Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:220

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học" đánh giá sự đa dạng của vi sinh vật liên kết với rong Kappaphycus alvarezii theo phương pháp nuôi cấy được và không thông qua nuôi cấy metagennomic (nấm và vi khuẩn), phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất có hoạt tính sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hóa) từ chủng có hoạt tính sinh học cao.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ………………………………… NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Ở VÙNG BIỂN NHA TRANG, KHÁNH HÒA, ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG TRONG Y DƯỢC HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ………………………………… NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Ở VÙNG BIỂN NHA TRANG, KHÁNH HÒA, ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG TRONG Y DƯỢC HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Lê Mai Hương 2. PGS. TS. Phan Văn Kiệm Hà Nội - 2022
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS. Lê Mai Hương và PGS.TS. Phan Văn Kiệm. Các số liệu và kết quả thu được trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án
ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và trân trọng nhất của mình đến GS.TS. Lê Mai Hương Viện hóa học các hợp chất Thiên nhiên và PGS.TS. Phan Văn Kiệm Viện Hóa sinh biển- những người Thầy đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn khoa học và định hướng nghiên cứu trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài NĐT11.GER/16. Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, cùng các đồng nghiệp và các anh chị phòng sinh học thực nghiệm đã luôn ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em tập trung nghiên cứu và hoàn thành luận án. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa học và Công nghệ cùng các Thầy, Cô và các anh, chị chuyên viên ở Học Viện đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tạo những điều kiện tốt nhất cho em trong thời gian học tập và nghiên cứu. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy, Cô ở Viện Công nghệ sinh học đã giảng dạy, cung cấp các kiến thức mới để em hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, hỗ trợ và động viên trong suốt thời gian qua để em có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập và công tác chuyên môn. Em xin trân trọng cảm ơn! Nghiên cứu sinh
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1.1. Tổng quan về rong biển trên thế giới................................................................ 4 1.2. Tình hình rong biển ở Việt nam ....................................................................... 5 1.3 Giới thiệu về Rong Sụn ....................................................................................... 6 2.1. Vi sinh vật biển cộng sinh và các chất có hoạt tính sinh học ......................... 8 2.2. Vi sinh vật cộng sinh với rong ............................................................................. 10 2.3. Khoa học metagenomics trong nghiên cứu khu hệ VSV liên kết ................... 13 2.4. Sự đa dạng vi sinh vật cộng sinh với rong biển ...............................................18 2.5. Các chất có hoạt tính từ vi sinh vật liên kết với rong biển ........................... 22 2.5.1 Các chất có hoạt tính từ vi khuẩn cộng sinh trên rong .................................22 2.5.2 Các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm cộng sinh trên rong ....................27 2.6. Tiềm năng và triển vọng từ vi sinh vật liên kết với rong .............................. 32 PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................35 2. 1. Vật liệu và môi trường nghiên cứu ................................................................ 35 2.1.1 Thu thập mẫu, các chủng vi sinh vật kiểm định và các dòng tế bào ............35 2.1.2. Môi trường nghiên cứu. .................................................................................35 2.1.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu .....................................................................36 2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 37 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu ...........................................................................37 2.2.2. Phân lập vi khuẩn và nấm liên kết với rong biển .........................................37 2.2.3 Định danh các chủng vi khuẩn và vi nấm tiêu biểu ......................................38 2.2.3.1 Định danh các chủng vi khuẩn dựa vào trình tự gen 16S rARN ................. 38 2.2.3.2 Định danh các chủng nấm dựa vào trình tự gen vùng ITS/28S rDNA ... 39 2.2.4. Phân tích sự đa dạng của vi khuẩn và vi nấm ..............................................40 2.2.4.1. Tách chiết DNA tổng số ......................................................................... 40 2.2.4.2. Phân tích meta(taxo)genomic đối với quần thể vi khuẩn ...................... 40 2.2.4.3. Phân tích meta(taxo)genomic đối với quần thể Nấm ............................ 41 2.2.5. Hoạt tính đối kháng VSVKĐ của các chủng vi khuẩn và nấm phân lập ....42 2.2.6. Lên men, thu nhận cao chiết dịch lên men từ các chủng lựa chọn ...........43
iv 2.2.6.1 Thử hoạt tính đối kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng .... 43 2.2.6.2. Hoạt tính gây độc tế bào ....................................................................... 45 2.2.6.3. Hoạt tính chống oxy hoá........................................................................ 47 2.2.7. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng Aspergillus micronesiensis .....................................................48 2.2.7.1. Khảo sát động học của thời gian lên men ............................................. 48 2.2.7.2 Khảo sát động học của nồng độ muối .................................................... 49 2.2.7.3 Khảo sát động học của pH môi trường .................................................. 49 2.2.8. Quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình lên men................................50 2.2.9. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ ......................51 2.2.9.1 Phương pháp phân lập các hợp chất. ..................................................... 51 2.2.9.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất .......................... 52 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................54 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn và vi nấm ......................................................... 54 3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn .........................................................................54 3.1.2 Phân lập các chủng vi nấm.............................................................................55 3.2. Sàng lọc hoạt tính đối kháng VSV của các chủng phân lập .................... 56 3.2.1 Hoạt tính đối kháng VSV của các chủng vi khuẩn .......................................56 3.2.2. Hoạt tính đối kháng VSVKĐ của các chủng vi nấm ....................................58 3.2.3. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn và vi nấm tuyển chọn .................61 3.2.3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn .......................................... 61 3.2.3.2. Hình thái của chủng vi nấm lựa chọn. .................................................. 64 3.2.4. Phân loại các chủng vi khuẩn và vi nấm lựa chọn dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử ........................................................................................................65 3.2.5. Đánh giá sự đa dạng và cấu trúc của quần thể vi sinh vật trên rong sụn Kappaphycus alvarezii .......................................................................................68 3.2.5.1. Quần thể vi khuẩn .................................................................................. 68 3.2.5.2. Quần thể nấm......................................................................................... 72 3.2.6. Hoạt tính sinh học từ cặn chiết thô của các chủng ......................................75 3.2.6.1 Hoạt tính đối kháng VSV của các cặn chiết ethylacetate ....................... 75 3.2.6.2 Hoạt tính chống oxy hóa của của các cặn chiết ethylacetate ................ 80 3.2.6.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cặn chiết ethylaxetat........... 81 3.2.7. Nghiên cứu điều kiện nuôi tối ưu cho hoạt tính kháng VSVKĐ của chủng vi nấm Aspergillus micronesiensis....................................................................84 3.2.7.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men........................................................... 85 3.2.7.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối................................................................. 86
v 3.2.7.3. Ảnh hưởng của pH môi trường .............................................................. 87 3.2.8. Quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình lên men................................88 3.2.8.1 Phần thực nghiệm: .................................................................................. 88 3.2.8.2 Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm.................................................. 88 3.2.8.3 Xây dựng mô hình kế hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy trình .............. 89 3.2.8.4 Tối ưu hóa các thông số công nghệ quá trình ........................................ 92 3.3 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis .................................................................................. 94 3.3.1 Phân tách các hợp chất từ chủng Aspergillus micronesiensis .....................94 3.3.2 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân tách được từ chủng Aspergillus micronesiensis VPN1.11 ................................................................96 3.3.2.1 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) ................................. 96 3.3.2.2 Hợp chất AM8B1: Aspersiensis B (hợp chất mới) ................................. 96 3.3.2.3 Hợp chất AM8B2: Aspersiensis C (hợp chất mới) ................................. 96 Epicoccone B (5,6,7-trihydroxy-4-methyl-1(3H)isobenzofuranone).................. 97 epicoccolides B ................................................................................................... 97 epicoccolide A..................................................................................................... 97 3.4. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được từ chủng Aspergillus micronesiensis ...................................................................................................... 98 3.4.1 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) ........................................98 3.4.2. Hợp chất AM8B1: Aspersiensis B (hợp chất mới) .....................................104 3.4.3 Hợp chất AM8B2: Aspersiensis C (hợp chất mới). .....................................110 3.4.4. Hợp chất AM3A1: 4-hydroxybenzaldehyde ................................................117 3.4.5. Hợp chất AM3D: (22E,24R)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien- 3β-ol) ................................................................................................................118 3.4.6. Hợp chất AM4F1: 2-O-methylbutyrolactone II ..........................................122 3.4.7. Hợp chất AM6E1: 1,3-dihydro-4,5,6-trihydroxy-7 methylisobenzofuran .......124 3.4.9. Hợp chất AM7H: epicoccolides B ............................................................127 3.4.10. Hợp chất AM8D: epicoccolide A ...............................................................129 3.5.1. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các hợp chất. .............132 3.5.2. Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất ............................136 3.5.3 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập ...................................138 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................141 KẾT LUẬN ............................................................................................................141 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................143 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. .............144
vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Diễn giải VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định RYE Môi trường gạo và dịch Rice yeast extract medium chiết nấm men ADN Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic ITS Internal transcribed spacer Vùng được phiên mã nội bộ ATCC American Type Culture Bảo tàng giống chuẩn Hoa Collection Kỳ CFU Đơn vị hình thành khuẩn Colony forming units lạc MIC Minimum inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu concentration rDNA Ribosomal DNA AND ribosom CC Chromatography column Sắc ký cột thường COSY Phổ tương tác hai chiều Correlation spectroscopy đồng hạt nhân DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 13 C-NRM 13C-Nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance spectroscopy carbon 13 Hep-G2 Human hepatocellular Ung thư gan carcinoma LU-1 Human lung adenocarcinoma Ung thư biểu mô phổi Vero Vero cell Tế bào biểu mô thận khỉ MEME Minineal essential medium with Môi trường nuôi cấy tế bào Eagle’s salts MCF-7 Human breast carcinoma cell Tế bào ung thư vú ở người FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bò DMEM Dullbecco’s modified Môi trường nuôi cấy tế bào Minimum Essential Medium
vii 1 H-NRM 1H- Nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance spectroscopy proton HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng cao áp chromatography HSQC Heteronuclear single quantum Phổ tương tác hai chiều dị coherence hạt nhân MeOH Methanol DMSO Dimethylsulfoxide EtOAc Ethylacetate CS% Cell survival Phần trăm sống sót IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ DEPT Spectroscopy HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ tương tác đa liên kết correlation hai chiều dị nhân ESI-MS Electron spray ionzation mass Phổ khối lượng phun mù spectroscopy điện tử OTU Operational taxonomic units Đơn vị phân loại loài Shannon_H’ Diversity index Chỉ số đa dạng loài Chao-1 Species richness Độ phong phú của loài
MỤC LỤC BẢNG Bảng 1. 1 Thành phần hóa học của rong sụn[11]........................................................8 Bảng 3. 1. Đường kính vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn và vi nấm lựa chọn ...........................................................................................................................61 Bảng 3. 2.Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn .....................................................................................................................62 Bảng 3. 3. Đặc điểm hình thái hai chủng nấm lựa chọn ...........................................64 Bảng 3. 4. Chỉ số đa dạng sinh học và số OTU quan sát được thông qua phân tích metagenomic. ............................................................................................................69 Bảng 3. 5. Chỉ số đa dạng sinh học và số OTU quan sát được thông qua phân tích metagenomic. ............................................................................................................72 Bảng 3. 6. Hoạt tính đối kháng VSV của cặn chiết ethylacetate từ các chủng vi khuẩn và vi nấm ........................................................................................................79 Bảng 3. 7. Hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết ethylacetate từ các chủng vi khuẩn và vi nấm lựa chọn .........................................................................................80 Bảng 3. 8. Hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết ethylacetate từ các chủng vi khuẩn và vi nấm lựa chọn ....................................................................................................82 Bảng 3. 9. Biến mã hóa và các mức thí nghiệm........................................................90 Bảng 3. 10. Ma trận kế hoạch thực nghiệm ..............................................................90 Bảng 3. 11. Bảng kết quả phân tích phương sai của mô hình ...................................91 Bảng 3. 12. Phương trình hàm hồi quy .....................................................................92 Bảng 3. 13. Giá trị tối ưu của các yếu tố công nghệ .................................................93 Bảng 3. 14. Giá trị dự đoán và giá trị thực nghiệm của hàm mục tiêu tại điều kiện tối ưu .........................................................................................................................93 Bảng 3. 15. Kết quả tối ưu hóa quá trình sử dụng phần mềm design expert 7.0 ......93 Bảng 3. 16. Thông số vật lý và dữ liệu của 7 hợp chất từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis ...........................................................................................................97 Bảng 3. 17. Số liệu phổ NMR của AM8A1 và hợp chất tham khảo ......................100 Bảng 3. 18. Số liệu phổ NMR của AM8B1 và hợp chất tham khảo .......................105 Bảng 3. 19. Số liệu phổ NMR của AM8B2 và hợp chất tham khảo.......................111 Bảng 3. 20. Số liệu phổ NMR của AM3A1 ............................................................118 Bảng 3. 21. Số liệu phổ NMR của AM3D và hợp chất tham khảo ........................121 Bảng 3. 22. Số liệu phổ NMR của AM4F1 và hợp chất tham khảo .......................123 Bảng 3. 23. Số liệu phổ NMR của AM6E1 và hợp chất tham khảo.......................125 Bảng 3. 24. Số liệu phổ NMR của AM6E2 và hợp chất tham khảo.......................126 Bảng 3. 25. Số liệu phổ NMR của AM7H và hợp chất tham khảo ........................129 Bảng 3. 26. Số liệu phổ NMR của AM8D và hợp chất tham khảo ........................131 Bảng 3. 27. Kết quả kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập được từ chủng Aspergillus micronesiensis ...........................................................................135 Bảng 3. 28. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ chủng Aspergillus micronesiensis.............................................................................137 Bảng 3. 29. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập chủng Aspergillus micronesiensis .........................................................................................................138 Bảng 3. 30. Kết quả giá trị IC50 của một số hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào .139
MỤC LỤC HÌNH Hình 1. 1: Hình ảnh hai loài rong sụn chính ở nước ta .......................................................... 7 Hình 1. 2: Mối tương tác giữa vi khuẩn và rong biển nói riêng và vi sinh vật cộng sinh với rong biển nói chung [35]. ..................................................................................................... 11 Hình 1. 3: Sự đa dạng vi sinh vật trên bề mặt rong biển [41] .............................................. 20 Hình 1. 4: Các yếu tố ảnh hưởng đến sự xâm nhập của vi khuẩn trên bề mặt rong [65]..... 23 Hình 1. 5: Tỷ lệ các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm liên kết với các loại rong khác nhau [89] ..................................................................................................................... 28 Hình 1. 6: Một vài hợp chất tiêu biểu có hoạt tính sinh học phân lập từ chủng nấm Aspergillus cộng sinh với rong[96, 97]................................................................................ 30 Hình 3. 1: Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập được từ rong Kappaphycus alvarezii ... 54 Hình 3. 2: Các nhóm màu sắc khuẩn ty của chủng vi nấm phân lập từ 3 mẫu rong. ........... 55 Hình 3. 3: Tỷ lệ phần trăm các chủng sinh chất có hoạt tính đối kháng các VSVKĐ......... 57 Hình 3. 4. Số lượng vi khuẩn phân lập được có khả năng đối kháng với từng chủng VSVKĐ. ............................................................................................................................... 57 Hình 3. 5. Số lượng các chủng vi nấm sinh chất có hoạt tính đối kháng các VSVKĐ ....... 59 Hình 3. 6. Cây phát sinh loài dựa trên trình tự 16S rRNA của các chủng VP02.3, VP02.11 thuộc chi Bacillus (a ) và chủng VP03.12 thuộc chi Brevibacillus và chủng VP03.6 thuộc chi Pseudomonas (b), dựa trên ITS neighbor-Joining tree.................................................. 67 Hình 3. 7. Cây phát sinh loài dựa trên trình tự ITS của chủng VPN1.11 và VPN1.5 dựa trên cây phân loại ITS Neighbor – Joining tree. .................................................................. 68 Hình 3. 8. Phân tích thành phần chính (PCA) thực hiện trên tỉ lệ tương đối các chủng vi khuẩn. ................................................................................................................................... 70 Hình 3. 9. Cấu trúc quần thể vi khuẩn ở mức độ ngành ...................................................... 70 Hình 3. 10. Tỉ lệ tương đối của một số chi vi khuẩn tiêu biểu ở các mẫu rong ................... 71 Hình 3. 11. Phân tích thành phần chính (PCA). .................................................................. 73 Hình 3. 12. Cấu trúc quần thể nấm ở mức độ ngành ........................................................... 74 Hình 3. 13. Tỉ lệ tương đối của một số chi tiêu biểu ở các mẫu rong Vân phong, Việt Nam qua phân tích metabarcoding ............................................................................................... 75 Hình 3. 14. Ảnh hưởng của thời gian lên men chủng Aspergillus micronesiensis đến hàm lượng cao chiết ethylacetate thu được ................................................................................. 86 Hình 3. 15. Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường đến hàm lượng cao chiết ethylacetate thu được ........................................................................................................... 87 Hình 3. 16. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hàm lượng cao chiết ethylacetate thu được từ chủng Aspergillus micronesiensis ................................................................................... 88 Hình 3. 17. Bề mặt đáp ứng thể hiện tương tác đôi của các yếu tố công nghệ lên hàm mục tiêu Y.................................................................................................................................... 92 Hình 4. 1. Cấu trúc hóa học của hợp chất AM8A1 và hợp chất tham khảo Eleganketal A 98 Hình 4. 2. Các tương tác HMBC chính của hợp chất Aspersiensis A ................................ 99 Hình 4. 3. Phổ CD và ECD của Aspersiensis A với các cấu hình tuyệt đối Aspersiensis Aa, Aspersiensis Ab, Aspersiensis Ac, Aspersiensis Ad. ................................................. 101 Hình 4. 4. Phổ HR-ESI-MS (negative) của hợp chất Aspersiensis A ............................... 102 Hình 4. 5. Phổ 13C-NMR của hợp chất Aspersiensis A .................................................... 103 Hình 4. 6. Phổ HMBC của hợp chất Aspersiensis A ........................................................ 103
Hình 4. 7. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM8B1 ........................................................................................................................................... 104 Hình 4. 8. Phổ ECD của hợp chất Aspersiensis B và TD-DFT của Aspersiensis B ........ 106 Hình 4. 9. Phổ HR-ESI-MS (negative) của hợp chất Aspersiensis B. .............................. 107 Hình 4. 10. Phổ 1H-NMR của hợp chất Aspersiensis B ................................................... 108 Hình 4. 11. Phổ 13C-NMR của hợp chất Aspersiensis B .................................................. 108 Hình 4. 12. Phổ HSQC của hợp chất Aspersiensis B ....................................................... 109 Hình 4. 13. Phổ HMBC của hợp chất Aspersiensis B ...................................................... 109 Hình 4. 14. Phổ NOESY của hợp chất Aspersiensis B ..................................................... 110 Hình 4. 15. Các tương tác HMBC chính của hợp chất AM8B2 ........................................ 110 Hình 4. 16. Phổ ECD của hợp chất Aspersiensis C và TD-DFT của Aspersiensis B với các cấu hình tuyệt đối Aspersiensis Ba, Aspersiensis Bb, Aspersiensis Bc, Aspersiensis Bd ........................................................................................................................................... 113 Hình 4. 17. Phổ HR-ESI-MS (negative) của hợp chất Aspersiensis C. ............................ 114 Hình 4. 18. Phổ 1H-NMR của hợp chất Aspersiensis C ................................................... 115 Hình 4. 19. Phổ 13C-NMR của hợp chất Aspersiensis C .................................................. 115 Hình 4. 20. Phổ HSQC của hợp chất Aspersiensis C ....................................................... 116 Hình 4. 21. Phổ HMBC của hợp chất Aspersiensis C ...................................................... 116 Hình 4. 22. Phổ NOESY của hợp chất Aspersiensis C..................................................... 117 Hình 4. 23. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM3A1 ........................................................................................................................................... 117 Hình 4. 24. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM3D. ........................................................................................................................................... 118 Hình 4. 25. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM4F1 ........................................................................................................................................... 122 Hình 4. 26. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM6E1. ........................................................................................................................................... 124 Hình 4. 27. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM6E2 ........................................................................................................................................... 126 Hình 4. 28. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM7H ........................................................................................................................................... 127 Hình 4. 29. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM8D ........................................................................................................................................... 130
1 MỞ ĐẦU Rong biển là nơi cư trú của nhiều loài sinh vật như vi khuẩn, vi nấm, vi tảo, ấu trùng giáp xác, virus, trong đó vi khuẩn chiếm chủ yếu, với mật độ 102-107 CFU/cm2 mẫu, với vi nấm khoảng 104 CFU/cm2. Vi sinh vật có thể sống trên bề mặt rong (vsv bám), hoặc sống trong các mô rong (VSV nội sinh). Các vi sinh vật đó có vai trò khác nhau và có liên quan đến sức khỏe cây rong. Chúng có thể hỗ sinh, hoại sinh, gây bệnh hoặc ôn hòa. Bề mặt rong là nơi có tính cạnh tranh cao (không gian, thức ăn), khắc nghiệt (do vsv tiết chất kháng lại vi sinh hoặc do cây chủ tự sản xuất chất tiêu diệt vsv có hại) nên các vi sinh trên rong có tính đặc thù nhất định và có cơ chế đặc biệt mới tồn tại được. Sự đa dạng vsv trên một loài rong nhất định phụ thuộc vào nhiều yếu tố (mùa trong năm, nhiệt độ, môi trường biển ...). Như vậy có thể thấy rong là nguồn để phân lập nhiều vi sinh vật mới. Mối quan hệ giữa vi sinh vật và cây rong chủ đã được xác định. Một loạt các đặc điểm vật lý, hóa học, sinh học trên bề mặt rong được cho là có vai trò quan trọng đến số lượng cũng như thành phần vi sinh vật trên rong. Các tác nhân như dịch tiết của rong, oxi từ rong, CO2, dịch tiết vi sinh vật, có tính chất quyết định đến số lượng quần thể sống trên rong. Rong cung cấp oxi và các chất hữu cơ, cho vi sinh vật sinh sống. Trong khi đó, vi sinh vật cung cấp trở lại CO2, chất khoáng và các chất trao đổi thứ cấp có khả năng bảo vệ rong khỏi các sinh vật gây thối, gây bệnh cho rong, các chất kích thích sinh trưởng (auxin...). Như một số vi sinh vật cố định đạm (Agrobacterium và Rhizobium) cung cấp nguồn nitơ cho rong chủ. Vi sinh vật sản xuất chất xua đuổi các động vật ăn rong và các enzyme (peroxidase, catalase) làm trung hòa các gốc tự do (ROS) do rong tạo ra, làm giảm thiệt hại cho rong. Các chất hữu cơ, chất trao đổi thứ cấp ở rong cũng có tác dụng lựa chọn các loài vsv nhất định sống trên chúng, đảm bảo lợi ích cho rong. Một số vi khuẩn oxi hóa amonium được phát hiện trên rong với số lượng tương đối nhiều, có vai trò giải độc nitrat cho rong. Như vậy có thể thấy mối quan hệ hỗ sinh giữa rong và vi sinh vật thể hiện ở chỗ rong cung cấp các chất dinh dưỡng hữu cơ cho vi khuẩn có lợi, mặt khác, vi khuẩn sản xuất chất kháng sinh tiêu diệt hoặc làm giảm sự cố định của các vi khuẩn có hại, gây bệnh cho rong chủ. Theo nhiều công bố, có từ 30-50% vi khuẩn trên rong có khả năng sản xuất chất đối kháng vi sinh vật, tỷ lệ này cao hơn rất nhiều so với tỉ lệ vi sinh vật sống tự do trong nước biển hoặc bùn đáy (
2 Ngoài vi khuẩn sống trên rong, nấm men và nấm mốc cũng thường được phân lập và nghiên cứu. Tuy mật độ nấm được cho là thấp hơn so với vi khuẩn, nhưng chúng cũng thể hiện sự đa dạng cao về loài. Việt Nam là nước nhiệt đới, có nguồn tài nguyên sinh vật, đặc biệt vi sinh vật rất phong phú và đa dạng. Để sinh tồn, vi sinh vật có nhiều cơ chế sinh lý, sinh hóa khác nhau nhằm thích nghi với môi trường sống đặc biệt và khắc nghiệt. Sự cạnh tranh bằng việc sản xuất các chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt hợp chất đối kháng lại hoặc xua đuổi các vi sinh vật khác được coi là phổ biến và hiệu quả. Ở nước ta, chưa có nhiều các báo cáo, công bố nghiên cứu về hệ sinh thái vi sinh vật vùng trồng rong, trên cây rong. Việc nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá các chủng vi sinh vật sống bám trên rong, từ đó đưa ra các biện pháp cần thiết và hữu ích nhằm bảo tồn phát triển hệ sinh thái rong biển bền vững, hiệu quả… Xuất phát từ thực tiễn trên, nhằm khảo sát đặc điểm, sự đa dạng các vi sinh vật và hoạt tính sinh học từ các vi sinh vật sống bám trên rong, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha trang, Khánh hòa, định hướng sử dụng trong y dược học”. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài: Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá sự đa dạng của vi sinh vật liên kết với rong Kappaphycus alvarezii theo phương pháp nuôi cấy được và không thông qua nuôi cấy metagennomic (nấm và vi khuẩn), phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất có hoạt tính sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hóa) từ chủng có hoạt tính sinh học cao. Nội dung nghiên cứu. 1. Phân lập, sàng lọc một số chủng vi khuẩn và vi nấm có hoạt tính kháng sinh liên kết với rong Kappaphycus alvarezii ở vịnh Vân Phong Khánh Hòa. 2. Nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn và vi nấm trên rong biển bằng phương pháp sinh học phân tử (16S với vi khuẩn 18S với vi nấm) trên các mẫu thu thập. 3. Lên men, đánh giá hoạt tính sinh học các chủng vi khuẩn và vi nấm sống liên kết với rong có hoạt tính sinh học tiêu biểu ở vịnh Vân Phong, Khánh Hòa. 4. Nghiên cứu điều kiện lên men rắn thích hợp cho chủng vi nấm tiêu biểu tạo ra các chất có hoạt tính sinh học cao, tối ưu hóa quá trình lên men. 5. Phân lập, tinh sạch, xác định cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học
3 của các hợp chất phân lập. Những đóng góp mới của luận án: 1. Đây là công trình đầu tiên kết hợp sinh học phân tử hiện đại metagenomic với phương pháp nuôi cấy truyền thống để phân tích, so sánh và đánh giá sự đa dạng cũng như chức năng của VSV lên cây rong chủ (Kappaphycus alvarezii) ở Việt Nam. 2. Đã đánh giá được sự đa dạng của quần thể vi khuẩn và vi nấm trên loài rong Kappaphycus alvarezii dựa vào phương pháp giải trình tự gen và phân tích metagenomics. 3. Đã tách chiết và xác định được công thức hóa học của 10 hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus micronesiensis, có hoạt tính kháng sinh, hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa. Trong 10 hợp chất phân lập được có 3 hợp chất mới là; Aspersiensis A (AM8A1): Aspersiensis B (AM8B1): Aspersiensis C (AM8B2) và 07 hợp chất AM3A1 (4-hydroxybenzaldehyde), AM3D: (22E,24R)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22- dien-3β-ol), AM4F1: 2-O-methylbutyrolactone II, AM6E1: 1,3-dihydro-4,5,6- trihydroxy-7-methylisobenzofuran, AM6E2: Epicoccone B (5,6,7-trihydroxy-4-methyl- 1(3H)-isobenzofuranone), AM7H: epicoccolides B, AM8D: epicoccolide A. Các hợp chất này là lần đầu tiên được phân lập từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis liên kết với rong Kapapphycus alvarezii.
4 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về rong biển trên thế giới. Rong biển là đối tượng nuôi trồng thủy sản quan trọng được trồng rộng rãi trên thế giới. Theo tài liệu của FAO (2014), rong biển được trồng ở 33 quốc gia và lục địa trên thế giới. Các quốc gia trồng rong biển trọng điểm của thế giới chủ yếu tập trung ở châu Á bao gồm Trung Quốc, Indonesia, Philippine, Malaysia, Hàn Quốc, Nhật Bản, Tanzania và Solomon. Đặc biệt làTrung Quốc và Indonesia là hai quốc gia trồng rong biển nhiều nhất, chiếm 81,4% tổng sản lượng rong biển thế giới [2]. Sản lượng rong biển nuôi trồng thế giới trên liên tục tăng, đặc biệt là những thập kỷ gần đây. Năm 1990, sản lượng rong biển nuôi trồng cả thế giới khoảng 3,76 triệu tấn tươi. Đến năm 2000, sản lượng này là 9,3 triệu tấn tươi và tăng lên 19 triệu tấn vào năm 2010. Như vậy, chỉ trong vòng 2 thập kỷ (1990-2010), sản lượng rong biển nuôi trồng trên thế giới đã tăng khoảng 5 lần. Gần đây, năm 2012, sản lượng rong biển trồng trên thế giới là 23,8 triệu tấn tươi. Rong biển khai thác tự nhiên có sản lượng là 1,1 triệu tấn tươi tương đương 4,6% sản lượng rong trồng thương phẩm (FAO, 2014). Trong những năm tới, sản lượng rong biển nuôi trồng dự báo sẽ tiếp tục tăng lên để đáp ứng nhu cầu nguyên liệu cho phát triển công nghiệp sản xuất hàng hóa và cả thiện chất lượng môi trường [3, 4]. Bên cạnh các nước có nghề trồng rong phát triển như Trung Quốc, Nhật Bản, Philippin, Hàn quốc, Triều Tiên, Chile, Malaysia, Tanzania, Indonesia, Kiribati, hiện nay nghề trồng rong đã phát triển tại hơn 20 nước khác. Sản lượng rong hàng năm trên thế giới là hơn 140.000 tấn khô (trong đó rong sụn Kappaphycus và rong câu Gracilaria là chủ yếu) [5]. Mặc dù rong biển thế giới rất đa dạng (có tới 10.000 loài đã được phân loại (www.algaebase.org), nhưng số rong biển có thể nuôi trồng khá khiêm tốn. Theo Titlyanov và Titlyanova (2010), có 17 chi rong biển đang được nuôi trồng trên thế giới bao gồm: Agardhiella, Eucheuma, Gelidium, Gigartina, Gracilaria, Hydropuntia, Hypnea, Kappaphycus, Meristotheca, Porphyra (ngành rong đỏ- Rhodophyta); Saccharina, Laminaria, Undaria, Cladosiphon (ngành rong nâu- Phaeophyta), Monostroma, Ulva, và Caulerpa (ngành rong lục- Chlorophyta). Trong đó, các chi Agardhiella, Gelidium, Gigartina, Porphyra, Saccharina, Laminaria, Undaria, Monostroma, và Ulva được trồng chủ yếu ở vùng ôn đới, Eucheuma, Gracilaria,
5 Hydropuntia, Hypnea, Kappaphycus, Cladosiphon, và Caulerpa được trồng chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Theo thống kê của FAO (2014), năm nhóm rong biển trồng phổ biến nhất hiện nay là rong sụn Kappaphycus alvarezii và Eucheuma spp., rong bẹ Nhật Bản (Laminaria japonica), rong câu (Gracillaria spp.), rong bẹ Udaria pinatifida và rong mứt (Porphyra spp.). Trong các nhóm này, nhóm rong sụn có sản lượng trồng nhiều nhất (khoảng 8,2 triệu tấn tươi chiếm 34,5% tổng sản lượng rong biển toàn cầu) sau đó là rong bẹ Nhật Bản và rong câu với sản lượng lần lượt là 5,8 và 2,85 triệu tấn tương đương 24,4% và 12% tổng sản lượng rong biển toàn cầu 1.2. Tình hình rong biển ở Việt nam Với chiều dài hơn 3.260 km, diện tích hơn một triệu km2, vùng biển nước ta được đánh giá là một trong 16 trung tâm đa dạng sinh học cao của thế giới. Vì vậy, công tác điều tra, nghiên cứu môi trường và tài nguyên sinh vật biển là vấn đề cần được quan tâm nhiều. Việt Nam có lợi thế và tiềm năng to lớn (gần 100 loài rong kinh tế phân bố và diện tích trồng rong tiềm năng khoảng 900.000 ha) để phát triển rong biển thành ngành sản xuất chủ lực trong tương lai. Hiện nay, 07 loài rong kinh tế (Rong nho - Caulerpa lentillifera, Rong câu chỉ vàng - Gracilaria tenuistipitata, Rong câu thắt - Gracilaria firma, Rong câu cước - Gracilariopsis bailinae, Rong sụn - Kappaphycus alvarezii, Rong bắp sú - Kappaphycus striatus, Rong sụn gai - Eucheuma denticulatum) đang được trồng phổ biến ở Việt Nam. [6, 7, 8]. Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản năm 2022, hiện diện tích tiềm năng trồng rong sụn cả nước khoảng 900 nghìn ha (tương đương 600 - 700 nghìn tấn rong khô/năm). Trong số hơn 800 loài rong biển, 90 loài có giá trị kinh tế. Năm 2020, diện tích trồng rong biển đạt khoảng 15.000 ha, sản lượng 135.000 tấn. Trong đó, lợi nhuận rong nho khoảng 150 triệu/ha và rong sụn khoảng 60 triệu/ha. Rong biển được nuôi trồng tập trung ở các vùng ven biển gồm Bắc Bộ gần 6.600 ha, Bắc Trung Bộ hơn 2.000, Nam Trung Bộ 1.400ha, Đồng bằng sông Cửu Long 100ha. Tại Việt Nam đã xác định được 833 loài rong biển với trữ lượng tự nhiên 80 - 100 tỷ tấn, thuộc 4 ngành, gồm ngành rong Đỏ (415 loài và biến loài), ngành rong Nâu (147 loài và biến loài), ngành rong Lục (183 loài và biến loài) và ngành rong Lam (88 loài và biến loài) [9].
6 1.3 Giới thiệu về Rong Sụn Rong Sụn tên thương mại là Cottonii, bao gồm hai loài chính là: Kappaphycus alvarezii và Kappaphycus striatum, nguyên liệu chính cho chế biến kappa- carrageenan được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực kinh tế như chế biến thực phẩm, y dược, mỹ phẩm, đệt may,...[10]. Đặc điểm sinh học của Rong Sụn Rong Sụn là loại rong biển nhiệt đới có một số đặc điểm sinh học chính như Sau: Hình thái cấu tạo Rong Sụn có thân dạng trụ tròn đường kính có thể đạt 20 mm, nhiều trục chính, mọc lên từ bàn bám dạng đĩa. Những trục chính mới có thể mọc từ cùng gốc với trục chính ban đầu hay ngay từ trên trục chính, ở dưới phần gốc của trục chính ban đầu. Nhánh dạng trụ tròn hình thành ngay gần gốc thân, lúc đầu chia không quy luật hoặc một bên, sau đó mọc và uốn cong theo hướng ánh sáng và thân chia nhánh phát triển thành bụi rậm, thể chất trơn nhớt keo sụn, có màu nâu xanh [11]. Loài Kappaphycus alvarezii. Rong thô, đòn như sụn. Thân rong hình trụ, có màu xanh đến màu nâu đỏ, mọc đứng, cao 20-60cm, với đường kính của thân chính và nhánh 1-2cm. Phân nhánh thưa. Khoảng cách giữa hai lần phân nhánh từ 4-10cm. Nhánh chót hơi cong, dài 5- 15cm, thon dần về ngọn. Khi mọc ở vùng nước có đòng chảy tốt cây rong phát triển dài có thể tới 2m/cá thê, trọng lượng cá thẻ từ 20-56 kg/cá thể. Nhánh thường có đường kính lớn (trung bình 2,5mm), thon dần về phía đỉnh nhánh. Thường không có hoặc ít nhánh thú cấp. Nhánh cong, phình rộng, thon dần và kéo dài (hình 1A) [11]. Loài Kappaphycus striatum. Rong thô, sằn sùi, cao 20-25cm, màu nâu đen đến nâu đỏ. Phân nhánh dày,the kiêu đối nhau, mọc vòng, chạc hai không đều. Khoảng cách giữa hai lần phân nhắn ngắn từ 1-3cm, nhánh chót ngắn, đầu cùn hoặc tròn (hình 1B). Nhìn trên bề mặt cắt ngang thân: Kích thước tế bào từ lớp vỏ vào lớp lõi tăng. Lớp vỏ bao gồm 2-3 lớp tế bào chứa sắc tố, hình bầu dục, đường kính 7-10um. Lớp nhu mô ngoài gồm 7-10 lớp tế bào hình bầu dục hoặc hình cầu đường kính 124 250um, vách dày 10-15uùm. Lớp nhụ mô lõi bao gồm những tế bào lớn xen kế với những sợi trục, đường kính 25- 30um, với vách dày 10-15pnm [11].
7 A B Hình 1. 1: Hình ảnh hai loài rong sụn chính ở nước ta Phân bố, sinh học Trong tự nhiên Rong sụn mọc bám trên các vật bám cứng có chất vôi (trên rạn san hô chết hoặc trên đá), phân bố chủ yếu ở phần trên của vùng dưới triều (ngay bên dưới của mực chiều thấp), nơi nước chảy nhẹ đến vừa phải. Phân bố: Rong Sụn là loại rong biển nhiệt đới, trong tự nhiên nó phân bố chủ yếu ở vùng biển nhiệt đới trong khu vực Châu Á và Tây Thái Bình Dương, đặc biệt phô biến ở vùng biên một số nước Đông Nam Á (Philippines, Indonesia, Maylaysia...) Là loại rong hẹp muối, chỉ sinh trưởng và phát triển tốt ở độ mặn 28-34 oC. Độ mặn dưới 20 ‰ kéo dài nhiều ngày, rong ngừng phát triển và chết. Độ mặn cao 35-40 ‰ sinh trưởng của rong bị ức chế. Nhiệt độ nước thích hợp nhất cho rong sinh trưởng và phát triển là 25-30 °C. Khi nhiệt độ nước cao hơn 31 oC, rong sẽ tăng trưởng chậm, ở nhiệt độ thấp hơn 15 °C rong sẽ bị chết [11]. Kể từ khi du nhập vào Việt Nam năm 1993, rong sụn Kappaphycus alvarezii thích hợp với khí hậu nhiệt đới Việt Nam, đặc biệt là ở các tỉnh miền Trung và hiện nay được nuôi trồng tại Đà Nẵng, Quang Nam, Ninh Binh, Phú Yên, Khanh Hòa Kiên Giang …Rong có thể được trồng quanh năm. Thành phần hóa học cúa Rong Sụn Thành phần hoá học của Rong Sụn luôn thay đôi phụ thuộc trạng thái sinh lý, thị gian sinh trưởng, điều kiện sống (cường độ bức xạ, thành phần hoá học của môi
8 trường). Trong Rong Sụn hàm lượng nước chiếm 77-91% còn lại vài phần trăm chất khô. Trong chất khô chứa chủ yếu là gluxit, protein, chất khoáng, lipit, sắc tố, các enzyme ...[12, 13]. Bảng 1. 1 Thành phần hóa học của rong sụn[11] Thành phần hóa học Tỉ trọng khối lượng (% chất khô) Gluxit 40 – 45% Chất khoáng 20% Protein 2 – 22% Thành phần hóa học khác 5 – 13% Ứng dụng của Rong Sụn. Rong Sụn được ứng dụng để sản xuất một số sản phẩm trong lĩnh vực thực phẩm. Carrageenan tự nhiên được tách chiết từ Rong Sụn có bốn đặc điểm chính như: là một chất đông đặc; là một chất nhũ tương để giúp cho các dung địch ở trạng thái hỗn hợp đồng nhất với nhau mà không bị tách riêng rẽ; một chất làm thay đôi kết cầu của sản phẩm bởi việc tạo ra các chất đông đặc hoặc dai; một chất giúp làm ồn định các tinh thể để ngăn chặn đường hoặc nước đá khỏi kết tỉnh lại. Do vậy mà carrageenan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, dược phẩm, công nghệ sữa, y dược học, trong xử lý môi trường nuôi tôm cá và trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác [15, 16, 17, 18, 19, 20]. 2.1. Vi sinh vật biển cộng sinh và các chất có hoạt tính sinh học Nghiên cứu về các vi sinh vật cộng sinh là một lĩnh vực phát triển nhanh chóng như theo một số báo cáo gần đây cho thấy rằng, một số chất chuyển hóa thu được từ rong, san hô, bọt biển và động vật không xương sống có thể được sản xuất bởi các vi sinh vật cộng sinh với chúng [21, 22, 23]. Các vi khuẩn cộng sinh được biết đến với rất nhiều các hoạt tính sinh học đa dạng bao gồm cả những yếu tố chức năng [23]. Gần đây, Baker và cộng sự. (2009) đã thực hiện một nghiên cứu nhằm phân lập và xác định sự đa dạng của chủng nấm từ loài bọt biển H. simulans. Họ đã sử dụng kết hợp phương pháp nuôi cấy truyền thống và kỹ thuật hiện đại để định danh và xác định các hoạt tính kháng sinh, kết quả họ đã được phân lập được 19 kiểu gen khác nhau thuộc về các chi Agaricomycotina, Mucoromycotina, Saccharomycotina, và Pezizomycotina; một số chủng này cho thấy sự ức chế một số vi khuẩn là Escherichia coli, Bacillus sp, Staphylococcus aureus, và Candida glabrata [24]. Vi khuẩn liên kết