid hydrolyzed by bromelain>papain>neutrase. (2) Content 2: For pangasius blood by-product, which was defatted by NaHCO3 solution at a concentration of 0.2%, has the best ability to separated fat; the hydrolysis efficiency of enzymes reached optimation at the enzyme and substrate mass ratio to 2,1 mg enzyme Ngành Công nghệ Thực phẩm iv Khoa Nông Nghiệp
  7. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ (mgE)/0,69 g protein (gPro) of bromelain enzyme, 1,2 mgE/0,598 gPro of papain enzyme and 0,7 mgE/0,690 gPro of neutrase enzyme; beside that, the hydrolysis efficiency of tyrosin and amino proteins by bromelain enzyme at 240 minutes, respective to 95,93% and 75,65%, the papain enzyme to 76,62% and 70,91%, the enzyme neutrase to 59,17% and 63,65%. The content of free amino acids increases with the hydrolysis time simultaneously by 3 enzymes, the amount of free amino acids hydrolyzed by bromelain> papain> neutrase. (3) Content 3: Hydrolyzed products from pangasius belly and pangasius blood were used as a nutrient medium for strains of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae, which showed better efficiency than comercial peptone through growth and protease biosynthesis of these microorganisms on test media. Keywords: bromelain, papain, neutrase, catfish by-product, hydrolyzate, Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae Ngành Công nghệ Thực phẩm v Khoa Nông Nghiệp
  8. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Luận án “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật” được tác giả thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn Công Hà, khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. Tôi xin cam kết các kết quả, số liệu luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ công trình nào khác. Ngành Công nghệ Thực phẩm vi Khoa Nông Nghiệp
  9. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i TÓM TẮT .......................................................................................................... ii ABSTRACT...................................................................................................... iv DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... xii DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................... xiii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ xv Chương 1: GIỚI THIỆU .................................................................................... 1 1.1 Tính cấp thiết của luận án ............................................................................ 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 4 1.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 5 1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 5 1.5 Ý nghĩa của luận án ..................................................................................... 5 1.6 Điểm mới của luận án .................................................................................. 6 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 7 2.1 Tổng quan về ngành cá tra ........................................................................... 7 2.2 Giới thiệu về nguyên liệu cá tra ................................................................... 8 2.2.1 Giới thiệu chung ....................................................................................... 8 2.2.1.1 Đặc điểm phân loại cá tra ...................................................................... 8 2.2.1.2 Đặc điểm sinh học của cá tra ............................................................... 10 2.2.2 Thành phần hóa học ................................................................................ 11 2.2.3 Thành phần hóa học cơ bản của thịt cá tra phi lê ................................... 11 2.2.4 Việc xử lý phụ phẩm cá tra hiện nay ...................................................... 11 2.3 Tổng quan về protein ................................................................................. 12 2.4 Tổng quan về enzyme ................................................................................ 15 2.5 Enzyme bromelain ..................................................................................... 17 2.5.1 Đặc điểm của enzyme bromelain ............................................................ 17 2.5.2 Cấu tạo của enzyme bromelain ............................................................... 17 2.5.3 Hoạt tính của enzyme bromelain ............................................................ 19 2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain .................. 20 Ngành Công nghệ Thực phẩm vii Khoa Nông Nghiệp
  10. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ 2.6 Enzyme papain ........................................................................................... 21 2.6.1 Đặc điểm của enzyme papain ................................................................. 21 2.6.2 Cấu tạo của enzyme papain .................................................................... 21 2.6.3 Hoạt tính của enzyme papain .................................................................. 23 2.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme papain ....................... 25 2.7 Enzyme neutrase ........................................................................................ 26 2.7.1 Đặc điểm của enzyme neutrase............................................................... 26 2.7.2 Cấu tạo của enzyme neutrase .................................................................. 26 2.7.3 Đặc điểm phân tử neutrase...................................................................... 27 2.8 Động học của enzyme ................................................................................ 27 2.9 Cơ chế thủy phân của enzyme protease ..................................................... 32 2.10. Các Phương pháp loại bỏ lipid ............................................................... 33 2.11 Giới thiệu về công nghệ sấy phun ........................................................... 34 2.12 Giới thiệu về vi sinh vật ........................................................................... 34 2.12.1 Tổng quan về Bacillus subtilis .............................................................. 36 2.12.2 Tổng quan về Aspergillus oryzae ......................................................... 38 2.13 Một số nghiên cứu thủy phân protein thủy sản........................................ 41 Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 45 3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................. 45 3.1.1 Thời gian và địa điểm ............................................................................. 45 3.1.2 Nguyên vật liệu ....................................................................................... 45 3.1.3 Dụng cụ và hóa chất................................................................................ 45 3.1.3.1 Dụng cụ ................................................................................................ 45 3.1.3.2 Hóa chất ............................................................................................... 46 3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 46 3.2.1 Phương pháp phân tích ........................................................................... 46 3.2.2 Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu ................................................... 48 3.3 Nội dung bố trí thí nghiệm......................................................................... 48 3.3.1 Xác định thành phần hóa lý phụ phẩm cá tra.......................................... 48 3.3.1.1 Xác định thành phần hóa học của dè cá tra ......................................... 48 3.3.1.2 Xác định thành phần hóa học của máu cá tra ..................................... 49 Ngành Công nghệ Thực phẩm viii Khoa Nông Nghiệp
  11. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ 3.3.2 Nội dung 1: Nghiên cứu thủy phân phụ phẩm thịt dè cá tra ................... 49 3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tách béo của dung dịch NaHCO3... 49 3.3.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định các thông số động học vmax và km thủy phân thịt dè cá bằng 3 enzyme ngoại bào ................................................................. 50 3.3.2.3 Thí nghiệm 3: Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân thịt dè cá bằng 3 enzyme ngoại bào................................................................................. 53 3.3.3 Nội dung 2: Nghiên cứu thủy phân phụ phẩm máu cá tra ...................... 56 3.3.3.1 Thí nghiệm 4: Xác định hiệu suất thu hồi máu cá bằng nhiệt độ, pH và thời gian ........................................................................................................... 56 3.3.3.2 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng tách béo của dung dịch NaHCO3... 57 3.3.3.3 Thí nghiệm 6: Xác định các thông số động học vmax và km thủy phân máu cá tra bằng 3 enzyme ngoại bào ............................................................... 58 3.3.2.3 Thí nghiệm 7: Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân máu cá bằng 3 enzyme ngoại bào................................................................................. 60 3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật ............................................................................................................. 64 3.3.3.1 Thí nghiệm 8: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật ................................................................................. 64 3.3.3.2 Thí nghiệm 9: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân máu cá tra ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật ................................................................................. 67 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 71 4.1 Xác định thành phần hóa lý phụ phẩm cá tra............................................. 71 4.2 Nội dung 1: Nghiên cứu thủy phân phụ phẩm thịt dè cá tra ...................... 72 4.2.1 Khảo sát khả năng tách béo của dung dịch NaHCO3 ............................ 72 4.2.2 Xác định các thông số động học vmax và km thủy phân thịt dè cá bằng 3 enzyme ngoại bào ............................................................................................ 73 4.2.3 Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân thịt dè cá bằng 3 enzyme protease ............................................................................................................ 77 4.2.3.1 Hiệu suất thủy phân theo hàm lượng tyrosin sinh ra ........................... 77 4.2.3.2 Hiệu suất thủy phân đạm amine bằng phương pháp OPA ................... 82 4.2.3.3 Hàm lượng acid amin trong quá trình thủy phân thịt dè cá bằng 3 enzyme protease (bromelain, papain và neutrase) ........................................... 85 4.3 Nội dung 2: Nghiên cứu thủy phân phụ phẩm máu cá tra ......................... 89 4.3.1 Kết quả nghiên cứu thu hồi protein từ nước rửa máu cá tra ................... 89 Ngành Công nghệ Thực phẩm ix Khoa Nông Nghiệp
  12. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ 4.3.2 Khảo sát khả năng tách béo của dung dịch NaHCO3 ............................. 90 4.3.3 Xác định các thông số động học vmax và km thủy phân máu cá tra bằng 3 enzyme ngoại bào ............................................................................................ 90 4.3.4 Xác định cặp tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân máu cá bằng 3 enzyme ngoại bào .......................................................................................................... 93 4.3.4.1 Hiệu suất thủy phân theo hàm lượng tyrosin sinh ra ........................... 93 4.2.3.2 Hiệu suất thủy phân đạm amine bằng phương pháp OPA ................... 98 4.4 Sấy phun dịch thủy phân.......................................................................... 100 4.4 Nội dung 3: Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật ........................................................................................................... 102 4.4.1 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật ....................................................................................................... 102 4.4.1.1 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis .............................................................................................. 102 4.4.1.2 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân thịt dè cá tra nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae.......................................................................................... 105 4.4.2 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân máu cá tra ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật ........................................................................................................... 107 4.4.2.1 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân máu cá tra nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis .............................................................................................. 107 4.4.2.2 Nghiên cứu sử dụng protein thủy phân máu cá tra nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae.......................................................................................... 109 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... 112 5.1 Kết luận .................................................................................................... 112 5.2 Kiến nghị.................................................................................................. 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 115 PHỤ LỤC ...................................................................................................... 121 PHỤ LỤC A. CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA PHÂN TÍCH................. 121 1 Phương pháp xác định hàm lượng ẩm ........................................................ 121 2 Xác định hàm lượng chất béo ..................................................................... 121 3 Phương pháp xác định hàm lượng đạm ...................................................... 123 4 Xác định hàm lượng tyrosine theo phương pháp Anson cải tiến ............... 124 5 Phương pháp xác định hàm lượng tyrosin tổng .......................................... 128 Ngành Công nghệ Thực phẩm x Khoa Nông Nghiệp
  13. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ 6 Xác định hàm lượng đạm amine bằng phương pháp OPA (AOAC., 2000) ...... 128 PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ ............................................ 130 PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ ............................................ 130 1. Thủy phân thịt dè cá bằng enzyme ngoại bào............................................ 130 B.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaHCO3 đến hàm lượng lipid và protein thịt cá ................................................................................................ 135 B2. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaHCO3 đến hàm lượng protein và protein thịt cá ................................................................................................ 136 B.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaHCO3 đến hàm lượng lipid và protein máu cá .............................................................................................. 138 3. Thủy phân máu cá bằng enzyme papain .................................................... 155 4. Thủy phân máu cá bằng enzyme bromelain .............................................. 159 PHỤ LỤC C: PHIẾU PHÂN TÍCH ACID AMIN ........................................ 175 Ngành Công nghệ Thực phẩm xi Khoa Nông Nghiệp
  14. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Thành phần hóa học của thịt cá tra phi lê (Theo căn bản khô) ....... 11 Bảng 2.2: Phần trăm phần thu được trong chế biến cá tra phi lê ..................... 12 Bảng 2.3: Thành phần axit amin của papain.................................................... 21 Bảng 2.4: Tính chất vật lí của papain .............................................................. 23 Bảng 4.1: Thành phần hóa lý của thịt dè cá tra và máu cá .............................. 71 Bảng 4. 2: Thành phần các acid amin (mg/100 mL) của phụ phẩm thịt dè tra và máu cá tra. ................................................................................................... 72 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ NaHCO3 đến hàm lượng lipid và protein 73 Bảng 4.4Thông số động học của các enzyme .................................................. 74 Bảng 4.5: Thành phần acid amin (mg/100 mL) trong quá trình thủy phân bằng enzyme neutrase theo thời gian ....................................................................... 86 Bảng 4.6: Thành phần acid amin (mg/100 mL) trong quá trình thủy phân bằng enzyme papain theo thời gian .......................................................................... 87 Bảng 4.7: Thành phần acid amin (mg/100 mL) trong quá trình thủy phân bằng enzyme bromelain theo thời gian..................................................................... 88 Bảng 4. 8: Ảnh hưởng của nồng độ NaHCO3 đến hàm lượng lipid và protein 90 Bảng 4. 9: Thông số động học của các enzyme ............................................... 91 Bảng 4. 10: Sản phẩm sấy phun của các dung dịch thủy phân ...................... 100 Bảng 4. 11: Thành phần hóa học cơ bản của sản phẩm thủy phân protein từ phụ phẩm cá tra và pepton thương mại.................................................................... 101 Bảng 4. 12: Thành phần acid amin của các dung thủy phân sau khi sấy phun ........................................................................................................................ 101 Ngành Công nghệ Thực phẩm xii Khoa Nông Nghiệp
  15. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2 1: Cá tra .................................................................................................. 9 Hình 2 2: Cấu trúc protein từ bậc 1 tới bậc 4 .................................................. 14 Hình 2 3: Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelain ..................................... 18 Hình 2 4: Cấu trúc không gian của enzyme bromelain ................................... 18 Hình 2 5: Cấu trúc không gian của enzyme papain ......................................... 22 Hình 2 6: Phản ứng của enzyme papain .......................................................... 25 Hình 2 7: Thể hiện năng lượng hoạt hóa có và không có chất xúc tác ............ 28 Hình 2 8: Mô hình “khóa và chìa khóa” .......................................................... 29 Hình 2 9: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng .................. 30 Hình 2 10: Đồ thị thể hiện phương trình Lineweaver-Burke .......................... 32 Hình 4.1: Đồ thị thể hiện vmax và km của enzyme bromelain trên thịt dè cá tra .......................................................................................................................... 75 Hình 4.2: Đồ thị thể hiện vmax và km của enzyme papain trên thịt dè cá tra .... 75 Hình 4.3: Đồ thị thể hiện vmax và km của enzyme neutrase trên thịt dè cá tra . 76 Hình 4. 4: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỉ lệ E/S và thời gian thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme bromelain ..................................... 78 Hình 4.5: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme bromelain theo tỉ lệ E/S và thời gian. .............................................................. 78 Hình 4. 6: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme papain ........................................... 79 Hình 4. 7: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme papain theo tỉ lệ E/S và thời gian. .................................................................... 80 Hình 4.8: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỉ lệ E/S và thời gian thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme neutrase ........................................ 81 Hình 4.9: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme neutrase theo tỉ lệ E/S và thời gian. ................................................................. 82 Hình 4. 10: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme bromelain theo tỉ lệ E/S và thời gian. ................................................. 83 Hình 4. 11: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme papain theo tỉ lệ E/S và thời gian ....................................................... 83 Hình 4. 12: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân thịt dè cá tra bằng enzyme neutrase theo tỉ lệ E/S và thời gian. .................................................... 84 Hình 4. 13: Đồ thị hiệu suất thu hồi protein tại nhiệt độ 700C, thời gian (40, 50, 60 phút), pH (4, 4,5, 5, 5,5 và 6)................................................................ 89 Hình 4. 14: Đồ thị thể hiện vmax, km của enzyme bromelain trên cơ chất máu cá tra .......................................................................................................................... 91 Hình 4. 15: Đồ thị thể hiện vmax, km của enzyme papain trên cơ chất máu cá tra .. 92 Hình 4. 16: Đồ thị thể hiện vmax, km của enzyme neutrase trên cơ chất máu cá tra 92 Ngành Công nghệ Thực phẩm xiii Khoa Nông Nghiệp
  16. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ Hình 4. 17: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỉ lệ E/S và thời gian thủy phân máu cá tra bằng enzyme bromelain ........................................ 94 Hình 4. 18: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng enzyme bromelain theo tỉ lệ E/S và thời gian. .............................................................. 94 Hình 4. 19: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỉ lệ E/S và thời gian thủy phân máu cá tra bằng enzyme papain .............................................. 95 Hình 4. 20: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng enzyme papain theo tỉ lệ E/S và thời gian. .................................................................... 96 Hình 4. 21: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo tỉ lệ E/S và thời gian thủy phân máu cá tra bằng enzyme neutrase ........................................... 97 Hình 4. 22: Hiệu suất tyrosin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng enzyme neutrase theo tỉ lệ E/S và thời gian. ................................................................. 97 Hình 4. 23: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng enzyme bromelain theo tỉ lệ E/S và thời gian .................................................. 98 Hình 4. 24: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng enzyme papain theo tỉ lệ E/S và thời gian ....................................................... 99 Hình 4. 25: Hiệu suất đạm amin từ quá trình thủy phân máu cá tra bằng enzyme neutrase theo tỉ lệ E/S và thời gian. .................................................... 99 Hình 4. 26: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis trong môi trường thủy phân protein dè cá tra và môi trường peptone thương mại. ........................................................................................................................ 102 Hình 4. 27: Hoạt tính protease của vi khuẩn B.subtilis trong các môi trường dinh dưỡng thịt dè và môi trường peptone thương mại ................................. 104 Hình 4. 28: Đường cong tăng trưởng của Aspergillus oryzae trong các môi trường thủy phân protein dè cá tra và môi trường peptone thương mại. ....... 105 Hình 4. 29: Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae trong các môi trường thủy phân protein dè cá tra và môi trường peptone thương mại .................... 106 Hình 4. 30: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn B.subtilis trong các môi trường thủy phân protein máu cá tra và môi trường peptone thương mại ..... 107 Hình 4. 31: Hoạt tính protease của vi khuẩn B.subtilis trong các môi trường thủy phân protein máu cá tra và môi trường peptone thương mại................. 108 Hình 4. 32: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn Aspergillus oryzae trong các môi trường thủy phân protein máu cá tra và môi trường peptone thương mại .... 109 Hình 4. 33: Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae trong các môi trường thủy phân protein máu cá tra và môi trường peptone thương mại .............................. 110 Ngành Công nghệ Thực phẩm xiv Khoa Nông Nghiệp
  17. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TMAO: Trimethylamin oxid TMA: Trimethylamin EDTA: Ethylendiamin tetraacetic acid EGTA: Ethylene glycol tetraacetic acid DE: Equivalent dextrose, đương lượng dextrose E/ S: Enzyme/ substrate (tỉ lệ enzyme trên cơ chất) Ttp/ Tt: Tyrosin thủy phân / tyrosin tổng DH: Degree hydrolysis, hiệu suất thủy phân aw: Độ hoạt động của nước Vmax: Vận tốc cực đại của enzyme Km: Hằng số tốc độ phản ứng của enzyme gPro: Khối lượng protein gTyr: khối lượng tyrosin OPA: 0-phthaldialdehyde TNBS: Trinitrobenzene sulphonic acid SDS: Sodium dodecyl sulphate DTT: Dithiothreitol APS: Amonium persulphat TEMED: Tetramethylethylenediamine TCA: Tricloacetic acid CFU/ g: Số khuẩn lạc trên 1 gam KPH: Không phát hiện mgN/ gNL: Khối lượng Nitơ/ khối lượng nguyên liệu pH stat: Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân protein Ngành Công nghệ Thực phẩm xv Khoa Nông Nghiệp
  18. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Nhiều quốc gia trên thế giới coi ngành công nghiệp cá là trụ cột của nền kinh tế của họ với sản lượng hàng năm khoảng 140 triệu tấn, trong đó khoảng 80% được dành cho tiêu dùng của con người (Benfteres et al., 2012). Người ta ước tính rằng 1 tỷ người phụ thuộc trực tiếp hoặc gián tiếp vào ngành hàng chế biến và xuất khẩu cá (Oosterveer, 2008). Tuy nhiên, trong quá trình chế biến cho thấy các sản phẩm phụ từ cá chưa được sử dụng hết bao gồm đầu, da, thịt vụn, vây, nội tạng và trứng cá, chiếm hơn 60% tổng sinh khối. Phụ phẩm chế biến cá là nguyên liệu cá còn sót lại từ quá trình xử lý sơ bộ của quá trình sản xuất (He et al., 2013). Trong hầu hết các trường hợp, những phụ phẩm từ cá này bị loại bỏ mà không có ý định thu hồi (Halim et al., 2016). Hơn nữa, việc loại bỏ các sản phẩm phụ của cá có tác động sinh thái lớn và cũng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng kinh tế của ngành đánh bắt và nuôi trồng thủy sản. Các biện pháp kỹ thuật bắt buộc phải sử dụng phụ phẩm từ cá làm nguyên liệu để sản xuất các hợp chất có giá trị gia tăng (Morales-Medina et al., 2016). Trong những năm qua, nghề nuôi cá tra ở Việt Nam phát triển nhanh chóng góp phần vào việc nâng cao thu nhập của người nuôi và đồng thời sản phẩm cá tra cũng là một trong những mặt hàng chiếm tỷ trọng cao trong xuất khẩu thủy sản. Theo số liệu thống kê của vasep từ năm 2015 đến 2019 sản lượng cá tra liên tục tăng. Năm 2015, Việt Nam xuất khẩu cá tra đạt 1,565 tỷ USD đến năm 2018, tăng lên 2,261 tỷ USD. Tính đến ngày 19/11/2019, diện tích thả nuôi là 7.127 ha (tăng 2.086 ha bằng 41,3% so với cùng kỳ năm 2018), diện tích thu hoạch là 5.412 ha (tăng 1.669 ha bằng 44,6% so với cùng kỳ năm 2018). Sản lượng thu hoạch đạt 1.072.677 tấn (giảm 84,323 tấn giảm 0,7% so với cùng kỳ 2018). Tính đến tháng 9/2019, tổng diện tích nuôi cá tra áp dụng VietGAP khoảng 2.000 ha, áp dụng GAP khác (GlobalGAP, ASC, BAP…), đạt 1.900 ha. (https://www.fistenet.gov.vn). Bên cạnh việc nuôi trồng và xuất khẩu cá tra tăng nhanh, quá trình chế biến cá tra thành sản phẩm đông lạnh xuất khẩu chỉ sử dụng 1/3 khối lượng nguyên liệu đầu vào, phần còn lại thải ra như đầu xương cá, da cá, dè cá, mỡ cá, bao tử cá, thịt vụn cá, máu cá đây là những phụ phẩm chứa rất nhiều các thành phần có giá trị dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học, dầu ăn, gelatin, phân bón lá, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm. Nếu sản lượng nguyên liệu cá tra 1 triệu tấn/năm thì có khoảng 600.000 tấn phụ phẩm. Phần phụ phẩm sau chế biến cá tra phi lê chiếm khoảng 60-65% tổng khối lượng nguyên liệu, là nguyên liệu đầu vào cho chế biến bột phụ phẩm cá tra, những phụ phẩm này Ngành Công nghệ thực phẩm 1 Khoa Nông nghiệp
  19. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ bao gồm đầu, xương, da và thịt vụn còn lại sau khi phi lê hai bên đã được xay tươi, luộc chín và loại bỏ dầu, sau đó sấy khô để sản xuất phụ phẩm cá da trơn. Trong quá trình này, một lượng lớn nước thải chế biến được thải ra ngoài, đặc biệt ở các nhà máy quy mô nhỏ, không có hệ thống máy móc hiện đại để sử dụng trong quá trình xử lý và thải ra môi trường bên ngoài, dẫn đến lãng phí tài nguyên gây ô nhiễm môi trường (Nguyen Thi Thuy and Nguyen Cong Ha, 2017). Do đó, phụ phẩm về cơ bản được coi là chất thải phải được xử lý, nếu không sẽ gây ô nhiễm môi trường. Những sản phẩm phụ này có thể là một nguồn giá trị gia tăng lớn như protein, axit amin, collagen, gelatin, dầu và enzym (Ghaly et al., 2013). Các sản phẩm phụ (chủ yếu là đầu và khung xương) là một nguồn protein tuyệt vời (42,7% protein, db) có giá trị dinh dưỡng cao và nó có thể được chế biến thành các sản phẩm hoặc thành phần thực phẩm có giá trị gia tăng với các giá trị chức năng và dinh dưỡng mong muốn (Pal and Suresh, 2016; Tan and Chang, 2018; Tan, Gao, Chang, Bechtel and Mahoud, 2019). Hơn nữa, tới 10-20% (w/w) tổng lượng protein cá có thể được tìm thấy trong các sản phẩm phụ của cá. Ngoài ra, hàm lượng protein thô của phụ phẩm cá thay đổi từ 8 đến 35% (Sila and Bougatef, 2016). Để thu hồi protein và peptid từ các sản phẩm phụ của cá, một số phương pháp như thủy phân bằng axit hoặc kiềm, tự phân và thủy phân bằng enzym đã được phát triển. Các protein cá không thủy phân không có các đặc tính này do khả năng tiếp cận kém với trình tự peptid chức năng (Ghaly et al., 2013; Kim and Wijesekara, 2010). Gần đây, một số tác giả đã tinh chế sản phẩm thủy phân từ cá và đã báo cáo chuỗi peptid có hoạt tính sinh học khác nhau như chất chống oxy hóa (Ahn et al., 2014; Cai et al., 2015; Chi et al., 2015a, b), hoạt tính hạ huyết áp (Intarasirisawat et al., 2013), hoạt động kháng khuẩn (Ennaas et al., 2015), hoạt động giải phóng cholecystokinin (Cudennec và cộng sự 2008), và chống tăng sinh (Picot et al., 2006). Mặt khác, sản phẩm thủy phân protein được chế biến từ các bộ phận nội tạng của cá chứa nhiều peptid có đặc tính dinh dưỡng và chức năng tốt hơn. Chất lượng của sản phẩm thủy phân protein nội tạng dạng sấy phun chiết xuất từ chất thải chế biến cá tra bằng phương pháp xử lý bằng enzym và hóa học đã được nghiên cứu và đánh giá ảnh hưởng của chúng đến năng suất, thành phần hóa học, màu sắc và các đặc tính chức năng (Md. Aman Hassan et al., 2018). So với thủy phân hóa học, thủy phân bằng enzym được ưa chuộng hơn do một số ưu điểm, chẳng hạn như điều kiện phản ứng nhẹ, sản phẩm không mong muốn thấp, chất lượng và sản phẩm cao. Hơn nữa, nó là một quá trình cụ thể với việc kiểm soát dễ dàng mức độ thủy phân cũng như cho phép giữ lại Ngành Công nghệ thực phẩm 2 Khoa Nông nghiệp
  20. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ giá trị dinh dưỡng của protein nguồn. Ưu điểm chính của quá trình thủy phân protein bằng enzyme là nó cho phép định lượng aspargine và glutamine và các chất cặn nhạy cảm khác, thường bị phá hủy bởi quá trình thủy phân bằng acid hoặc kiềm, và không gây ra bất kỳ sự phân hóa nào trong quá trình tiêu hóa (Ghaly et al., 2013). Trong quá trình này, một số enzyme phân giải protein thường được sử dụng để thủy phân protein và chuyển chúng thành các sản phẩm chức năng, sinh học và đặc tính dinh dưỡng có giá trị gia tăng (Kristinsson and Rasco, 2000; Shahidi et al., 1995). Một số enzym phân giải protein thường được sử dụng để thủy phân các sản phẩm phụ của protein bao gồm: alcalase, papain, pepsin, trypsin, alpha-chymotrypsin, pancreatin, flavourzyme, pronase, neutrase, protamex, bromelain, cryotin F, protease N, protease A, orientase, thermolysin , và validase (Hsu, 2010; Je et al., 2007; Ngo et al., 2010; Raghavan and Kristinsson, 2008). Sản xuất protein cá thủy phân thông qua thủy phân bằng enzyme là một cách để tăng thêm giá trị cho chất thải cá giàu protein. Do đó, chế biến dịch thủy phân từ phụ phẩm cá tra sẽ giúp tận dụng tốt hơn các sản phẩm phụ thường được sử dụng cho ngành công nghiệp thức ăn vật nuôi hoặc thức ăn cho cá. Nguồn phụ phẩm từ da được thu mua và chế biến gelatine, collagen như Nhà máy chế biến collagen Vĩnh Hoàn Đồng Tháp, sản phẩm collagen thủy phân sẽ được dùng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm. Vây cá cũng được dùng trong chế biến collagen, ngoài ra vây và bao tử cá cũng được xuất khẩu hay dùng trong chế biến thức ăn tại các nhà hàng. Thịt dè cá tra cũng được sử dụng trong chế biến surimi hay dạng cá viên. Như vậy, những phần trong phụ phẩm cá tra đã được tận dụng nhưng cũng chỉ sử dụng không quá 30% tổng số phụ phẩm. Việc sử dụng các thành phần phụ phẩm khác như máu cá, thịt vụn, protein từ đầu hay xương cá chưa được quan tâm. Nguồn phụ phẩm này chủ yếu được đem đi sơ chế, sấy khô làm bột cá dùng trong thức ăn chăn nuôi là chủ yếu. Những nguồn phụ phẩm này là rất lớn, nếu không được xử lý thì môi trường nhanh chóng bị ô nhiễm. Có thể nói, việc sử dụng phụ phẩm cá tra chưa thật sự hiệu quả, đây chính là thực trạng hiện nay của công nghiệp sản xuất các sản phẩm có giá trị từ cá tra. Như vậy, việc xử lý phụ phẩm cá tra hiệu quả, kinh tế và thân thiện với môi trường ngày càng trở nên cấp thiết. Sản phẩm thủy phân protein từ phụ phẩm của cá được sự chú ý ngày càng nhiều trong những năm gần đây. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá các điều kiện thủy phân và các tính chất chức năng của sản phẩm thủy phân protein cá. Chẳng hạn, một số nghiên cứu đã báo cáo việc thủy phân các sản phẩm phụ của cá bằng enzyme để thu hồi các thành phần có giá trị (Je Ngành Công nghệ thực phẩm 3 Khoa Nông nghiệp
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

TL.01: Bộ Tiểu Luận Triết Học
207 tài liệu
1474 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2