Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:241

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ" trình bày các nội dung chính sau: : Phân lập và định danh các chủng tảo Chlorella spp; Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng tảo Chlorella spp. bằng chỉ thị sinh học phân tử PCR-ISSR; Sàng lọc các chủng tảo Chlorella có tiềm năng ứng dụng vào xử lý nước thải; Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp. và ly trích lipid từ sinh khối tảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHAN MINH TÂM NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ CHỌN LỌC CÁC CHỦNG TẢO CHLORELLA SP. ĐƯỢC THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH NAM BỘ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2025
BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHAN MINH TÂM NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ CHỌN LỌC CÁC CHỦNG TẢO CHLORELLA SP. ĐƯỢC THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH NAM BỘ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. HUỲNH VĂN BIẾT PGS.TS. BÙI MẠNH HÀ Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2025
i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Huỳnh Văn Biết và PGS.TS. Bùi Mạnh Hà vì đã tận tình truyền đạt kiến thức, hướng dẫn và hỗ trợ cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn cha mẹ cùng toàn thể thành viên trong gia đình đã luôn động viên, làm chỗ dựa tinh thần cho tôi trong suốt thời gian làm luận án. Đồng thời, tôi xin cảm ơn vợ tôi là Đặng Quỳnh Như, người luôn sát cánh bên cạnh tôi làm chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin được chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Ban chủ nhiệm cùng tập thể Khoa Khoa học Sinh học và Phòng Sau Đại học thuộc Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo cùng tập thể viên chức tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường thuộc Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tôi cũng chân thành xin cảm ơn nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Bùi Mạnh Hà đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến em Trần Hữu Thành và em Nguyễn Tấn Tài đã hỗ trợ hết mình trong suốt thời gian thực hiện luận án. Chân thành gửi lời thành cảm ơn đến Thầy/Cô, anh chị Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và các em sinh viên đã hỗ trợ tôi trong suốt khoảng thời gian thực hiện luận án. Một lần nữa tôi xin được cảm ơn toàn thể nhóm nghiên cứu đã hết mình giúp đỡ tôi khi luận án trong tình trạng khó khăn nhất. Xin chân thành cảm ơn.
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án PHAN MINH TÂM
iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ ii MỤC LỤC ....................................................................................................................... iii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ viii DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................ x TÓM TẮT ...................................................................................................................... xii ABSTRACT .................................................................................................................. xiv MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN............................................................................................ 4 1.1. Tổng quan về tảo Chlorella ........................................................................................ 4 1.1.1. Tiêu chuẩn hình thái tảo Chlorella .......................................................................... 5 1.1.2. Các vùng trình tự được dùng để định danh tảo Chlorella ........................................ 7 1.1.3. Hàm lượng lipid, thành phần lipid và tiềm năng ứng dụng làm nhiên liệu sinh học của tảo Chlorella ............................................................................................................... 9 1.2. Đa dạng di truyền ở tảo Chlorella............................................................................. 10 1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến tăng trưởng của tảo Chlorella .................................... 12 1.3.1. Môi trường nuôi cấy .............................................................................................. 12 1.3.2. Các thành phần hữu cơ .......................................................................................... 13 1.3.3. Sục khí trong nuôi cấy tảo ..................................................................................... 14 1.4. Ứng dụng Chlorella vào trong xử lý nước thải và thử nghiệm ly trích lipid ............. 14 1.4.1. Xử lý nước thải bằng tảo Chlorella ....................................................................... 14 1.4.2. Ly trích lipid từ tảo Chlorella ................................................................................ 17 1.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước ........................................................................ 23 CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 25 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................................. 25 2.1.1. Thời gian................................................................................................................ 25
iv 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................................. 25 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 25 2.3. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................... 26 2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 26 2.4.1. Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng tảo Chlorella spp. .......................... 26 2.4.1.1. Phương pháp thu mẫu tảo ................................................................................... 26 2.4.1.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào tảo ............................................................ 26 2.4.1.3. Phương pháp phân lập và nuôi cấy tăng sinh tảo ................................................ 26 2.4.1.4. Phương pháp định danh phân tử ......................................................................... 27 2.4.2. Nội dung 2: Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng tảo Chlorella spp. bằng chỉ thị sinh học phân tử PCR - ISSR. .................................................................................... 28 2.4.2.1. Quy trình PCR với chỉ thị ISSR .......................................................................... 28 2.4.2.2. Xử lý số liệu ....................................................................................................... 30 2.4.3. Nội dung 3: Sàng lọc các chủng tảo Chlorella có tiềm năng ứng dụng vào xứ lý nước thải ................................................................................................................................... 30 2.4.3.1. Khảo sát ngưỡng chịu đựng ammonium của tảo Chlorella ................................. 30 2.4.3.2. Khảo sát khả năng loại bỏ nitrate của Chlorella ................................................. 31 2.4.3.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy tảo Chlorella ....................................................... 32 2.4.4. Nội dung 4: Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp. và ly trích lipid từ sinh khối tảo .................................................................................................................... 33 2.4.4.1. Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp............................................. 33 2.4.4.2. Nghiên cứu ly trích lipid từ sinh khối tảo ........................................................... 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 43 3.1. Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng tảo Chlorella spp. ............................. 43 3.1.1. Đánh giá hình thái các mẫu tảo thu được ............................................................... 43 3.1.2. Định danh tảo bằng phương pháp sinh học phân tử. .............................................. 52 3.2. Nội dung 2: Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng tảo Chlorella spp. bằng chỉ thị sinh học phân tử PCR - ISSR........................................................................................... 69 3.2.1. Khảo sát nhiệt độ của các primer sử dụng cho phản ứng PCR – ISSR .................. 69
v 3.2.2. Sản phẩm PCR với chỉ thị ISSR ............................................................................ 75 3.2.3. Phân tích sự đa dạng di truyền của 8 mẫu tảo Chlorella ........................................ 78 3.3. Nội dung 3: Đánh giá khả năng ứng dụng các chủng tảo Chlorella vào xứ lý nước thải ......................................................................................................................................... 86 3.3.1. Khảo sát ngưỡng chịu đựng ammonium của Chlorella .......................................... 86 3.3.2. Khảo sát khả năng loại bỏ nitrate của Chlorella. ................................................... 90 3.3.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy tảo Chlorella. ......................................................... 94 3.4. Nội dung 4: Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp. và ly trích lipid từ sinh khối tảo .......................................................................................................................... 100 3.4.1. Thử nghiệm ứng dụng tảo Chlorella và sóng âm nhạc vào trong xử lý nước thải 100 3.4.2. Nghiên cứu ly trích lipid từ sinh khối tảo Chlorella dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm và đánh giá vòng đời sản phẩm...................................................................................... 115 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 136 4.1. Kết luận .................................................................................................................. 136 4.2. Kiến nghị ................................................................................................................ 137 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ ....................................................................................................................................... 138 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 139 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1 PHỤ LỤC CÁC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẢO ..................................................... 1 PHỤ LỤC NỘI DUNG 1 ................................................................................................. 3 PHỤ LỤC NỘI DUNG 2 ............................................................................................... 58 PHỤ LỤC NỘI DUNG 4 ............................................................................................... 68
vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism BBM Bold's Basal Medium BD Bình Dương BOD5 Biological Oxygen Demand bp Base pair CG Cần Giờ CI Chloroform/Isoamyl alcohol COD Chemical Oxygen Demand CTAB cetyl trimethyl ammonium bromide ctv Cộng tác viên DNA Deoxyribonucleic acid DO Dissolved oxygen ĐN Đồng Nai ĐT Đồng Tháp EB Elution buffer EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid HAMGM Highly Assimilable Minimal Growth medium ISSR Inter Simple Sequence Repeat ITS Internal Transcribed Spacer LA Long An LCA Life Cycle Accessment OD Optical density PCI Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol QCVN Quy chuẩn Việt Nam rbcL Ribulose - bisphosphate carboxylase S/N Signal - to - noise SSR Simple Sequence Repeat
vii TAE Tris - Acetate - EDTA TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TE Tris - Ethylene Diamine Tetra acetic Acid TG Tiền Giang TN Tổng nitrogen TOC Tổng ô nhiễm hữu cơ UPGMA Unweighted Pair - group Method with Arithmetic Mean UV Ultraviolet
viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Hàm lượng lipid của các loài tảo thuộc chi Chlorella ....................................... 9 Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng trong định danh phân tử tảo Chlorella ................................ 27 Bảng 2.2. Danh sách 18 primer cho phản ứng PCR - ISSR ............................................. 29 Bảng 2.3. Mức độ được mã hóa và chưa mã hóa của các biến độc lập trong nghiên cứu 34 Bảng 2.4. Ma trận của thí nghiệm mô hình lặp tâm và dữ liệu thí nghiệm tương ứng ..... 35 Bảng 2.5. Thí nghiệm ly trích lipid ................................................................................. 37 Bảng 2.6. Thiết kế thí nghiệm sử dụng mảng trực giao Taguchi ..................................... 38 Bảng 3.1. Kết quả các mẫu có hình thái tương đồng cao với Chlorella .......................... 43 Bảng 3.2. Hình thái tế bào tảo của các mẫu thu được...................................................... 45 Bảng 3.3. Nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số của 11 mẫu trong nghiên cứu ............. 53 Bảng 3.4. Kết quả mức độ tương đồng của vùng trình tự 18S rRNA của các mẫu tảo ..... 55 Bảng 3.5. Kết quả mức độ tương đồng của vùng trình tự ITS của các mẫu tảo ............... 56 Bảng 3.6. Kết quả mức độ tương đồng của vùng trình tự rbcL với các mẫu tảo ............. 57 Bảng 3.7. Danh sách các mẫu được sử dụng cho phản ứng PCR – ISSR ........................ 69 Bảng 3.8. Nhiệt độ tối ưu của 14 primer được chọn ........................................................ 72 Bảng 3.9. Tổng hợp số băng DNA của sản phẩm PCR khuếch đại với 14 primer được khảo sát ............................................................................................................................ 75 Bảng 3.10. Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu tảo .................................................... 79 Bảng 3.11. Thông số nước thải đầu vào chợ đầu mối Hóc Môn.................................... 100 Bảng 3.12. thông số động học phản ứng để làm giảm TN trong thí nghiệm ................. 104 Bảng 3.13. Ma trận của thí nghiệm mô hình lặp tâm và kết quả dữ liệu thí nghiệm tương ứng ................................................................................................................................. 112 Bảng 3.14. Kết quả thí nghiệm hàm lượng và tỷ lệ S/N của quy trình ly trích lipid từ Chlorella CG-20 ............................................................................................................ 116 Bảng 3.15. Các thông số phản hồi về ý nghĩa ............................................................... 117 Bảng 3.16. Các thông số đáp ứng tỷ lệ S/N ................................................................... 117 Bảng 3.17. Thành phần acid béo chính trong lipid từ Chlorella CG-20 ........................ 124
ix Bảng 3.18. Tổng tác động môi trường do tảo Chlorella CG-20 và quy trình sản xuất dầu theo phương pháp CML và TRACI ............................................................................... 128
x DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Tảo Chlorella .................................................................................................... 4 Hình 1.2.Cây phát sinh loài của tảo Chlorella .................................................................. 5 Hình 1.3. Quá trình phân bào của tảo Chlorella vulgaris .................................................. 6 Hình 1.4. Con đường hấp thu và vận chuyển nitrogen ở tảo ........................................... 14 Hình 1.5. Nguyên lý chiết xuất lipid từ tảo dưới sự hỗ trợ siêu âm ................................. 19 Hình 1.6. Các giai đoạn của đánh giá vòng đời sản phẩm và ranh giới hệ thống sản phẩm để đánh giá LCA .............................................................................................................. 21 Hình 1.7. Minh họa cho đánh giá tác động của vòng đời ................................................ 22 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sóng âm nhạc trên tảo ................................................ 34 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình hệ thống của giai đoạn ly trích dầu từ bột tảo ........................ 38 Hình 2.3. Ranh giới hệ thống vòng đời để sản xuất dầu tảo từ Chlorella sp. . ................ 41 Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose ................................................ 54 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với gen 18S rRNA của 11 mẫu tảo nghiên cứu ......................................................................................................................................... 54 Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loài mô tả chi tiết vị trí phân bố của các chủng tảo phân lập được xây dựng từ vùng trình tự 18S rRNA ...................................................................... 61 Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loài giản lược mô tả chi tiết vị trí phân bố của các chủng tảo phân lập được xây dựng từ vùng trình tự rbcL ........................................................... 63 Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loài mô tả chi tiết vị trí phân bố của các chủng tảo phân lập được xây dựng từ vùng trình tự ITS ................................................................................. 64 Hình 3.6. Kết quả khảo sát nhiệt độ của mẫu CG-20 với mồi ISSR (1; 4; 5) .................. 70 Hình 3.7. Kết quả khảo sát nhiệt độ của CG-20 với mồi ISSR (6; 8; 9) ......................... 70 Hình 3.8. Kết quả khảo sát nhiệt độ của CG-20 với mồi ISSR (10; 11; 12) .................... 71 Hình 3.9. Kết quả khảo sát nhiệt độ của CG-20 với mồi ISSR (13; 14; 15) ................... 71 Hình 3.10. Cây phân nhóm di truyền của 8 mẫu tảo Chlorella ....................................... 80 Hình 3.11. Nồng độ ammonium có tỷ lệ ức chế sinh trưởng 50% đối với các chủng tảo khảo sát ............................................................................................................................ 87
xi Hình 3.12. Khả năng hấp thụ nitrate của các chủng tảo khảo sát .................................... 91 Hình 3.13. Hàm lượng chlorophyll a của tảo Chlorella được nuôi cấy ở các môi trường khác nhau......................................................................................................................... 95 Hình 3.14. Sinh khối khô của Chlorella CG-20 nuôi cấy ở các môi trường khác nhau .. 96 Hình 3.15. Biểu đồ thể hiện hiệu quả làm giảm TN và COD bằng Chlorella CG-20.... 103 Hình 3.16. Biểu đồ đường viền đáp ứng cho việc làm giảm TN trong điều kiện liên tục ....................................................................................................................................... 109 Hình 3.17. Biểu đồ đường viền đáp ứng cho việc làm giảm COD trong điều kiện liên tục ....................................................................................................................................... 110 Hình 3.18. Biểu đồ tối ưu hóa phản ứng của hiệu quả làm giảm TN và COD tối đa..... 111 Hình 3.19. Ảnh hưởng chính của các yếu tố trong thiết kế thí nghiệm Taguchi ........... 118 Hình 3.20. Biểu đồ đường viền ảnh hưởng ................................................................... 119 Hình 3.21. Biểu đồ radar về tác động môi trường của việc ly trích lipid từ Chlorella CG- 20 như được giải thích bởi CML và TRACI .................................................................. 130
xii TÓM TẮT Đề tài: Nghiên cứu Đa dạng Di truyền và Chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam bộ Tác giả: Phan Minh Tâm Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9.42.02.01 Luận án thu thập được 120 mẫu tảo từ các vị trí toạ độ khác nhau tại 5 tỉnh thành thuộc khu vực miền Nam Việt Nam (Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh, Bình Dương, Đồng Tháp, Tiền Giang, Long An và Đồng Nai). Dựa vào tiêu chuẩn hình thái và 3 marker phân tử (18r RNA, ITS, rbcL) của tảo Chlorella, nghiên cứu đã phân lập, chọn lọc thành công và duy trì được 8 chủng tảo Chlorella. Trong đó, các mẫu tảo CG-20, BD-38 và ĐT-51 thuộc loài Chlorella vulgaris. Các mẫu BD-33 và LA-81 thuộc loài Chlorella sorokiniana, các mẫu còn lại là Chlorella sp. (TG-65, TG-67 và ĐN-112). Cả 3 chủng Chlorella vulgaris đều có sự khác biệt về mặt di truyền với nhau. Sự đa dạng di truyền của các chủng tảo trong cùng loài, chưa thể hiện rõ có sự tương quan bởi yếu tố phân bố địa lý của các tỉnh thành được thu thập nghiên cứu luận án. Sự khác biệt đa dạng di truyền của các mẫu trong cùng một loài không có tương quan chặt chẽ bởi yếu tố phân bố địa lý ở các tỉnh thành trong nghiên cứu. Trong 8 chủng Chlorella phân lập được, Chlorella CG-20 có ngưỡng chịu đựng ammonium cao nhất và có khả năng hấp thụ nồng độ nitrate cao nhất. Môi trường thích hợp để nuôi cấy tăng sinh CG-20 là môi trường BBM và HAMGM. Tảo Chlorella CG-20 cho thấy có khả năng loại bỏ TN và COD trong nước thải. Khi kết hợp xử lý nước thải bằng tảo Chlorella CG-20 và sóng âm nhạc cho hiệu quả cao nhất với tỷ lệ TN 0,0335 L/mg/ngày và COD 0,001 L/mg/ngày. Cơ chế động học của mô hình xử lý nước thải tuân theo mô hình bậc 2, ba thông số tối ưu ứng dụng sóng âm nhạc và tảo Chlorella CG-20 vào trong xử lý nước thải là mật độ tảo 4%, cường độ âm thanh 52,4 dB và thời gian xử lý 4,6 ngày. Phương pháp Taguchi được sử dụng trong thử nghiệm tối ưu hóa quy trình ly trích lipid từ tảo Chlorella CG-20 cho thấy có hiệu quả cao. Yếu tố biên độ sóng siêu âm có ảnh hưởng lớn nhất và thời gian phản ứng ít tác động đến quá trình ly trích lipid. Điều kiện ly
xiii trích lipid tối ưu gồm: tỷ lệ n-hexan/ethanol là 3:1, nhiệt độ 40 ̊C, biên độ siêu âm 80% và thời gian phản ứng là 15 phút. Lipid được ly trích từ tảo Chlorella CG-20 có tiềm năng trở thành nguyên liệu diesel sinh học. Kết quả phân tích LCA cho thấy quy trình khai thác dầu từ sinh khối tảo khô có tác động đáng kể đến môi trường, đặc biệt là về khả năng nóng lên toàn cầu, khả năng acid hóa và khả năng phú dưỡng. Do đó, để giảm thiểu các tác động này nên tập trung giảm thiểu lượng khí thải liên quan đến quá trình ly trích lipid và nâng cao hiệu quả ly trích lipid. Những đóng góp mới của luận án: Luận án đã phân lập và định danh được 8 chủng tảo thuộc chi Chlorella, bao gồm 3 chủng thuộc loài Chlorella vulgaris, 2 chủng thuộc loài Chlorella sorokiniana và 3 chủng chưa xác định được loài. Mức độ đa dạng di truyền giữa các chủng tảo Chlorella vulgaris đã được làm rõ bằng chỉ thị ISSR cho thấy sự đa dạng di truyền của các mẫu tảo trong cùng loài chưa có sự tương quan với phân bố địa lý ở các tỉnh, thành trong nghiên cứu. Xác định được môi trường nuôi thích hợp để phát triển sinh khối chủng Chlorella vulgaris CG20 bao gồm môi trường BBM hoặc HAMGAM, cùng với các điều kiện phù hợp để giảm nitrogen tổng số và chỉ số COD trong nước thải. Xác định được điều kiện tối ưu để trích ly lipid từ chủng tảo Chlorella vulgaris CG20 bằng phương pháp Taguchi và định hướng ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học. Kết quả phân tích LCA chỉ ra rằng quy trình ly trích lipid từ tảo khô có tác động đáng kể đến môi trường. Từ khóa: Chlorella, ISSR Chlorella, xử lý nước thải, ly trích lipid từ tảo.
xiv ABSTRACT Project title: Study of Genetic Diversity and Selection of Chlorella sp. strains collected in some Southern Provinces of Vietnam Ph.D. candidate: Phan Minh Tam Major: Biotechnology Major code: 9.42.02.01 This study investigated Chlorella species diversity and the potential of a selected strain for wastewater treatment and biodiesel production. One hundred and twenty algal samples were collected from five provinces and provincial-level municipalities in southern Vietnam (Can Gio district – Ho Chi Minh City, Binh Duong, Dong Nai, Long An, Tien Giang, and Dong Thap provinces). Morphological and molecular analyses (18S rRNA, ITS, and rbcL) identified eight Chlorella strains: three Chlorella vulgaris (CG-20, BD-38, and ĐT-51), two Chlorella sorokiniana (BD-33 and LA-81), and three Chlorella spp. (TG- 65, TG-67). Genetic differences were observed among the three C. vulgaris strains. No significant correlation was found between the intra-specific diversity of Chlorella strains or samples of the same species and their geographic origin. Among the eight isolates, strain CG-20 exhibited the highest ammonium tolerance and nitrate uptake capacity, with BBM and HAMGM identified as optimal growth media. CG-20 also demonstrated removal capabilities for total nitrogen (TN) and chemical oxygen demand (COD) in wastewater. Combining CG-20 with music soundwaves further enhanced wastewater treatment, achieving removal rates of 0.0335 L/mg/day for TN and 0.001 L/mg/day for COD, following a binomial kinetic model. Optimized treatment parameters were 4% algal concentration, 52.4 dB soundwave amplitude, and 4.6 days of treatment. Lipid extraction from CG-20 was optimized using the Taguchi method, yielding promising results. Soundwave amplitude had the greatest impact on extraction efficiency, while treatment duration had the least. Optimal extraction parameters were n- hexane:ethanol (3:1), 40°C, 80% supersonic wave amplitude, and 15 minutes of treatment. The extracted lipids showed potential for biodiesel production. However, life cycle assessment (LCA) revealed a significant environmental footprint associated with lipid
xv extraction from dried algal biomass, particularly concerning global warming, acidification, and eutrophication. Therefore, efforts to reduce pollutant emissions and improve extraction efficiency are crucial. The new contributions This study isolated and identified 8 strains of algae belonging to the genus Chlorella, including 3 strains belonging to the species Chlorella vulgaris, 2 strains belonging to the species Chlorella sorokiniana, and 3 strains of undetermined species. The level of genetic diversity among the Chlorella vulgaris strains was clarified by ISSR markers, showing that the genetic diversity of the algal samples within the same species did not correlate with the geographical distribution in the provinces and cities in the study. The appropriate culture medium for the growth of Chlorella vulgaris CG20 biomass was determined, including BBM or HAMGAM medium, along with suitable conditions to reduce total nitrogen and COD index in wastewater. The optimal conditions for extracting lipids from the algal strain Chlorella vulgaris CG20 by the Taguchi method were determined and oriented to the application of biofuel production. The LCA analysis results showed that the lipid extraction process from dry algae has a significant impact on the environment. Key words: Chlorella, ISSR Chlorella, wastewater treatment, lipid extraction.
1 MỞ ĐẦU Chlorella là một trong những chi tảo lục phổ biến, trong đó C. vulgaris là một trong những loài tảo đầu tiên được phân lập bởi Beijerinck (1890), loài tảo này được dùng để nghiên cứu về quá trình quang hợp. Ngày nay, Chlorella có đến 44 loài đã được định danh, loài tảo này thường được tìm thấy ở cả thuỷ vực nước ngọt và nước mặn. Nhiều loài trong chi Chlorella có giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học cao. Tuy nhiên, các loài Chlorella khác nhau sẽ có thành phần dinh dưỡng và các chất có hoạt tính sinh học cũng khác nhau. Đặc thù địa lý ở miền Nam Việt Nam có hệ sinh thái đa dạng, đặc biệt là sông ngòi, ao hồ và các vùng đất ngập nước, môi trường sống thích hợp của nhiều loài thủy sinh vật và các loài tảo thuộc chi Chlorella cũng không ngoại lệ. Qua quá trình tiến hóa, sinh vật bản địa đã thích nghi tốt với điều kiện môi trường sống. Việc phân lập chi tảo Chlorella tại khu vực miền Nam Việt Nam, giúp bảo tồn các dòng tảo bản địa và nguồn gen quý, nhằm khai thác và phát triển hiệu quả nguồn gen này. Đặc tính sinh hoá của sinh khối ở 4 chủng tảo C. vulgaris khác nhau, cho thấy hàm lượng lipid và thành phần acid béo đều có sự khác biệt rõ rệt. Sự khác nhau về hàm lượng lipid trong sinh khối và thành phần acid béo sẽ quyết định đến các định hướng ứng dụng cho dòng tảo đó. Hàm lượng lipid và acid béo no cao sẽ có ưu điểm trong sản xuất nguyên liệu sinh học, hàm lượng acid béo không no cao sẽ có tiềm năng để ứng dụng làm thực phẩm chức năng hoặc trong lĩnh vực y dược. Tuy nhiên, đặc điểm phân biệt và điều kiện nhận biết giữa các dòng tảo ở mức độ loài này còn nhiều bỏ ngỏ. Các nghiên cứu đa dạng di truyền cho thấy chỉ thị ISSR là công cụ hữu ích trong các nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể tảo lục (Wongsawad và ctv, 2015). Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền góp phần làm cơ sỡ dữ liệu ban đầu cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. Tiềm năng của chi tảo Chlorella không chỉ nằm ở sinh khối, mà chi tảo Chlorella còn có khả năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong nước. Ứng dụng chi tảo Chlorella vào xử lý nước thải được cho là phương pháp sản xuất sinh khối tảo ít tốn kém và thân thiện với môi trường. Bên cạnh đó, lipid từ chi tảo Chlorella còn được xem như nguồn nguyên liệu đầy tiềm năng để sản xuất biodiesel (nhiên liệu sinh học). Do đó, luận án mong muốn đánh giá được mức độ đa dạng thành phần loài của chi tảo Chlorella, xác định được các
2 loài trong chi tảo Chlorella chiếm ưu thế và sự khác biệt về mặt di truyền của các loài trong chi Chlorella chiếm ưu thế. Từ đó, các chủng Chlorella được tiếp tục đánh giá và chọn lọc theo định hướng hẹp là xử lý nước thải, thử nghiệm thu hồi lipid từ sinh khối tảo, như nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel. Do đó, đề tài “NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ CHỌN LỌC CÁC CHỦNG TẢO Chlorella sp. ĐƯỢC THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH NAM BỘ” đã được thực hiện. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng tảo Chlorella spp. Nội dung 2: Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng tảo Chlorella spp. bằng chỉ thị sinh học phân tử PCR-ISSR. Nội dung 3: Sàng lọc các chủng tảo Chlorella có tiềm năng ứng dụng vào xử lý nước thải Nội dung 4: Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp. và ly trích lipid từ sinh khối tảo Mục tiêu nghiên cứu: 1) Phân lập và định danh được các chủng tảo thuộc chi Chlorella. 2) Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền giữa các chủng tảo Chlorella đã phân lập được bằng chỉ thị ISSR. 3) Xác định được các điều kiện phù hợp khi ứng dụng tảo Chlorella đã phân lập được, để giảm nitrogen tổng số và chỉ số COD trong nước thải. 4) Xác định được điều kiện tối ưu để trích ly lipid từ chủng tảo phân lập được. Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu đã phân lập thành công các chủng tảo Chlorella và thực hiện định danh dựa trên phân tích hình thái kết hợp với trình tự DNA barcode. Đồng thời, luận án tiến hành phân tích đa dạng di truyền của các chủng được thu thập từ một số tỉnh thành ở miền Nam Việt Nam bằng chỉ thị ISSR. Kết quả này đóng góp dữ liệu khoa học quan trọng về đa dạng di truyền của tảo Chlorella tại khu vực nghiên cứu. Ngoài ra, nghiên cứu đã xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng CG20, giúp phát huy hiệu quả trong xử lý nước thải. Đồng thời, các điều kiện trích ly lipid từ chủng này cũng được tối ưu hóa nhằm phục vụ ứng dụng trong xử lý nước thải và sản xuất nhiên liệu sinh học, góp phần mở rộng tiềm năng thực tiễn của tảo Chlorella trong lĩnh vực môi trường và năng lượng tái tạo.
3 Ý nghĩa thực tiễn: Luận án xác định được các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng tảo CG-20, giúp phát huy hiệu quả xử lý nước thải. Bên cạnh đó, luận án còn xác định được các điều kiện ly trích tối ưu cho chủng tảo CG-20 và góp phần mở rộng tiềm năng thực tiễn của tảo Chlorella trong lĩnh vực môi trường và năng lượng tái tạo. Đối tượng nghiên cứu: 120 mẫu tảo thu thập từ 5 tỉnh thành khu vực miền Nam Việt Nam (Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh, Bình Dương, Đồng Tháp, Tiền Giang, Long An, Đồng Nai). Những đóng góp mới của luận án Luận án đã phân lập và định danh được 8 chủng tảo thuộc chi Chlorella, bao gồm 3 chủng thuộc loài Chlorella vulgaris, 2 chủng thuộc loài Chlorella sorokiniana và 3 chủng chưa xác định được loài. Mức độ đa dạng di truyền giữa các chủng tảo Chlorella vulgaris đã được làm rõ bằng chỉ thị ISSR, cho thấy sự đa dạng di truyền của các mẫu tảo trong cùng loài chưa có sự tương quan với phân bố địa lý ở các tỉnh, thành trong nghiên cứu. Xác định được môi trường nuôi thích hợp để phát triển sinh khối chủng Chlorella vulgaris CG20, bao gồm môi trường BBM hoặc HAMGAM, cùng với các điều kiện phù hợp để giảm nitrogen tổng số và chỉ số COD trong nước thải. Xác định được điều kiện tối ưu để trích ly lipid từ chủng tảo Chlorella vulgaris CG20 bằng phương pháp Taguchi, định hướng ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học. Kết quả phân tích LCA chỉ ra rằng quy trình ly trích lipid từ tảo khô có tác động đáng kể đến môi trường.